黃連解毒湯對脂多糖誘導的小鼠急性腎損傷治療作用及機制

熊致立，王 瑞，朱曉云，付彤飛，李成銀，吳俊松，王林群，沈銀峰，巴元明*

1. 湖北中醫藥大學中醫臨床學院，湖北 武漢 430000

2. 湖北省中醫院，湖北中醫藥大學附屬醫院，湖北省中醫藥研究院，湖北 武漢 430000

膿毒癥是一種危及生命的臨床綜合征，是危重患者死亡的主要原因，而腎臟是最易受影響的器官之一。膿毒癥患者的急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）發生率為54%[1]。膿毒血癥通常由細菌感染引起，進而產生毒素進入血液循環并釋放多種炎癥介質，這些炎癥介質在一定程度上會擴張血管、增加血管通透性，進而可能影響腎小球的濾過和腎小管的功能[2]。相關研究認為缺血再灌注損傷、氧化應激、炎癥反應等均可以導致腎組織內細胞凋亡的增加[3]。合理控制細胞凋亡成為有效干預AKI一種重要的治療策略。中醫藥在保護腎功能、緩解炎癥方面有巨大潛力。但當前針對膿毒癥相關性AKI 的中醫藥研究存在機制不明確等問題。黃連解毒湯最早記載于東晉葛洪《肘后備急方》[4]，為清熱劑代表方，并且在臨床應用中取得了一定的療效[5]。本研究考察了黃連解毒湯治療膿毒癥相關性AKI的作用及潛在機制，為研究治療膿毒癥相關性AKI的藥物提供新的策略。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性C57BL/6 小鼠，6 周齡，體質量（20±2）g，購自河南省斯克貝斯生物科技股份有限公司，許可證號SCXK（豫）2020-0005。小鼠飼養于12 h 光照/黑暗循環的環境中，溫度（23±2）℃，相對濕度（55±5）%，適應性喂養1 周，自由進食飲水。動物實驗經湖北中醫藥大學倫理委員會批準（批準號HUCMS-202302007）。

1.2 藥材

黃連解毒湯及其制備工藝源于《肘后備急方》，由黃連9 g、黃芩6 g、黃柏6 g、梔子9 g 4 味藥組成，黃連（批號 2323080122）和黃芩（批號2323090105）購自湖北辰美中藥有限公司，黃柏（批號232309025）購自天濟藥業有限公司，梔子（批號230801）購自湖北潤康藥業有限公司。經湖北中醫藥大學生藥研究院杜鴻志副教授分別鑒定為毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch. 的干燥根莖、唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi. 的干燥根、蕓香科植物黃檗PhellodendronamurenseRupr.的干燥樹皮、茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis. 的干燥果實。

1.3 藥品與試劑

肌酐比色測定試劑盒（批號E-BC-K188-M）、尿素氮比色測定試劑盒（批號E-BC-K183-M）均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（批號P0010）購自武漢碧云天生物技術研究所；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，批號GC205009）、AB-PAS 染液套裝（批號G1049）、蘇木素-伊紅（HE）染液套裝（批號GB23303）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，批號GC305010）、組化試劑盒 DAB 顯色劑（批號G1212）、重組β-actin 抗體（批號GB15003-100）、抗兔蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抗體（批號GB111114）、HRP 標記的山羊抗小鼠二抗（批號GB23301）、HRP 標記的山羊抗兔二抗（批號GB23303）均購自武漢塞維爾生物科技公司；B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）單克隆抗體（批號13-8800）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）單克隆抗體（批號MA5-14003）、色譜純甲醇均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司； 磷脂酰肌醇 3- 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）單克隆抗體（批號60225-1-Ig）購自武漢三鷹生物科技有限公司；p-Akt 抗體（批號AF0832）、磷酸酯酶與張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）抗體（批號af6351）均購自美國親科生物科技公司；p-PI3K 抗體（批號BS-5570R）購自北京博奧森生物技術有限公司；色譜純甲酸購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；去離子水由湖北中醫藥大學科技中心提供。

1.4 儀器

D3024R 型臺式高速冷凍離心機（北京大龍公司）；Epoch 酶標檢測儀（美國Bio-Tek 公司）；垂直電泳儀、轉印電泳儀（武漢塞維爾生物科技公司）；RM2016 型病理切片機（德國Leica 公司）；UltiMate 3000 RS 型色譜儀、Q Exactive 高分辨質譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

2 方法

2.1 黃連解毒湯的制備及成分分析

2.1.1 黃連解毒湯的制備 按處方比例稱取黃連、黃芩、黃柏、梔子，加6 倍量水，浸泡30 min，煎煮45 min；再加6 倍量水，煎煮30 min，合并濾液，減壓濃縮（60 ℃）至相對密度1.08～1.10 的浸膏，噴霧干燥得干膏粉。采用真空干燥法測定其出膏率為17.61%，并將干膏于-20 ℃保存。

2.1.2 樣品處理 取黃連解毒湯水煎液100 μL，加入300 μL 甲醇，渦旋10 min。4 ℃、20 000×g離心10 min，取上清液上機分析。

2.1.3 色譜條件 Welch AQ-C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫：1～5 min，98%～80% A；5～10 min，80%～50% A；10～15 min，50%～20% A；15～20 min，20%～5% A；20～27 min，5% A；27～28 min，5%～98% A；28～30 min，98% A。柱溫35 ℃；自動進樣器溫度10.0 ℃；進樣體積5.00 μL；體積流量0.30 mL/min。

2.1.4 質譜條件 電噴霧離子源（ESI）；正負離子切換掃描；檢測方式為Full MS/dd-MS2，Full MS 分辨率為70 000，dd-MS2分辨率為17 500；掃描范圍m/z100～1 500；電噴霧電壓為±3.2 kV；毛細管溫度 300 ℃；碰撞氣為高純氬氣（體積分數≥99.999%）；碰撞能為30、40、60 eV；鞘氣為氮氣（體積分數≥99.999%），體積流量800 L/h；輔助氣為氮氣（體積分數≥99.999%），體積流量300 L/h，溫度350 ℃；數據采集時間30.0 min。

2.2 動物分組、造模及給藥

將小鼠隨機分為對照組、模型組和黃連解毒湯低、中、高劑量（50、100、150 mg/kg）[6]組，每組8 只。各給藥組ig 相應藥物，對照組和模型組ig 等體積生理鹽水，1 次/d，連續3 d。末次給藥2 h 后，模型組和各給藥組ip LPS（10 mg/kg），對照組ip 等體積生理鹽水。造模24 h 后，所有小鼠安樂死，收集腎臟和血清。將小鼠左腎固定于4%多聚甲醛溶液中，乙醇洗脫后，石蠟包埋，并將剩余樣品儲存在-80 ℃下用于后續實驗。

2.3 試劑盒檢測血清中肌酐和尿素氮水平

按照試劑盒說明書分別測定各組小鼠血清中肌酐和尿素氮水平。

2.4 HE 和PAS 染色檢測腎組織病理變化

各組腎組織石蠟切片放入環保型脫蠟液后，自來水洗，HE 或PAS 染色，中性樹膠封片固定，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.5 免疫組化檢測腎組織Bax 和Bcl-2 表達

取各組腎組織石蠟切片，根據免疫組化試劑盒說明書，采用SP 兩步法進行抗原修復，封閉內源性過氧化物酶，孵育抗體，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 TUNEL 檢測腎組織細胞凋亡情況

取各組腎組織石蠟切片，根據TUNEL 試劑盒說明書進行標記染色，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.7 Western blotting 檢測腎組織PTEN、PI3K、p-PI3K、Akt 和p-Akt 蛋白表達

取各組腎組織，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液提取蛋白，使用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜，于5%脫脂牛奶中封閉1 h，分別加入一抗，4 ℃孵育過夜；TBST 洗滌后，加入二抗，孵育1.5 h，加入化學發光試劑顯影，并分析條帶灰度值。

2.8 統計學分析

利用GraphPad Prism 9.0 軟件對數據進行統計分析，數據用x±s表示。數據滿足正態分布且方差齊時采用單因素方差分析。

3 結果

3.1 黃連解毒湯主要成分分析

HPLC-MS 采集的數據通過CD 3.3（Compound Discoverer 3.3）完成數據初步整理后進行數據庫（mzCloud）檢索比對。HPLC/MS 總離子流圖見圖1，鑒定出的31 個主要活性成分見表1。黃連解毒湯主要成分有咖啡酸、小檗堿以及黃芩素等。

圖1 負、正離子模式下的總離子流圖Fig.1 Total ion flow chart under negative and positive ion modes

3.2 黃連解毒湯對膿毒癥相關性AKI 小鼠血清中尿素氮和肌酐水平的影響

如圖2 所示，與對照組比較，模型組小鼠血清尿素氮和血肌酐水平均明顯升高（P＜0.001）；與模型組比較，各給藥組血肌酐水平均顯著降低，黃連解毒湯中、高劑量組血清尿素氮水平顯著降低（P＜0.01、0.001）。提示黃連解毒湯可能在緩解膿毒血癥導致的急性腎損傷過程中起到了保護作用。

圖2 黃連解毒湯對膿毒癥相關性AKI 小鼠血清中尿素氮和肌酐水平的影響 (±s, n = 5)Fig.2 Effect of Huanglian Jiedu Decoction on levels of urea nitrogen and creatinine in serum of sepsis related-AKI mice(±s, n = 5)

3.3 黃連解毒湯對膿毒癥相關性AKI 小鼠腎臟組織病理變化的影響

如圖3 所示，HE 染色可見對照組小鼠腎臟組織形態正常，無明顯病變。模型組小鼠腎臟組織腎小管結構失常，可見管型，腎小管上皮細胞脫落，細胞核輪廓不清晰，說明在LPS 誘導下發生小管凝固性壞死。與模型組比較，各給藥組不同程度減輕了膿毒血癥對腎臟組織的損傷，腎小管壞死情況明顯改善。

圖3 黃連解毒湯對膿毒癥相關性AKI 小鼠腎臟組織病理變化的影響 (×200)Fig.3 Effect of Huanglian Jiedu Decoction on pathological changes of renal tissue in sepsis related-AKI mice (× 200)

PAS 染色通常用于測定微絨毛、基底膜和主要在組織中的多糖積累[7]。對照組小鼠中觀察到廣泛的PAS 染色區域的管狀微絨毛和基底層，表明腎組織的結構相對完整。模型組小鼠腎臟中結構完整區域顯著減少，可見輕微擴張的腎小管和腫脹的腎小管細胞[8]。給予黃連解毒湯干預后，結構失常的腎小管和腎小管細胞顯著恢復。

3.4 黃連解毒湯對膿毒癥相關性AKI 小鼠腎組織Bax 和Bcl-2 表達的影響

Bax 和Bcl-2 是調控細胞凋亡的2 個關鍵蛋白，Bax 和Bcl-2 間的平衡決定了細胞是否進入凋亡[9]。為了驗證在小鼠膿毒癥相關性AKI 過程中是否存在細胞損傷和凋亡，通過免疫組化技術檢測Bax/Bcl-2 在模型小鼠腎組織中的蛋白表達和分布情況。如圖4 所示，模型組小鼠腎組織中觀察到強烈的Bax 信號，Bcl-2 表達微弱。與模型組比較，各給藥組小鼠腎組織Bax 表達降低，說明黃連解毒湯在一定程度上能夠延緩和減輕細胞凋亡的進程，進而發揮治療作用。

圖4 黃連解毒湯對膿毒癥相關性AKI 小鼠腎組織Bax 和Bcl-2 表達的影響 (×200)Fig.4 Effect of Huanglian Jiedu Decoction on Bax and Bcl-2 expressions in kidney tissue of sepsis related-AKI mice (× 200)

3.5 黃連解毒湯對膿毒癥相關性AKI 小鼠腎組織細胞凋亡的影響

為了進一步探究黃連解毒湯對細胞凋亡的影響，采用TUNEL 染色法檢測腎組織細胞凋亡情況。如圖5 所示，細胞核復染后為藍色，凋亡細胞核為綠色。模型組小鼠腎組織中TUNEL 陽性細胞數量增加，黃連解毒湯各劑量組小鼠腎組織凋亡細胞顯著減少。

圖5 黃連解毒湯對膿毒癥相關性AKI 小鼠腎組織細胞凋亡的影響 (×400)Fig.5 Effect of Huanglian Jiedu Decoction on cell apoptosis in kidney tissue of sepsis related-AKI mice (× 400)

3.6 黃連解毒湯對膿毒癥相關性AKI 小鼠腎組織PTEN/PI3K/Akt 通路相關蛋白表達的影響

如圖6 所示，與對照組比較，模型組小鼠腎組織PI3K和Akt蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05），p-Akt、p-PI3K 和PTEN 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組p-Akt 和p-PI3K 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）；黃連解毒湯中、高劑量組Akt 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；黃連解毒湯高劑量組PI3K 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），PTEN 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。

圖6 黃連解毒湯對膿毒癥相關性AKI 小鼠腎組織PTEN/PI3K/Akt 通路相關蛋白表達的影響 (±s, n = 5)Fig.6 Effect of Huanglian Jiedu Decoction on expressions of PTEN/PI3K/Akt pathway related-proteins in renal tissue of sepsis related-AKI mice (±s, n = 5)

4 討論

本研究結果顯示，LPS 誘導的小鼠腎組織出現腎小管上皮細胞壞死、變性，腎小管擴張等病理學損傷，這與先前相關研究報道基本一致[10]。經黃連解毒湯干預后，腎組織損傷出現不同程度減輕，表明黃連解毒湯對腎臟具有保護作用，并能夠抑制腎細胞凋亡。細胞凋亡由多種因素誘導，其中炎癥是膿毒癥相關性AKI 中最顯著的因素之一。免疫組化結果顯示，黃連解毒湯能夠調節腎臟組織中Bax/Bcl-2 的表達水平，表明黃連解毒湯可通過抑制炎癥反應來減輕AKI 小鼠細胞凋亡。PI3K/Akt 通路由于腎細胞中的凋亡增加而被顯著抑制，并伴隨有PTEN 表達的激活。而黃連解毒湯干預后，可呈劑量相關性地激活PI3K/Akt，并且與二者的磷酸化水平密切相關，這表明抑制腎細胞凋亡可能是延遲膿毒癥相關性AKI 進展的關鍵機制。

長期或過度的炎癥反應可能會對組織造成損害，甚至導致疾病的發生和進展。這時，細胞凋亡就會介入其中。細胞凋亡是一種精確調控的程序性死亡方式，通常被認為是維持組織穩態和免疫平衡的關鍵機制之一[11]。在細胞凋亡中，受到損傷或異常的細胞會啟動一系列信號通路，最終導致細胞的死亡[12]。因此在治療過程中，合理調控炎癥與細胞凋亡將會對膿毒癥相關性AKI 的預后產生重要的作用。在前期研究中，PTEN/PI3K/Akt 通路在細胞凋亡過程中扮演著重要的角色[13]。特別是該通路涉及多個關鍵分子，包括PTEN、PI3K 和Akt，它們相互作用以調節細胞平衡。PTEN 是一個重要的信號分子，其主要功能是通過去磷酸化作用，將磷脂酰肌醇 3,4,5 三磷酸（phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PIP3）轉化為磷脂酰肌醇4,5 二磷酸（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate，PIP2）[14]，從而降低PI3K/Akt 通路的活性。PI3K 被激活后會催化PIP2 轉化為PIP3，進而促進Akt 的活化。Akt是重要的細胞生存信號傳導分子，其活化可以通過磷酸化多個底物來促進細胞生存、增殖和抵抗凋亡[15]。正常情況下，PTEN 通過抑制PI3K/Akt 通路的活性，從而維持細胞的穩態。當細胞受到外界的凋亡信號，比如DNA 損傷或細胞環境的壓力，通路的平衡遭到破壞，導致Akt 的活性下降。PTEN/PI3K/ Akt 通路的變化對多個凋亡調控因子的表達和活性產生影響，Bcl-2 家族蛋白是一個重要的例子，它們在細胞凋亡的調控中發揮著關鍵作用。通常，高活化的Akt 會抑制Bcl-2 家族凋亡抑制蛋白的表達，從而減少細胞凋亡的傾向[16]。然而，當PTEN 活性增加，導致Akt 活性降低時，細胞中的Bcl-2 家族凋亡促進蛋白的表達增加，進而促使細胞走向凋亡途徑[17]。此外，Akt 在調節細胞凋亡中還通過調控其他通路和底物來發揮作用。例如，Akt 可以通過抑制Bad 蛋白的磷酸化來促進細胞生存，而磷酸化的Bad 可以與Bcl-2 蛋白家族相互作用以減少凋亡的傾向。同時，Akt 還可以通過調節FoxO 轉錄因子的活性[18]，影響多個與細胞凋亡相關基因的表達。

中醫認為膿毒癥相關性AKI 可根據其疾病表現歸于“關格”“癃閉”等范疇，《景岳全書》[19]云：“五臟之傷，窮必及腎。”腎乃先天之本，是全身臟腑陰陽之本，膿毒血癥起病急迫，其病因病機多為濕熱內蘊，毒擾心神[20]。濕熱熏蒸于腎，腎氣失于氣化，或三焦決瀆無權，通調水道失職或外感濕邪，郁而化熱，濕熱之邪循經下注，蘊結于腎，移于膀胱，水與熱結，形成濕熱內盛，致使膀胱氣機不暢，故常見少尿、無尿[21]；本病總屬虛實夾雜、本虛標實。主要由于正氣不足、熱毒濕濁羈留，但如邪毒不除，瘀滯絡脈，則脾不能升清降濁、化生氣血，腎不能氣化固攝，故精微不斷流失而使正氣愈虛、水濕濁毒羈留進一步損傷正氣，病來洶涌，危及生命，形成惡性循環。在臨床實踐中，膿毒血癥作為一種嚴重的全身性炎癥反應，多見高熱、口渴、煩躁以及神志不清等表現，根據溫病學派“到氣方可清氣”的學術思想[22]，此階段多屬于氣分證邪正交爭，由淺及深的關鍵階段，可見陽明熱盛、濕熱中阻等臨床表現，故當清解氣分熱毒。黃連解毒湯由黃連、黃芩、黃柏、梔子等組成，性苦寒直折，針對三焦熱盛證，功能瀉火解毒[23]。Zheng 等[24]研究認為黃連解毒湯在干預結腸炎小鼠的過程中可減輕DSS-V 小鼠的抑郁樣行為，同時降低白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-10和DNAX 相關蛋白12（DNAX-associated protein 12，Dap12）mRNA 的表達，起到了抗炎、抗氧化作用。黃連解毒湯的現代藥理學[25]研究證明其主要成分來源于黃芩、黃連、黃柏3 味藥材，具體包括小檗堿、黃連堿、黃柏堿等，前期的研究已充分證實了其在炎癥反應和細胞凋亡的抑制中具有顯著療效。而本研究意在進一步闡明黃連解毒湯作用于細胞凋亡的深層機制[26]。

本研究通過動物實驗驗證了黃連解毒湯能夠減輕小鼠膿毒癥相關性AKI 的進展并起到了腎臟保護作用。黃連解毒湯在緩解細胞凋亡中的治療作用可能歸因于PTEN/PI3K/Akt 信號通路的激活。這些發現將為黃連解毒湯的臨床應用提供新的實驗依據和理論支持，同時有助于更好地闡釋中藥復方在腎病防治中的科學內涵。在未來的研究中，將會聚焦細胞研究以及臨床研究，深度挖掘黃連解毒湯對于膿毒癥相關性AKI 的分子調控機制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突