防己黃芪湯在大鼠體內的藥動學研究及其對T 淋巴細胞的調節作用

呂春明，侯 婷，張 寧，王 冰

1. 上海中醫藥大學 科技實驗中心，上海 201203

2. 中國科學院上海藥物研究所，上海 201203

防己黃芪湯出自張仲景《金匱要略方論》[1]，由防己、黃芪、白術和炙甘草按4∶5∶3∶2 比例組成。防己苦寒，可除濕利水消腫，兼能辛散祛風；黃芪補氣健脾補肺，尤能固表行水，二藥配伍共為君藥，補氣除濕利水，祛風散邪固表。白術補脾燥濕，既助黃芪補氣固表，又助防己祛濕利水，為方中臣藥。甘草益氣健脾，調和諸藥，為方中佐使藥。諸藥配伍，是治療水腫之常用方，可用于治療水濕內停及脾腎虧虛之證[2]。目前，防己黃芪湯被廣泛用于治療自身免疫性疾病如類風濕性關節炎[3]、腎病綜合征[4]、慢性腎炎[5]、膝骨關節炎[6]，且該復方富含生物堿類、皂苷類、黃酮類及多糖類等活性成分[7]。多成分定量分析結果表明，粉防己堿是防己黃芪湯中含量最高的成分，為該方中重要的物質基礎[8]，具有抗炎[9]、抗腫瘤[10]、抗纖維化[11]等藥理作用。

自身免疫性疾病是一種局部或全身性炎癥反應的疾病，包括類風濕性關節炎、炎癥性腸病及系統性紅斑狼瘡等，主要影響因素涉及環境、遺傳及免疫等[12]。已有研究表明，CD4+T 細胞是自身免疫性疾病中的重要影響因素[13]。在一些自身免疫性疾病進展中，輔助性T 細胞（helper T cell，Th）的功能受到影響[14-15]；此外，調節性T 細胞（regulatory T cell，Treg）的活性也被抑制[16]。Treg 可分泌免疫抑制性的細胞因子以維持機體自身免疫耐受，因此，調控Th 和Treg 之間平衡是治療自身免疫性疾病的關鍵。提示探討防己黃芪湯對T 細胞的調控作用有助于闡明防己黃芪湯治療自身免疫性疾病的機制。

由于防己黃芪湯組方成分復雜，目前對其質量評價方法大多選擇其中幾個成分作為質控標準，難以反映復方整體水平，而且對防己黃芪湯有效成分在體內動態過程的研究不全面，但了解這些成分在體內的動態變化，對于揭示防己黃芪湯物質基礎和配方規律具有重要意義。因此，本研究擬對防己黃芪湯進行多成分表征的質量評價，研究防己黃芪湯在大鼠體內的藥動學行為，以揭示其主要入血成分的體內過程；同時，為進一步考察防己黃芪湯的藥效基礎，從Th 分化層面探討該復方在免疫方面的作用，為該復方的后續研究奠定了工作基礎。

1 材料

1.1 動物

體質量（270±20）g 的清潔級雄性SD 大鼠和體質量20～23 g 的SPF 級雌性BALB/c 小鼠均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于上海中醫藥大學動物實驗中心，合格證號SCXK（京）2012-0001，許可證號SYXK（滬）2014-0008。實驗前在室溫（22±2）℃、相對濕度45%～60%、每天光照12 h 的條件下適應性飼養1 周。動物實驗操作方法遵循上海中醫藥大學實驗動物倫理委員會相關規定（批準號201801006）。所有動物研究均根據《實驗動物護理和使用指南》進行。

1.2 藥材

防己、黃芪、甘草、白術飲片均購自上海康橋中藥飲片有限公司，批號分別為120901、131025、131029、130221，經上海中醫藥大學科技實驗中心張寧研究員分別鑒定為防己科植物粉防己StephaniatetrandraS. Moore 的干燥根、豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao 的干燥根、豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖、菊科植物白術AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖。

1.3 藥品與試劑

對照品木蘭花堿、防己諾林堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草次酸、黃芪甲苷、粉防己堿（批號分別為130611、121224、130204、110723、130816、121127，質量分數均≥98%）購自四川維克奇生物科技有限公司；甘草苷對照品（批號 1116010-201106，質量分數≥93.7%）購自中國食品藥品檢定研究院；地西泮（批號1159302，質量分數≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司；胎牛血清（批號12483020）、RPMI 1640 培養基（批號11875127）購自美國Gibco 公司；3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR，批號100430）購自中國科學院上海應用物理研究所；刀豆球蛋白A（concanavalin A，ConA，批號C2272）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號201608）購自美國Sigma-Aldrich 公司；肝素鈉（批號20150526）購自國藥基團化學試劑有限公司；紅細胞裂解液（批號11814389001）購自上海羅氏制藥有限公司；抗小鼠白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）、IL-2、γ-干擾素（γ-interferon，IFN-γ）捕獲抗體（批號分別為560268、554424、551309）購自美國BD Biosciences 公司；生物素化抗小鼠IL-17、IL-2、IFN-γ 檢測抗體（批號分別為BAF421、BAF402、BAF485）購自美國R&D Systems 公司；RIPA 裂解液（批號P00138）購自上海碧云天生物技術有限公司；CD4-PE、CD25-PE-Cy7 和FoxP3-APC 流式抗體（批號分別為12004382、25025742、4303851）購自Affymetrix eBioscience 公司；水為超純水，甲醇、甲酸為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.4 儀器

UltiMate 3000 型超高效液相色譜-TSQ Quantum Access Max 型三重四級桿質譜聯用系統（美國Thermo 公司）；Centrifuge 5810R 型冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；FACSCalibur 型流式細胞儀（美國BD 公司）；CP225D 型1/10 萬電子天平（德國Sartorius 公司）；PowerWave XS2 型全波長酶標儀（美國BioTek 公司）；MicroBeta TriLux/JET 閃爍/發光計數儀（美國Perkin Elmer 公司）。

2 方法

2.1 防己黃芪湯的制備

結合防己黃芪湯原方[1]，按《方劑學》第7 版（鄧中甲主編）記載，確定其處方組成為防己1 兩（12 g）、黃芪1 兩1 分（15 g）、白術七錢半（9 g）、甘草半兩（6 g）。分別稱取適量防己、黃芪、白術、甘草飲片（4∶5∶3∶2），加適量水浸泡30 min，以10 倍量蒸餾水煎煮2 次，每次1 h，煎液用3 層紗布濾過，合并濾液，減壓濃縮至適量，于65 ℃真空干燥，粉碎過80 目篩，得防己黃芪湯粉末，置于干燥器中保存[17]。

2.2 防己黃芪湯多成分定量分析的超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Acquity BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相為甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～1 min，20%A；1～8 min，20%～100% A；8～12 min，100% A；12～16 min，100%～20% A。體積流量0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量2 μL。

2.2.2 質譜條件 電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）掃描，正、負離子切換掃描模式，正、負離子噴霧電壓分別為＋3.5 kV、-2.5 kV；去溶劑氣溫度400 ℃；離子傳輸管溫度350 ℃；鞘氣壓力和輔助氣壓力分別為45、15 psi（1 psi＝6.895 kPa）。木蘭花堿、防己諾林堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、黃芪甲苷、甘草次酸、地西泮（內標）和粉防己堿的m/z分別為342.15～297.10、609.33～367.10、447.16～285.00、417.29～255.10、807.46～627.40、471.44～149.20、284.99～193.00、623.35～381.10，碰撞能量分別為18、38、19、20、49、36、27、43 eV。

2.2.3 混合對照品溶液和內標儲備液的配制 分別精密稱取木蘭花堿、防己諾林堿、粉防己堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草次酸、黃芪甲苷7 種對照品適量，置棕色10 mL 量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容，4 ℃保存，作為對照品儲備液。精密稱取地西泮粉末適量，加甲醇定容至10 mL，4 ℃保存，作為內標儲備液。臨用前，取一定量的混合對照品儲備液，用甲醇稀釋成混合對照品溶液（各成分質量濃度分別為木蘭花堿0.75、3.75、7.50、30.00 μg/L，防己諾林堿3、15、30、120 μg/L，粉防己堿7.5、37.5、75.0、300.0 μg/L，毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.75、3.75、7.50、30.00 μg/L，黃芪甲苷3、15、30、120 μg/L，甘草苷1.87、9.35、18.70、74.80μg/L，甘草次酸45、225、450、1 800 μg/L）。

2.2.4 給藥及血液樣本采集 SD 大鼠隨機分為6組，每組6 只。其中3 組大鼠分別按低、中、高劑量（2.67、4.00、6.00 g/kg）ig 防己黃芪湯混懸液。給藥前12 h 禁食，自由飲水，ig 2 h 后自由飲水和進食，分別于給藥后0.083、0.167、0.25、0.33、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、60 h眼眶靜脈采血400 μL，置于肝素鈉處理過的離心管中。另外3 組大鼠分別按低、中、高劑量（7.36、11.03、16.54 mg/kg）ig 粉防己堿混懸液，分別于給藥后0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、60 h 眼眶靜脈采血400 μL，置于肝素鈉處理過的離心管中。所得血漿于1 000 r/min 離心10 min后，取上清，保存于-20 ℃冰箱。

2.2.5 樣品處理 取大鼠血漿樣品200 μL，加入200 μg/L 內標儲備液50 μL，加甲醇850 μL 渦旋混合2 min 以沉淀蛋白，4 ℃、13 200 r/min 離心15 min，取上清液轉移至離心管，37 ℃下氮氣吹干，加20%甲醇100 μL 復溶，渦旋3 min，離心，取上清液進樣分析。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性考察 分別取大鼠空白血漿＋低質量濃度混合對照品溶液＋內標溶液、給藥后45 min的血漿樣品＋內標溶液、空白血漿＋內標溶液適量，按“2.2.5”項下方法處理，按“2.2.1”“2.2.2”項下條件檢測。

2.3.2 線性范圍及定量限考察 分別精密吸取一定量的混合對照品儲備液，加甲醇稀釋，得7 種不同質量濃度的混合對照品溶液，精密吸取100 μL，分別加至200 μL 的空白血漿中，按“2.2.5”項下方法處理，按“2.2.1”“2.2.2”項下條件檢測，記錄峰面積。以各成分峰面積與內標峰面積的比值為縱坐標（Y），各成分的質量濃度為橫坐標（X），采用加權最小二乘法，權重系數為1/χ2，繪制標準曲線，以信噪比（S/N）＝10 為定量限。

2.3.3 精密度和準確度考察 分別精密吸取“2.2.3”項下4 種質量濃度的混合對照品溶液100 μL，加至200 μL 的空白血漿中，每個質量濃度平行5 份，按“2.2.5”項下方法處理，按“2.2.1”“2.2.2”項下條件檢測，1 d 內連續測定3 次，評價日內精密度；連續測定3 d，評價日間精密度。

2.3.4 提取回收率與基質效應考察 取生理鹽水200 μL，加入4 種質量濃度的混合對照品溶液100μL 和200 μg/L 內標溶液50 μL，按“2.2.5”項下方法處理，按“2.2.1”“2.2.2”項下條件檢測，測定各成分峰面積，記為A。取空白血漿200 μL，加入內標溶液50 μL，加甲醇850 μL 渦旋混合2 min，離心，取上清液，加入4 種質量濃度的混合對照品溶液100 μL，37 ℃下氮氣吹干，加20%甲醇100 μL復溶，渦旋3 min，離心，吸取上清液，按“2.2.1”“2.2.2”項下條件檢測各成分峰面積，記為B。取空白血漿200 μL，加入4 種質量濃度的混合對照品溶液100 μL 和內標溶液50 μL，按“2.2.5”項下方法處理，按“2.2.1”“2.2.2”項下條件檢測，測定各待測物的峰面積，記為C。計算提取回收率和基質效應。

提取回收率＝C/B

基質效應＝C/A

2.3.5 穩定性考察 取大鼠空白血漿200 μL，分別加入4 種質量濃度的混合對照品溶液100 μL，按“2.2.5”項下方法處理，按“2.2.1”“2.2.2”項下條件檢測，考察不同儲存條件下（4 ℃放置24 h、25 ℃放置12 h、-20 ℃放置15 d、3 次凍融循環）樣品的穩定性。

2.4 藥動學研究

按“2.2.4”項下方法給藥、收集樣品，測定前于室溫溶解血漿樣品，渦旋，按“2.2.5”項下方法處理，按“2.2.1”“2.2.2”項下條件檢測，所得數據采用Kinetica 4.4 軟件非房室模型分析，計算各成分的達峰時間（tmax）、達峰濃度（Cmax）、消除半衰期（t1/2）、藥時曲線下面積（AUC）、平均駐留時間（MRT）、清除率（CL）和表觀分布容積（Vz）。

2.5 防己黃芪湯對Th 分化的調節作用

2.5.1 給藥溶液的配制 精密稱取防己黃芪湯粉末10 mg，用RPMI 1640 培養基溶解并稀釋成不同質量濃度的防己黃芪湯藥液，使用前經0.22 μm 微孔濾膜濾過。精密稱取粉防己堿5 mg，加1 mol/L HCl 充分溶解并定容至0.1 mg/L，精密吸取一定量于量瓶中，加1 mol/L NaOH 溶液調節pH 7.2，加RPMI 1640 培養基定容成0.6 mg/L 粉防己堿溶液，使用前經0.22 μm 微孔濾膜濾過。

2.5.2 小鼠脾臟單細胞懸液的制備 BALB/c 小鼠脊椎脫臼處死，置于75%乙醇中消毒滅菌，在生物安全柜中取出脾臟。用玻璃片將脾臟磨碎，200 目尼龍網濾過，得到的細胞懸液于4 ℃、1 000 r/min離心5 min（離心半徑10 cm），棄去上清液。向沉淀細胞中加入一定量的紅細胞裂解液，混勻，室溫靜置3 min，離心，棄上清液。加入磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）重懸，200 目尼龍網濾過，離心，棄上清液，加入一定量含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基，混勻，在倒置顯微鏡下對細胞懸液進行計數。

2.5.3 防己黃芪湯對T 淋巴細胞毒性的影響 將T細胞懸液用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基稀釋至3×105個/mL，按100 μL/孔接種于96 孔板中，空白組僅加入RPMI 1640 培養基，給藥組按50 μL/孔加入不同質量濃度（100、10、1、0.1、0.01、0.001、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7mg/mL）的防己黃芪湯藥液，空白組和對照組均按50 μL/孔加入RPMI 1640 培養基，每組設置6 個復孔，于細胞培養箱中培養92 h，按20 μL/孔加入MTT 溶液，繼續孵育4 h，棄去上清液，按150 μL/孔加入DMSO，搖床振蕩10 min，采用酶標儀于570 nm 處測定吸光度（A）值，計算抑制率。

抑制率＝1-(A給藥-A空白)/(A對照-A空白)

2.5.4 防己黃芪湯對T 淋巴細胞增殖的影響 將T細胞以2×104個/孔接種于96 孔板中，平行6 個復孔，按100 μL/孔加入細胞混懸液，空白組僅加入RPMI 1640 培養基，對照組和給藥組先按50 μL/孔加入8 mg/L ConA 溶液，給藥組再按50 μL/孔加入不同質量濃度（100、10、1、0.1、0.01、0.001、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7mg/mL）的防己黃芪湯藥液，空白組按50 μL/孔加入RPMI 1640 培養基，于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱內培養56 h，在終止培養前16 h，每孔加入3H-TdR 20 μL，使其終濃度為1 μCi/mL，繼續培養16 h。等標記反應完成后將標記的細胞收集至玻璃纖維膜上濾過，用蒸餾水多次洗滌，把濾紙片放在80 ℃烘箱內烘干后，放入含有脂溶性閃爍液10 mL 的閃爍杯中，采用閃爍/發光計數儀測定樣品的每分鐘脈沖數（cpm）。

2.5.5 防己黃芪湯對ConA 誘導的T 淋巴細胞炎癥因子水平的影響 將T 淋巴細胞以2×106個/孔接種于6 孔板中，設置對照組、模型組和各給藥組，對照組加入RPMI 1640 培養基，其余各組加入2 mg/L ConA，各給藥組再加入不同質量濃度（0.2、1.0、5.0 mg/L）的防己黃芪湯或0.6 mg/L 粉防己堿，培養96 h，于給藥后48 h 收集細胞上清液，采用ELISA 法測定IL-2 和IL-17 水平；于給藥后96 h 收集細胞上清液，測定IFN-γ 水平。

2.5.6 防己黃芪湯對ConA誘導的T淋巴細胞CD4+CD25+Foxp3+Treg 數目的影響 將T 淋巴細胞懸液以2×106個/孔接種于6 孔板中，按“2.5.5”項下方法進行分組與給藥，培養24 h 后收集細胞。加入具有熒光標記的CD4-PE 和CD25-PE-Cy7 抗體用于標記細胞表面，FoxP3-APC 抗體用于細胞內染色，通過流式細胞儀采集數據，使用CellQuestTM軟件進行分析。

2.6 統計學分析

運用SPSS Statistics 18.0 和GraphPad Prism 8 軟件進行統計學分析，數據以±s表示，采用t檢驗和One-way ANOVA 檢驗進行分析。

3 結果

3.1 方法學考察

3.1.1 專屬性 大鼠ig 防己黃芪湯后血漿樣品的UPLC-MS/MS 圖譜見圖1，表明該方法具有良好的專屬性。

3.1.2 線性范圍及定量限 如表1 所示，該方法滿足血漿樣品的測定要求。

表1 大鼠血漿中7 種成分的線性范圍和定量限Table 1 Linear ranges and quantification limits of seven components in plasma of rats

3.1.3 精密度和準確度 如表2 所示，7 個成分的日間、日內準確度為85.14%～105.50%，日間精密度和日內精密度的RSD 為0.2%～10.9%，符合生物樣品的檢測要求。

表2 大鼠血漿中7 種成分的精密度、回收率和基質效應Table 2 Precision, recovery rate and matrix effect of seven components in plasma of rats

3.1.4 提取回收率與基質效應 如表2 所示，各成分的提取回收率為86.90%～113.04%，基質效應為52.33%～112.50%，其中粉防己堿受基質效應影響較大（52.33%～64.76%），但粉防己堿的回收率較高（103.49%～111.68%），表明血漿中物質只對粉防己堿在質譜中的響應有抑制，因4 個不同質量濃度的粉防己堿基質效應RSD＜15%，說明這種抑制作用可通過建立隨行標曲計算濃度抵消，滿足分析要求。各成分回收率良好。

3.1.5 穩定性 如表3 所示，7 個成分的準確度為84.70%～115.65%，滿足生物樣品的分析要求。

表3 大鼠血漿中7 種成分的穩定性 (±s, n = 5)Table 3 Stability of seven components in plasma of rats (±s, n = 5)

表3 大鼠血漿中7 種成分的穩定性 (±s, n = 5)Table 3 Stability of seven components in plasma of rats (±s, n = 5)

成分 質量濃度/(μg·L-1)4 ℃放置24 h 25 ℃放置12 h -20 ℃放置15 d 3 次凍融循環實測質量濃度/(μg·L-1) 準確度/% 實測質量濃度/(μg·L-1) 準確度/% 實測質量濃度/(μg·L-1) 準確度/% 實測質量濃度/(μg·L-1) 準確度/%木蘭花堿 0.75 0.64±0.02 85.31 0.82±0.04 109.10 0.76±0.03 101.75 0.79±0.03 105.76 3.75 3.21±0.16 85.47 4.23±0.17 112.74 4.21±0.14 112.19 4.31±0.15 114.98 7.50 6.64±0.52 88.49 8.62±0.16 114.87 7.90±0.12 105.28 8.38±0.17 111.77 30.00 25.87±0.22 86.25 32.94±1.21 109.78 30.84±1.32 102.79 32.94±1.68 109.81防己諾林堿 3 2.77±0.09 92.42 3.47±0.09 115.57 3.43±0.02 114.27 3.38±0.06 112.73 15 12.71±0.70 84.70 17.06±0.25 113.75 15.94±1.44 106.28 17.11±0.37 114.08 30 26.56±2.05 88.53 34.48±0.16 114.94 33.32±0.70 111.06 32.81±1.41 109.35 120 102.76±2.82 85.64 135.04±2.95 112.53 129.21±3.83 107.68 127.14±3.94 105.95粉防己堿 7.5 6.66±0.34 88.76 8.63±0.66 115.04 8.46±0.38 112.76 8.60±0.30 114.67 37.5 34.00±1.51 90.68 37.83±8.75 100.87 42.24±0.89 112.65 38.27±2.23 102.06 75.0 69.05±2.82 92.06 85.82±4.99 114.42 83.82±0.85 111.76 83.47±0.59 111.29 300.0 255.02±1.21 85.01 312.38±5.99 104.13 306.54±11.80 102.18 313.58±4.66 104.53毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.75 0.66±0.06 87.36 0.65±0.03 86.34 0.64±0.03 85.48 0.66±0.02 88.11 3.75 3.28±0.14 87.48 3.24±0.03 86.28 3.20±0.09 85.43 3.49±0.23 92.97 7.50 6.93±0.16 92.37 6.39±0.61 85.15 6.68±0.14 89.09 6.56±0.48 87.47 30.00 26.84±0.29 89.48 28.89±1.17 96.30 26.22±0.96 87.41 28.44±0.46 94.79甘草苷 1.87 1.68±0.59 89.71 1.66±0.14 88.77 1.62±0.09 86.63 1.65±0.08 88.24 9.35 9.15±0.74 97.85 8.04±0.22 86.04 8.25±0.28 88.21 8.80±0.36 94.09 18.70 19.01±0.92 101.67 16.30±0.90 87.14 16.70±0.54 89.29 16.22±0.79 86.73 74.80 65.16±0.84 87.11 63.61±3.05 85.04 63.99±2.95 85.54 63.70±1.14 85.16黃芪甲苷 3 2.74±0.11 91.31 2.86±0.07 95.30 2.74±0.09 91.29 2.83±0.06 94.18 15 13.80±0.34 92.01 16.64±0.31 110.90 15.80±0.47 105.36 16.84±0.43 112.25 30 28.40±0.56 94.65 31.14±0.44 103.81 29.80±0.28 99.32 29.90±2.18 99.66 120 105.71±1.77 88.09 120.02±2.72 100.01 116.41±2.50 97.01 119.84±3.28 99.87甘草次酸 45 42.92±1.45 95.38 50.93±1.73 113.18 51.85±1.30 115.23 51.71±2.14 114.92 225 223.84±4.89 99.49 257.72±9.09 114.54 260.20±11.10 115.65 240.61±8.53 106.94 450 445.53±14.17 99.01 515.83±7.71 114.63 498.92±5.14 110.87 499.64±19.47 111.03 1 800 1 588.55±23.73 88.25 1 819.79±69.77 101.10 1 832.85±84.19 101.82 1 813.87±43.66 100.77

3.2 藥動學研究

各成分的藥時曲線見圖2，藥動學參數見表4。木蘭花堿、粉防己堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、黃芪甲苷和甘草次酸的AUC0～t和AUC0～∞具有劑量相關性趨勢；木蘭花堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷在體內可被快速吸收并消除[tmax＜1 h、CL＞50 L/(h·kg)]；粉防己堿、防己諾林堿和甘草次酸在大鼠體內消除緩慢[CL＜8 L/(h·kg)]，體內駐留時時間較長（MRT＞10 h），表明其在體內具有吸收時間長、消除速度慢、駐留時間長的特點。黃芪甲苷的藥時曲線呈雙峰現象，第1 個峰的tmax為0.5 h，第2 個峰的tmax為4 h；第1 個峰的吸收和消除速率均比第2 個快，在其他含有黃芪的中藥復方中也出現了此現象[18]，但黃芪甲苷單體和黃芪提取物中黃芪甲苷的藥動學研究并未發現有雙峰現象[19-20]，推測黃芪甲苷的吸收、消除等過程易受復方中其他成分的影響。粉防己堿是防己黃芪湯入血最多的生物堿，ig 不同劑量的粉防己堿是為了對比單一給藥和復方給藥時粉防己堿藥動學的區別，探索復方是否有增進粉防己堿入血的作用。實驗中采用的粉防己堿給藥劑量根據防己黃芪湯給藥劑量折算。與單一成分給藥相比，防己黃芪湯中的粉防己堿的吸收程度明顯增加，而消除速率明顯降低。

表4 大鼠ig 防己黃芪湯和粉防己堿后7 種成分的藥動學參數 (±s, n = 6)Table 4 Pharmacokinetic parameters of seven ingredients in rats after ig Fangji Huangqi Decoction and tetradrine(±s, n = 6)

表4 大鼠ig 防己黃芪湯和粉防己堿后7 種成分的藥動學參數 (±s, n = 6)Table 4 Pharmacokinetic parameters of seven ingredients in rats after ig Fangji Huangqi Decoction and tetradrine(±s, n = 6)

與同等級別劑量粉防己堿比較：*P＜0.05 **P＜0.01。*P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs same level of dosage of tetrandrine.

成分 劑量/(g·kg-1) tmax/h Cmax/(μg·L-1) AUC0～t/(h·μg·L-1) AUC0～∞/(h·μg·L-1) t1/2/h MRT/h CL/(L·h-1·kg-1) Vz/(L·kg-1)木蘭花堿 2.67 0.50±0.31 3.09±1.51 4.36±2.07 4.80±2.13 1.58±0.61 2.26±0.81 89.69±50.69 203.33±155.92 4.00 0.71±0.70 3.04±1.41 6.89±1.58 9.06±2.64 3.53±1.03 5.10±1.17 62.12±15.56 302.42±64.38 6.00 0.32±0.12 6.91±4.11 12.78±6.63 15.42±8.56 2.90±0.98 3.89±1.55 58.81±28.21 220.06±162.58防己諾林堿 2.67 12.00±0.00 20.92±7.73 650.18±234.14 764.81±295.77 17.51±4.54 34.57±5.19 5.84±2.32 145.36±62.24 4.00 19.43±15.90 30.44±8.39 1 020.12±275.1 1 345.94±415.18 23.51±8.32 41.95±13.71 4.77±1.59 148.94±28.19 6.00 9.67±0.82 30.59±5.22 950.77±272.58 1 259.92±542.32 22.44±9.74 39.60±12.90 7.82±2.37 231.96±57.86毛蕊異黃酮葡萄糖苷2.67 0.25±0.07 2.09±1.54 0.84±0.72 0.92±0.72 0.29±0.15 0.54±0.17 1 594.95±1 457.71 731.36±844.50 4.00 0.29±0.04 2.37±1.43 1.73±0.80 2.12±0.95 1.08±0.87 1.70±1.31 640.98±406.27 718.42±412.19 6.00 0.24±0.06 7.77±6.13 3.54±2.69 3.94±2.79 1.21±0.27 1.50±0.32 538.44±263.86 969.95±594.93甘草苷 2.67 0.33±0.13 15.38±8.33 12.28±7.97 14.80±8.08 0.72±0.21 1.13±0.28 350.99±179.62 335.18±139.21 4.00 0.36±0.28 23.31±10.89 28.72±8.04 37.72±10.78 1.62±0.71 2.50±1.13 173.43±54.43 382.30±135.10 6.00 0.24±0.03 41.37±8.78 43.01±8.54 51.70±8.61 1.59±0.51 2.16±0.40 180.21±32.18 414.71±148.57黃芪甲苷 2.67 4.75±3.37 12.11±6.96 57.73±25.22 59.62±16.51 2.04±0.79 5.33±1.81 1.97±0.61 5.49±1.48 4.00 4.43±4.07 22.44±6.93 154.74±59.68 161.96±64.56 3.14±1.39 6.57±1.84 1.29±0.80 5.69±3.88 6.00 3.36±3.00 47.21±21.10 347.80±169.09 443.93±190.02 5.05±5.39 9.55±6.85 0.70±0.43 4.36±3.89甘草次酸 2.67 14.00±7.90 353.24±54.55 3 840.88±934.84 3 425.07±1 841.45 3.36±1.77 10.38±5.32 0.01±0.00 0.02±0.01 4.00 13.00±5.62 804.01±217.18 15 072.44±8 022.39 15 265.82±8 227.71 5.06±0.91 16.51±5.47 0.00±0.00 0.01±0.01 6.00 9.00±2.76 1 063.86±257.49 24 245.92±10 980.03 25 559.35±13 392.71 7.37±2.61 20.30±6.77 0.00±0.00 0.02±0.01粉防己堿 0.007 36 8.00±1.15 38.30±12.10 783.11±192.82 1 167.25±371.63 30.68±7.66 48.98±11.80 7.04±2.84 291.92±62.74 2.670 00 12.00±0.00 87.58±45.61 2 327.39±1 239.91* 2 770.02±1 569.78* 19.88±3.24** 33.20±3.78 3.38±1.71* 94.47±51.51*粉防己堿 0.011 03 7.67±2.94 45.18±9.85 1 147.25±365.13 1 546.48±490.51 24.77±3.20 41.78±3.21 7.92±3.08 274.19±80.34 4.000 00 12.57±5.38 133.34±42.24** 4 081.93±1 016.07** 5 742.23±3 419.01** 16.25±5.05** 31.60±6.88 2.38±1.00** 64.03±21.18**粉防己堿 0.016 54 7.20±3.03 90.22±20.93 1 941.03±463.97 2 436.85±569.34 21.27±1.47 36.27±3.29 7.10±1.69 219.96±64.39 6.000 00 9.33±1.03 373.64±85.62** 9 671.86±1 291.46** 11 523.07±2 171.49** 19.07±7.53 33.07±10.99 1.48±0.28** 38.97±11.22**

圖2 大鼠ig 防己黃芪湯后7 種成分的藥時曲線 (±s, n = 6)Fig.2 Drug-time curve of seven compounds in rats after ig Fangji Huangqi Decoction (±s, n = 6)

3.3 防己黃芪湯對Th 分化的調節作用

3.3.1 防己黃芪湯對T 淋巴細胞毒性的影響 如表5 所示，防己黃芪湯在1×10-7～100 mg/L 對T 淋巴細胞無明顯細胞毒性作用。

表5 防己黃芪湯對T 淋巴細胞毒性的影響 ( ± s, n = 6)Table 5 Effect of Fangji Huangqi Decoction on cytotoxicity of T lymphocytes (±s, n = 6)

表5 防己黃芪湯對T 淋巴細胞毒性的影響 ( ± s, n = 6)Table 5 Effect of Fangji Huangqi Decoction on cytotoxicity of T lymphocytes (±s, n = 6)

組別 劑量/(mg·L-1) A 抑制率/%空白 — 0.167±0.003 —對照 — 0.300±0.013 —防己黃芪湯 100 0.246±0.008 41 10 0.265±0.006 26 1 0.314±0.028 1 0.1 0.296±0.012 3 0.01 0.292±0.022 6 0.001 0.304±0.017 -3 1×10-4 0.304±0.017 -3 1×10-5 0.298±0.017 1 1×10-6 0.282±0.005 13 1×10-7 0.288±0.005 9

3.3.2 防己黃芪湯對T 淋巴細胞增殖的影響 如表6 所示，防己黃芪湯在1×10-7～100 mg/L 對T 淋巴細胞的增殖具有抑制作用，其半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）為1.76 mg/L。

表6 防己黃芪湯對T 淋巴細胞增殖的影響 (±s, n = 6)Table 6 Effect of Fangji Huangqi Decoction on proliferation of T lymphocytes (±s, n = 6)

表6 防己黃芪湯對T 淋巴細胞增殖的影響 (±s, n = 6)Table 6 Effect of Fangji Huangqi Decoction on proliferation of T lymphocytes (±s, n = 6)

組別 劑量/(mg·L-1) 每分鐘脈沖數/cpm 抑制率/%空白 — 125±8 —對照 — 4 640±406 —防己黃芪湯 100 68±10 101 10 219±39 98 1 2 841±708 40 0.1 3 471±540 26 0.01 3 694±685 21 0.001 4 106±581 12 1×10-4 4 162±543 11 1×10-5 4 369±884 6 1×10-6 4 474±623 4 1×10-7 4 523±1 286 3

3.3.3 防己黃芪湯對ConA 誘導的T 淋巴細胞炎癥因水平的影響 如表7 所示，與對照組比較，模型組細胞上清液中IL-2、IFN-γ 和IL-17 水平均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，防己黃芪湯高劑量組細胞上清液中IL-2、IFN-γ 和IL-17 水平均明顯降低（P＜0.05、0.01），防己黃芪湯中劑量組IL-17 水平明顯降低（P＜0.01），防己黃芪湯低劑量組IL-2和IL-17 水平明顯降低（P＜0.05、0.01），粉防己堿組IL-17 水平顯著降低（P＜0.01）。

表7 防己黃芪湯對ConA 誘導的T 淋巴細胞炎癥因子水平和Treg 數目的影響 (±s, n = 3)Table 7 Effect of Fangji Huangqi Decoction on inflammatory cytokine levels and Treg count of ConA-induced T lymphocytes (±s, n = 3)

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01。##P ＜ 0.01 vs control group; *P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs model group.

組別 劑量/(mg·L-1) IL-2/(ng·mL-1) IL-17/(ng·mL-1) IFN-γ/(ng·mL-1) CD4+ CD25+ FoxP3+/%對照 — 1.215 9±0.023 5 0.101 6±0.008 1 0.096 2±0.003 8 22.333 3±17.897 9模型 — 8.637 5±0.072 1## 0.966 7±0.041 0## 0.120 0±0.004 1## 107.666 7±26.539 3##防己黃芪湯 0.2 7.184 7±0.522 4* 0.848 3±0.015 9** 0.107 3±0.000 0 151.000 0±48.041 6 1.0 7.477 1±0.180 1 0.669 7±0.019 7** 0.106 2±0.002 0 306.333 3±81.512 8*5.0 6.847 1±0.319 6** 0.709 5±0.015 3** 0.101 7±0.001 9* 343.666 7±64.127 5**粉防己堿 0.6 8.955 1±0.845 2 0.608 4±0.006 7** 0.114 4±0.013 8 280.333 3±61.808 8*

3.3.4 防己黃芪湯對ConA 誘導的T 淋巴細胞Treg數目的影響 如表7 所示，與對照組比較，模型組CD4+CD25+Foxp3+細胞比例明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，粉防己堿組和防己黃芪湯中、高劑量組CD4+CD25+Foxp3+細胞比例顯著升高（P＜0.05、0.01）。

4 討論

目前關于防己黃芪湯中黃酮類和皂苷類成分的藥動學研究報道較少，本研究建立了同時測定大鼠血漿中木蘭花堿、防己諾林堿和粉防己堿等7 個成分含量的UPLC-MS/MS 分析方法。通常情況下，進入體循環的成分才有可能是中藥復方的藥效物質。研究表明，防己諾林堿、木蘭花堿、黃芪甲苷、甘草次酸和粉防己堿具有抗炎作用[21-24]，這些成分可能是防己黃芪湯發揮抗炎作用的重要物質基礎。此外，防己黃芪湯中木蘭花堿、黃芪甲苷、甘草次酸和粉防己堿的吸收表現出了劑量相關性，這與防己黃芪湯產生劑量相關性的抗炎藥效相關[25]。

中藥復方中活性成分的藥時曲線呈現雙峰是較為普遍的現象。造成這種現象的原因可能有以下幾種：①肝腸循環，經膽汁排入腸道的原型藥物或者代謝物被腸黏膜重新吸收，由肝門靜脈進入肝臟[26]；②胃排空和小腸轉運異常[27]；③特定吸收位置[28]；④藥物劑型因素[29]。黃芪甲苷的藥時曲線呈雙峰現象，這種現象也同樣發生在其他含有黃芪的中藥復方中[17]，但關于黃芪甲苷單體和黃芪提取物中黃芪甲苷的藥動學研究并未發現有雙峰現象[30]，推測黃芪甲苷的藥動學行為易受復方中其他成分的影響。除黃芪甲苷外，防己黃芪湯中的其他成分也會相互影響。細胞色素P450（cytochrome P450，CYP）3A是人體肝臟和小腸中最豐富的CYP 酶之一，其代謝介導的化合物的藥動學特性會因藥物相互作用而發生改變[31]。研究表明，粉防己堿的代謝過程需要CYP3A4 和CYP3A5 的參與[32]。粉防己堿水溶性較差、生物利用度較低[33]，而本研究表明防己黃芪湯給藥時能夠提高粉防己堿的生物利用度，此現象表明粉防己堿與復方中其他成分可能存在協同作用。甘草次酸是甘草酸具有藥理活性的主要代謝物，研究顯示，甘草次酸是CYP3A4 的抑制劑[34]，因此，推測甘草次酸可能會通過CYP3A4 抑制粉防己堿的代謝過程，減緩其消除速率，增加其在體循環中的暴露量，從而增加防己黃芪湯中粉防己堿的生物利用度。

此外，本研究發現防己黃芪湯可以抑制T 淋巴細胞增殖，并下調炎性細胞因子水平，對于免疫疾病的臨床應用具有重要意義。FoxP3 是Treg 的關鍵和特異性轉錄因子，是增加Treg 活性的先決條件[35-37]。本研究結果顯示防己黃芪湯可以促進CD4+CD25+FoxP3+Treg 的分化，表明防己黃芪湯可能通過促進Treg 的分化，從而抑制ConA 誘導的T 淋巴細胞的增殖。因此，Treg 可能是防己黃芪湯治療疾病的關鍵。防己黃芪湯主要入血成分粉防己堿可在體外誘導Treg 分化，這與其他研究者的結論一致[38]，因此，粉防己堿可能是防己黃芪湯發揮疾病治療的關鍵藥效物質。

綜上，大鼠ig 防己黃芪湯后血液中的主要成分有木蘭花堿、防己諾林堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、黃芪甲苷、甘草次酸和粉防己堿，且粉防己堿與復方中的其他成分存在著協同作用，可提高該成分的生物利用度，體現了中藥配伍的合理性和科學性。另外，本研究還考察了防己黃芪湯及其主要入血成分粉防己堿對T 淋巴細胞分化的調節作用，發現Treg 可能是防己黃芪湯治療免疫性疾病的關鍵免疫細胞，而粉防己堿在其中發揮重要作用。

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