南方紅豆杉轉錄組SSR 位點分析及其分子標記開發

蔣路園 ，吳文麗，張愷愷，張林鳳，邵芬娟，陳段芬，邱德有，楊艷芳*

1. 中國林業科學研究院林業研究所 林木遺傳育種全國重點實驗室，國家林業局林木培育重點實驗室，北京 100091

2. 河北農業大學園藝學院，河北 保定 071001

紅豆杉屬Taxusspp.植物，俗稱紫杉，不僅具有較高的觀賞價值，更是抗癌藥物紫杉醇的重要原材料，具有極高的藥用價值。紅豆杉屬植物主要分布在北半球，全球有11 個種[1]。南方紅豆杉TaxuschinensisSmith var.mairei, Lemee et Lévl S.Y. Hu et Liu 又稱美麗紅豆杉，是中國紅豆杉T.chinensis(Pilg.) Rehd.的變種，在我國分布范圍最廣。自1985 年美國國立癌癥研究院發現紅豆杉屬植物含有多種抗腫瘤活性成分后，人類為謀取暴利隨意采伐，導致南方紅豆杉自然資源日益減少[2]。紅豆杉資源保護及可持續開發利用是影響紅豆杉產業發展的關鍵問題。

簡單重復序列標記（simple sequence repeats，SSR），又稱短串聯重復序列或微衛星標記，是一類由幾個核苷酸（1～6 個）為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的重復序列，長度較短，且廣泛分布于真核生物基因組中[3]。由于重復單位的核苷酸不同以及重復次數不完全相同，造成SSR 長度的高度變異性。SSR 遵循孟德爾遺傳方式，呈共顯性遺傳，具有數量豐富、高度多態性、可靠性好、檢測快速等特征，已成為群體遺傳學分析中的一個有用的標記系統，被廣泛應用于遺傳圖譜的構建、種質資源遺傳多樣性研究、遺傳關系與分化及群體結構分析等領域。此外，近年來，有研究發現SSR 還可能對植物的逆境脅迫響應有重要作用[4]。

目前，已有研究者在紅豆杉中開發出了多個具有多態性的SSR 分子標記[5-11]，并利用SSR 分子標記技術在紅豆杉中開展相關研究，如國外研究者利用SSR 分子標記技術研究了生境斷裂對歐洲紅豆杉T.baccataL.的遺傳結構的影響[12]，國內研究者也通過SSR 技術發現生境斷裂是導致云南紅豆杉T.yunnanensisCheng et L. K. Fu 顯著遺傳瓶頸、近親繁殖和種群分化主要原因[13]。開發南方紅豆杉SSR分子標記，了解南方紅豆杉的遺傳多樣性，對南方紅豆杉資源保護、育種和遺傳改良非常重要。

赤霉素（gibberellin A3，GA3）和紫杉醇同為二萜類化合物，在生物合成途徑中存在底物競爭關系。前人研究表明，GA3處理可以提高紅豆杉中紫杉醇產量[14]，紫杉醇合成關鍵酶基因的啟動子序列含有GA3應答成分[15]。因此，基于GA3處理南方紅豆杉轉錄組數據開發SSR 標記，有可能獲得紫杉醇合成相關的SSR 位點。

隨著科技發展，下一代測序技術（nextgeneration sequencing，NGS）的出現使得SSR 標記快速經濟開發成為現實。目前，人們已經基于組學數據對包含紅豆杉在內的多種植物開發獲得了一些具有多態性的標記[5,8-10]，然而，目前可檢索到的南方紅豆杉SSR 標記數量僅有少量具有多態性，遠遠不能滿足南方紅豆杉遺傳多樣性等研究。本課題組前期利用RNA-seq 技術對GA3處理下的南方紅豆杉的葉片進行了轉錄組測序，本研究基于此轉錄組數據對SSR 分子標記進行了鑒定和分析，并開發出了13 對具有多態性的SSR 標記，豐富南方紅豆杉SSR 標記數量，為紅豆杉品種鑒定、分子輔助標記育種和遺傳多樣性分析提供理論基礎。

1 材料、儀器及試劑

南方紅豆杉T.chinensisSmith var.mairei,Lemee et Lévl S. Y. Hu et Liu、東北紅豆杉T.cuspidataSiebold & Zucc.和曼地亞紅豆杉T. ×mediaRehder 材料經中國林業科學研究院林業研究所楊艷芳研究員鑒定后，分別種植于中國林業科學研究院科研溫室和廊坊種植基地，樣品信息見表1。

表1 樣本信息Table 1 Sample information

3730XL 型基因測序儀（Applied Biosystems）、veritiTM96 型PCR 儀（Thermo Fisher Scientific）、5430R 型離心機（Eppendrof）、NanoDrop 分光光度計（Gene Company Limited）等。本實驗所用主要試劑包括：CTAB（北京酷來搏科技有限公司）、TaqDNA 聚合酶（康為世紀生物科技股份有限公司）、瓊脂糖（南京森貝伽生物科技有限公司）、TAE buffer（北京酷來搏科技有限公司）、ddH2O（北京酷來搏科技有限公司）等。

2 方法

2.1 樣品的處理

5 年生南方紅豆杉種植于中國林業科學研究院科研溫室，利用200 μmol/L GA3分別在上午9:00 和下午15:00 噴施于紅豆杉葉片，處理2 d 后，于第3天上午9:00 收集葉片，液氮速凍后保存在-80 ℃冰箱，用于后續轉錄組測序。純水處理作為對照。樣品經過RNA 提取、cDNA 文庫構建質檢合格后，采用Illumina 測序平臺進行轉錄組測序，過濾原始數據后，采用Trinity 軟件進行組裝。

2.2 紅豆杉基因組DNA 提取

溫室中的紅豆杉葉片采集后立刻置于液氮中，放置-80 ℃冰箱。廊坊基地紅豆杉葉片于采集時裝入含有硅膠的自封袋中進行干燥。樣品通過液氮研磨后用于基因組DNA 提取。提取方法采用mCTAB法（modified CTAB method）[16]，在1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測完整度，并根據Nanodrop 測定將DNA原液稀釋至50 ng/μL 保存于-20 ℃條件下用于后續實驗。

2.3 紅豆杉轉錄組SSR 位點的篩選及引物設計

使用MISA 軟件對南方紅豆杉轉錄組數據進行SSR 分析，搜索SSR 位點。可搜索單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸，最小重復數分別設置為10、6、5、5、5、5 次。采用Primer 3（2.3.5 版，默認參數）進行SSR 引物設計。

基于轉錄組數據開發的一批SSR 引物中，選擇重復單元堿基數2～3 bp，重復單元7～10 次的96對SSR 引物進行篩選實驗。所選擇的引物長度在20～25 bp，理論退火溫度52～56 ℃，PCR 產物長度處于150～350 bp。

2.4 SSR 引物的PCR 擴增

PCR 擴增為2 輪擴增。第1 輪（獲取相應片段）PCR 擴增反應體系：雙蒸水（ddH2O）5.9 μL，10×Taq Buffer 1 μL，2 mmol/L dNTP 1 μL，5 μmol/L 正向SSR 引物0.5 μL，5 μmol/L 反向SSR 引物0.5 μL，TaqDNA 聚合酶0.1 μL，50 ng/μL 的DNA 模板 1 μL。反應程序：94 ℃預變性4 min；20 個循環的3 步PCR（94 ℃變性0.5 min，退火時間0.5 min，退火溫度為52 ℃，72 ℃延伸1 min）；72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。第2 輪（添加熒光標記）PCR 擴增反應體系：ddH2O 5.9 μL，10×Taq Buffer 1 μL，2 mmol/L dNTP 1 μL，5 μmol/L 帶熒光的M13 正向接頭引物0.5 μL，5 μmol/L 反向SSR 引物0.5 μL，TaqDNA 聚合酶0.1 μL，50 ng/μL的第1 輪模板1 μL。反應程序：94 ℃預變性4 min；30 個循環的3 步PCR（94 ℃變性0.5 min，退火時間0.5 min，退火溫度為50 ℃，72 ℃延伸1 min）；72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。

2.5 毛細管電泳檢測

將PCR 產物根據不同熒光標記進行混板，在生工生物工程（上海）股份有限公司通過3730XL 測序儀檢測對PCR 產物進行毛細管熒光電泳檢測。通過毛細管熒光電泳檢測，最終選定多態性好，擴增成功率高的SSR 引物用于后續數據分析。

2.6 數據分析

將下機的原始數據“.fsa”文件導入到分析軟件GeneMarker 4.0 中進行峰圖判讀，具有多態峰圖的則表示該引物具有多態性，記錄等位基因大小，得到等位基因矩陣。根據判讀所得等位基因位點矩陣，通過GenALEx 來計算每個個體間的遺傳距離和每對引物的等位基因數（number of alleles，Na）、有效等位基因數（effective number of allele，Ne）、期望雜合度（expected heterozygosity，He）、觀測雜合度（observed heterozygosity，Ho）、Shannon’s 指數（Shannon’s information index，I）等遺傳多樣性數據。利用PIC-CALC 0.6 軟件計算SSR 位點的多態性信息數據（polymorphism information content，PIC）。基于GenALEx 計算所得的個體遺傳距離矩陣，通過MEGA 進行UPGMA 聚類分析，構建聚類樹。

3 結果與分析

3.1 轉錄組SSR 位點數量與分布

利用Trinity 拼接從GA3處理下的南方紅豆杉轉錄組中共獲得202 361 條Unigene，通過鑒定，共獲得了12 008 個SSR 位點，出現頻率（SSR 數與總Unigene 數之比）為5.93%，這些SSR 分布在10 894 條Unigene 中，發生頻率（含SSR 的Unigene 數與總Unigene 數之比）為5.38%，SSR平均分布距離為1/7.64 kb。含有1 個以上SSR 位點的Unigene 有975 條，包含復合形SSR 的Unigene 有489 條。

南方紅豆杉SSR 類型豐富，單核苷酸至六核苷酸重復類型均存在。12 008 個SSR 位點包括6 213個單核苷酸（51.74%）、2 507 個二核苷酸（20.88%）、2 992 個三核苷酸（24.92%）、226 個四核苷酸（1.88%）、27 個五核苷酸（0.22%）、43 個六核苷酸（0.36%）。其中單核苷酸最豐富，其次是三核苷酸和二核苷酸類型，五核苷酸類型最少。所有SSR 中以10 次重復的SSR 最多，占24.48%，5 次重復占16.73%，6 次重復占15.30%。南方紅豆杉轉錄組SSR，基序的重復次數在5～72，以5～10 次重復的SSR 最多，共8 413 個，占總SSR 的70.06%；其次是10～14 次重復，共2 566 個，占總SSR 的21.37%；14 次以上的重復較少，共1 029 個，占總SSR 的8.57%（表2）。

表2 南方紅豆杉SSR 不同基序長度和重復次數的分布Table 2 Distribution of SSR with different motif types and repeat numbers in T. chinensis var. mairei

3.2 轉錄組SSR 基序重復類型和頻率特征

研究發現，在12 008 個SSR 位點中包含114種重復基元，其中單、二、三、四、五、六核苷酸重復分別有2、4、10、29、26、43 種。從出現頻率來看（表3），頻率較高的重復基元分別為A/T，占總位點數的49.60%。單核苷酸重復類型中，A/T出現頻率明顯高于C/G，分別占總位點數的49.60%和2.14%；二核苷酸重復類型中，AG/CT 最多，約占總位點數的10.93%，其次是AT/AT 和AC/GT，分別占總位點數的5.14%、4.65%，CG/CG 最少，約占總位點數的0.17%；三核苷酸重復類型中，AAG/CTT 最多，約占總位點數的5.49%，ACT/AGT最少，約占總位點數的0.44%；四核苷酸重復類型中，AAAG/CTTT 最多，約占總位點數的0.23%，AACG/CGTT 、 AACT/AGTT 、 ACCT/AGGT 、ATCG/ATCG 最少，占總位點數不足0.001%；五、六核苷酸約占總位點數0.58%。

表3 南方紅豆杉SSR 類型分布Table 3 Distribution of SSR repeat types in T. chinensis var. mairei

3.3 SSR 引物有效性驗證

選擇重復單元堿基數2～3 bp，重復單元7～10 次的96 對SSR 引物進行篩選實驗。結果顯示，以我國多個地區的南方紅豆杉DNA 為模板進行SSR-PCR，13 對（表4）引物具有多態性，多態性引物比率為13.54%。引物多態峰圖舉例見圖1。

圖1 HDS10 標記在太行山、湖南和福建地區紅豆杉樣本中的基因分型Fig.1 Genotyping by HDS10 maker for T. chinensis var. mairei from Taihang mountain, Hunan, and Fujian Provinces

表4 SSR 引物信息Table 4 Information of primers

13 個SSR 位點的多態性信息見表5。12 個樣本的Na為2～10，13 個SSR 位點上總的Na為55，平均值為4.23。Ne為1.53～5.43，平均值為2.76。I為0.53～1.85，平均值為1.10。Ho為0.14～0.82，平均值為0.39。He為0.35～0.82，平均值為0.58 個。PIC 為0.29～0.79，HDS5、HDS14、HDS52、HDS54和HDS93 為中多態性位點（0.25＜PIC＜0.5），HDS1、HDS10、HDS56、HDS76、HDS82、HDS84、HDS86 和HDS88 則為高多態性位點（PIC＞0.5）。其中，HDS 84 的多態性最高，其PIC 值為0.79。

表5 SSR 引物位點多樣性Table 5 SSR loci diversity of 13 SSR primers

3.4 SSR 位點種間擴增

將上述13 對具有多態性的SSR 引物在東北紅豆杉和曼地亞紅豆杉DNA 樣品中進行擴增，結果發現有13 對引物在東北紅豆杉DNA 樣品中有擴增，而在曼地亞紅豆杉DNA 樣品中僅有3 對引物有擴增（表6）。兩者相比較，13 對引物在東北紅豆杉DNA 樣品中的有效擴增率（100%），明顯高于在曼地亞紅豆杉DNA 樣品中的有效擴增率（23.08%）。

表6 種間擴增結果統計Table 6 Statistics of interspecific amplification results

3.5 聚類分析

UPGMA 聚類分析表明，來自浙江、福建和湖南緯度較低地區的南方紅豆杉聚類在一起，而來自太行山地區的4 份樣品聚為一類（圖2）。可以看出，浙江、福建和湖南地區的南方紅豆杉親緣關系更近，而太行山地區的南方紅豆杉與上述緯度更低南方來源的南方紅豆杉親緣關系較遠。此外，在3 種緯度較低的南方地區的南方紅豆杉中，也可以看出，浙江地區和湖南地區的距離相較福建地區更近。

圖2 12 份南方紅豆杉聚類分析Fig.2 Cluster analysis of 12 samples of T. chinensis var.mairei

4 討論

隨著科技的飛速發展，高通量測序技術的出現以及更新迭代，使得利用基因組和轉錄組數據鑒定獲取SSR 標記更加方便，數量更加豐富，更加有助于進行植物種質資源鑒定及遺傳多樣性評價等方面研究。目前，已經有多種植物基于基因組和轉錄組數據挖掘鑒定出SSR 標記[7,17-19]。相較于基因組SSR，轉錄組EST-SSR 標記能更準確地鑒別植物基因型，在種間通用性更好，能準確評估種間親緣關系[20-23]。在南方紅豆杉中，也有研究人員通過轉錄組數據開發鑒定出了多個SSR 標記，并用于連鎖圖譜構建等研究[4,7]。但是，已開發的SSR 標記還不能滿足連鎖圖譜構建和遺傳分析的需要，紅豆杉SSR分子標記相關研究仍需要進一步加強。

本研究利用GA3處理的南方紅豆杉葉片轉錄組數據搜索到二核苷酸至六核苷酸重復類型的SSR位點有6 213 個，高于李炎林等[10]利用公共數據庫中南方紅豆杉根、莖、葉轉錄組數據搜索到的SSR位點數（2 160 個）。差異可能是與轉錄組數據來源、MISA 軟件檢索設置參數等不同導致，也有可能與GA3處理有關。研究表明，二、三核苷酸重復類型為植物的SSR 位點的主要類型[24-26]。易官美等[9]研究報道在南方紅豆杉中主要以二核苷酸重復類型為主，而李炎林等[10]報道則是以三核苷酸重復類型為主。此外，在武星彤[5]的研究中，南方紅豆杉SSR重復基序是以六核苷酸重復為主，其次為三核苷酸。本研究南方紅豆杉轉錄組數據分析結果顯示，三核苷酸重復基序比二核苷酸重復基序更豐富，與李炎林等[10]結果更為相似。分析原因，可能與南方紅豆杉的產地不同以及轉錄組數據和軟件設置參數等有關。從優勢重復基序來看，單核苷酸至五核苷酸分別為A/T、AG/CT、AAG/CTT、AAAG/CTTT、ATCCG/ATCGG。二、三核苷酸的優勢重復基序與前人結果較為一致[5,9-10]。

遺傳多樣性能夠體現生物遺傳信息變異的程度，群體遺傳多樣性主要由等位基因數、雜合度和多態信息含量等3 個方面體現[27]。本研究中13 對SSR 引物共有55 個位點具有多態，在12 個樣品中的Ho平均值低于He，與武星彤的結果相似，而PIC平均值為0.53，則高于武星彤[5]報道的7 個省份的南方紅豆杉PIC 數值0.453，表明本研究所檢測的4個南方紅豆杉群體的遺傳多樣性要高于武星彤所采用的南方紅豆杉群體。究其原因，推測是由于本研究中所檢測的太行山南方紅豆杉屬于目前發現的最北端的南方紅豆杉，其與福建、浙江、廣西等南方地區的生長的南方紅豆杉生長環境且表型特征都具有較大不同。此外，研究中所涉及的SSR 位點不同也有可能會造成結果的差異。盡管本研究和武星彤[5]研究中采用的群體以及樣品數量不多，但是兩者結果高度相似，也能充分表明當前人為因素對南方紅豆杉的遺傳多樣性產生不可忽略的影響。

種間擴增法被認為能有效開發近源物種新SSR位點。武星彤開發的107 個SSR 位點在5 種紅豆杉種間平均擴增率為96.07%[5]。本研究中獲得的13 對引物在東北紅豆杉DNA 樣品中擴增率達100%，但在曼地亞紅豆杉DNA 樣品中擴增率僅達23.08%。標記通用性的高低一定程度上反映物種基因組差異的大小和親緣關系的遠近[28-29]。本研究的結果說明相較于曼地亞紅豆杉，南方紅豆杉與東北紅豆杉親緣關系更近，基因組差異更小。分析原因可能有2個：一是因為曼地亞紅豆杉是歐洲紅豆杉T.baccata和東北紅豆杉的天然雜交種[30]，遺傳背景復雜；二是因為曼地亞紅豆杉不是我國本土樹種，是從外國引種而來，與南方紅豆杉的親緣關系、自然分布距離遠。因此，本研究開發的SSR 引物可用于紅豆杉種間親緣關系鑒定、系統發育等研究。

研究中所獲得13 對SSR 多態性引物，將12 個不同地區的南方紅豆杉進行了很好的聚類，聚類結果與其實際來源地較為一致。來自太行山的4 個樣品明顯聚為一類，與其他南方地區的紅豆杉可以得以顯著區分。可見，本研究所開發的SSR 引物能夠用于后續南方紅豆杉遺傳多樣性分析及遺傳結構分析等研究。

綜上所述，本研究結果表明通過南方紅豆杉轉錄組數據開發SSR 標記切實可行，鑒定篩選出的13對SSR 引物為南方紅豆杉的遺傳多樣性分析提供了候選標記。隨著紅豆杉基因組的發表[31-32]以及更多轉錄組數據的公布，將會有更多的與功能基因相關的SSR 位點被開發，例如與紫杉醇生物合成相關的SSR 位點，希望今后研究人員可以基于此，在今后的研究中充分利用SSR 分子標記技術，并對紅豆杉的群體遺傳、遺傳圖譜構建和譜系地理等諸多方面進行更加深入的研究，這些都將為未來的紅豆杉分子育種提供幫助。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突