艾納香特選種質組培特性及克隆后代L-龍腦含量比較研究

諶婉赟 ，黃 梅，于福來，羅雪婷, ，楊躍生，黎行飛，陳振夏，黎玉蘭，龐玉新，陳曉鷺*，劉育辰*

1. 貴州中醫藥大學藥學院，貴州 貴陽 550025

2. 中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所/農業農村部中藥材生物學與栽培重點實驗室/海南省艾納香工程技術研究中心，海南 海口 571101

3. 云南農業大學熱帶作物學院，云南 普洱 665000

4. 華南農業大學生命科學學院，廣東 廣州 524000

艾納香Blumeabalsamifera(L.) DC.是艾片（L-龍腦）的基原植物[1]，主要含揮發油等多種成分，其具有祛風除濕、溫中止瀉、活血解毒的等功效，同時有多種生理活性[2-10]。目前艾納香缺乏穩定遺傳的良種良苗，原因在于個體變異豐富且易受環境影響[11-14]。組織培養屬于無性繁殖技術，在人工環境中，組培后代能排除種子繁殖的實生苗性狀分離和環境因素影響，是快速繁殖種苗和保留良種優勢的高效途徑，并為優質種苗的種質保存、快速擴繁以及后期再生研究提供充足的材料[15-17]。艾納香一般種質的組培技術研究較多，主要以帶腋芽莖段為外植體，采用MS 或1/2MS 培養基，誘導其增殖、生根、煉苗及移栽[18-20]。以上均為普適性研究，未有針對特選種質開展研究。根據Yuan等[5]發現艾納香嫩葉L-龍腦含量高，成熟葉含量下降并趨于平穩，且功能葉生物量最大，因此本研究選擇采克隆苗后代的功能葉進行化學測定；此外，基于黃梅等[21]發現艾納香植株在苗期時L-龍腦含量非常低，不具采收價值，此后隨植株成長，L-龍腦含量升高至較穩定水平，因此比較苗齡較短的克隆苗后代可能不足以準確反映克隆后代植株長大后的化學特性。為更準確反映克隆后代植株接近采收期狀態時的龍腦含量，本研究對克隆苗后代移栽338 d 后測定。利用GC-MS 技術研究艾納香化學成分已經成熟[22-25]，為本研究測定L-龍腦含量的實驗設計、培養和采樣提供了基礎資料和技術參考。

本團隊前期對自建艾納香種質資源圃中的種質母株單株進行初篩，發現不同單株間L-龍腦含量存在差異，但由于每份種質資源都只有1 棵母株單株，因此無法判斷其L-龍腦含量的高低差異是遺傳因素差異造成的，還是個體受到外界環境差異影響造成的[13,26]。因此，本研究選擇3 個L-龍腦含量（低、中、高）具有代表性的種質母株比較組培特性差異，得到克隆苗后代，利用GC-MS技術比較不同種質母株及克隆苗后代L-龍腦含量，對特選種質和配套組培技術的研究有望達到促進產業發展的目的。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890B-5977A 型氣相色譜質譜聯用儀（美國Agilent 公司）；ME104E/02 型電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；Thermo scientific/Forma88400V 型超低溫冰箱（建發廣州有限公司）；Conviron/PGC20 型人工氣候箱（建發廣州有限公司）；MS 培養基（北京索萊寶科技有限公司， 批號 720F031 ）； 6- 芐氨基嘌呤（ 6-benzylaminopurine，6-BA）（北京索萊寶科技有限公司，批號721W051）；萘乙酸（1-naphthaleneacetic acid，NAA）（北京索萊寶科技有限公司，批號1231P033）；胺鮮酯（diethyl aminoethyl hexanoate，DA-6）（廣東植物龍生物技術股份有限公司，批號HNP44089-E0629）；肌醇（北京索萊寶科技有限公司，批號1217J042）；維生素C（北京索萊寶科技有限公司，批號906L035）；醋酸乙酯（上海安譜實驗科技股份有限公司，批號Z3660432）；水楊酸甲酯（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號A2211103）；L-龍腦對照品（阿發埃莎化學有限公司，批號10233613），質量分數大于98%。

1.2 試驗材料

艾納香3 個種質二年生母株露天保存在海南省儋州市中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所艾納香種質資源圃中，經中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所于福來研究員鑒定為菊科艾納香屬植物艾納香B.balsamifera(L.)DC.，統一水肥管理。基于前期研究[13,26]篩選L-龍腦含量分別為低、中、高的3 個種質（L、M、H），每個種質單株于同一位置摘取9 片功能葉，分3組為3 個重復，陰干7 d 后保存在-80 ℃超低溫冰箱中待測。

克隆后代為3 個特選種質經離體保存后取得無菌苗，經組培擴繁、煉苗、移栽后種植在花盆中，在人工氣候箱中培養，統一光溫水肥管理。煉苗338 d 后，每個種質選9 株長勢一致、健康無病蟲害的植株，于同一位置摘取1 片功能葉，共9 片，分3組為3 個重復，陰干7 d 后保存在-80 ℃超低溫冰箱中待測。

2 方法

2.1 外植體消毒

取健壯艾納香帶芽莖，清洗后用1%次氯酸鈉溶液浸泡15 min，無菌水沖洗5 次，切除片葉，將其分段為1～2 cm 的帶腋芽莖段，作為外植體。

2.2 初代培養

將得到的艾納香外植體接種到添加6-BA 2.0 mg/L、NAA 0.3 mg/L、肌醇20 mg/L、維生素C 10 mg/L、蔗糖30 g/L、瓊脂6 g/L、pH 6.2 的MS 培養基中啟動誘導，培養30 d。培養條件：25 ℃，12 h光周期，光照強度1 000～1 500 lx（以下組培試驗培養條件一致）。

2.3 艾納香3 個種質在添加不同質量濃度6-BA 的MS 培養基中不定芽增殖效率比較

將初代培養得到的再生苗，切成1～2 cm 的帶腋芽莖段，接種到含NAA 0.3 mg/L、肌醇20 mg/L、維生素C 10 mg/L、蔗糖30 g/L、瓊脂6 g/L、pH 6.2、添加不同質量濃度6-BA（0、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/L）的MS 培養基中。每個濃度接種20 瓶，每瓶接種4 個，培養30 d 后統計總芽數、芽長、單位外植體芽數。

單位外植體芽數＝總芽數/總外植體數

2.4 艾納香3 個種質在添加不同質量濃度NAA 的MS 培養基中不定芽生根效率比較

從組培苗上切下2 cm 長的單個芽條，接種到含肌醇20 mg/L、維生素C 10 mg/L、蔗糖30 g/L、瓊脂6 g/L、pH 6.2、添加不同質量濃度NAA（0、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L）的MS 培養基中。每個濃度接種20 瓶，每瓶接種1 個，培養30 d 后統計總根數、平均根數、根長、株高。

2.5 艾納香3 個種質在添加不同質量濃度DA-6 的MS 培養基中不定芽生根效率比較

將繼代增殖得到的組培苗切成2 cm 長的單個芽條，接種到含NAA（“2.4”項所得最佳濃度）、肌醇20 mg/L、維生素C 10 mg/L、蔗糖30 g/L、瓊脂6 g/L、pH 6.2、添加不同質量濃度DA-6（0、0.08、0.16、0.32 mg/L）的MS 培養基中。每個質量濃度接種20 瓶，每瓶接種1 個，培養30 d 后統計總根數、平均根數、根長、株高。

2.6 煉苗及移栽

選擇長勢一致、健壯的艾納香3 個種質組培苗，移栽到花盆中，培養338 d。培養條件：白天23 ℃，夜晚18 ℃，12 h 光周期，光照強度 29 000 lx。

2.7 艾納香3 個種質母株與克隆苗后代葉L-龍腦含量測定[25]

2.7.1 GC-MS 檢測條件 色譜柱為安捷倫CycloSil-B（30 m×0.25 mm×0.25 μm）毛細管柱，質譜條件：EI 源，溶劑延遲6 min，離子源溫度230 ℃，進樣口溫度220 ℃，掃描范圍m/z45～500。

2.7.2 供試品溶液的制備 精密稱取水楊酸甲酯100 mg，置100 mL 量瓶中，加入醋酸乙酯定容，搖勻，制成質量濃度為1.016 mg/mL 的內標溶液。取艾納香葉片，加入液氮快速研磨，精密稱定粉末0.2 g，加入醋酸乙酯2.5 mL，稱定質量，超聲提取30 min。放冷，稱定質量，醋酸乙酯補足減失的質量，搖勻，濾過，取1 mL 續濾液置10 mL 量瓶中，加入內標溶液1 mL，醋酸乙酯定容，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.7.3 對照品溶液的制備 精密稱取L-龍腦對照品適量，加入醋酸乙酯溶解并定容，制成質量濃度為0.998 mg/mL 對照品儲備液。

2.7.4 標準曲線的繪制 精密量取對照品儲備液0.1、0.2、0.5、0.7、1、2 mL，分別置10 mL 量瓶中，加入1 mL 內標溶液，醋酸乙酯定容，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過，以對照品質量濃度為橫坐標（X），對照品與內標物水楊酸甲酯的峰面積比為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得到線性回歸方程Y＝61.586X＋0.887 8，R2＝0.999 2，線性范圍為0.010 1～0.202 0 mg/mL。

2.8 數據處理

用 SPSS 21.0 軟件計算均值和方差，用Duncan’s 法進行單因素方差分析（One-way-ANOVA），以P＜0.05 表示差異具有顯著性。

3 結果與分析

3.1 艾納香3 個種質在添加不同質量濃度6-BA 的MS 培養基中不定芽增殖效率比較

從表1 和圖1 中可以看出，不同質量濃度的6-BA 對3 個種質增殖有顯著影響。首先，從單位外植體芽數上看，當6-BA 為1.5 mg/L 時，3 個種質（L：4.54±0.67，M：4.41±0.71，H：4.00±0.65）均顯著高于其他組，此條件下3 個種質間差異不顯著；當6-BA 為0 mg/L 時，單位外植體芽數最低，雖然原有的芽點仍可以繼續生長，但不會增殖出新的芽；當6-BA 為1.0～3.0 mg/L 時，有明顯促進增殖的作用；隨6-BA 質量濃度的增加，單位外植體芽數先增加后降低，在質量濃度為1.5 mg/L 時達到峰值，在3.0 mg/L 時顯著降低，說明添加適量6-BA對于艾納香增殖是必須的，但過高反而會產生抑制作用。

圖1 艾納香3 個種質在添加不同質量濃度6-BA 的MS 培養基中不定芽增殖效率比較Fig.1 Comparison of adventitious bud proliferation efficiency of three germplasms of B. balsamifera in MS medium supplemented with different concentrations of 6-BA

表1 艾納香3 個種質在添加不同質量濃度6-BA 的MS 培養基中不定芽增殖效率比較Table 1 Comparison of adventitious bud proliferation efficiency of three germplasms of B. balsamifera in MS medium supplemented with different concentrations of 6-BA

其次，從芽長上看，當6-BA 為1.5 mg/L 時，3 個種質[L：（2.02±0.22）cm，M：（2.07±0.12）cm，H：（1.88±0.12）cm]均顯著高于其他組；當6-BA 為2.0 mg/L 甚至更高時，芽長隨6-BA 質量濃度的增高逐漸降低，在質量濃度為3 mg/L 時芽生長受到明顯抑制，繼代后逐漸死亡。因此，選擇適合質量濃度的6-BA 是十分有必要的。綜合看，當6-BA 為1.5 mg/L 時效果最佳，3 個種質組培苗單位外植體芽數及芽長均達到最高，植株鮮綠、茁壯。

3.2 艾納香3 個種質在添加不同質量濃度NAA 的MS 培養基中生長效果比較

結合表2 和圖2 可以看出，不同濃度NAA 對3 個種質生根有顯著影響。首先，從生根數上看，當NAA 為0.3 mg/L 時，3 個種質[L：（25.25±4.39）條/棵，M：（28.60±1.64）條/棵，H：（20.55±2.07）條/棵）均顯著高于其他組；當NAA 在0.2～0.5 mg/L 時，能顯著增加生根數，并且隨NAA 質量濃度的升高，生根數先增加后減少，在0.3 mg/L時達到最高，0.5 mg/L 時顯著降低；當NAA 為0 mg/L 時，生根數最低，雖然不添加NAA 仍可以萌發出根，但根的數量極少，煉苗、移栽階段均會受到抑制。

圖2 艾納香3 個種質在添加不同質量濃度NAA 的MS 培養基中生長效果比較Fig.2 Comparison of growing effects of three germplasms of B. balsamifera in MS medium supplemented with different concentrations of NAA

表2 艾納香3 個種質在添加不同質量濃度NAA 的MS 培養基中生長效果比較Table 2 Comparison of growing effects of three germplasms of B. balsamifera in MS medium supplemented with different concentrations of NAA

從根長上看，當NAA 質量濃度為0 mg/L 時，3 個種質[L：（4.86±0.23）cm，M：（4.65±0.37）cm，H：（4.06±0.23 cm）]均顯著高于其他組；其次為0.3 mg/L 時；當NAA 添加在0.2～0.5 mg/L 時，根長隨NAA 質量濃度的增加逐漸升高后降低，在0.5 mg/L 時降至最低。

從株高上看，當NAA 為0.3 mg/L 時，其中2個種質[L：（3.22±0.43）cm，H：（3.08±0.17 cm）]顯著高于其他組，M 種質在0、0.3 mg/L 時沒有顯著差異，但總的來看，NAA 在0～0.3 mg/L 內時，株高顯著增加，且在0.3 mg/L 時促進作用最明顯；當NAA 為0.5 mg/L 時，株高顯著降低。

綜合看，當NAA 在0.2～0.5 mg/L 時，對3 個種質生根數均有促進作用，其中0.3 mg/L 時生根數最多，在不添加NAA 的情況下，根長相對其他組較長，但生根數極少，當NAA 在0～0.3 mg/L 內時，均能使植株增高，但0.3 mg/L 時株高達到最高。結果表明較低質量濃度的NAA 促進植株生長，較高濃度則抑制其生長。因此，NAA 為0.3 mg/L 時效果最佳。

3.3 艾納香3 個種質在添加不同質量濃度DA-6 的MS 培養基中生長效果比較

在“3.2”項得到3 個種質NAA 最適質量濃度為0.3 mg/L，結合表3 和圖3，說明添加不同質量濃度的DA-6 可以提升植株生根數、根長及株高。從生根數上看，當DA-6 為0.16 mg/L 時，3 個種質[L：（29.80±2.80）條/棵，M：（30.20±2.03）條/棵，H：（29.90±2.30）條/棵]均顯著高于其他組；生根數隨DA-6 質量濃度的升高先增加后降低，在0.32 mg/L時降至最低；當DA-6 為0 mg/L，生根數較0.08、0.16 mg/L 時顯著較低，說明添加較低質量濃度的DA-6 和NAA 時生根數要比只添加NAA 的效果更好。

圖3 艾納香3 個種質在添加不同質量濃度DA-6 的MS 培養基中生長效果比較Fig.3 Comparison of growing effects of three germplasms of B. balsamifera in MS medium supplemented with different concentrations of DA-6

表3 艾納香3 個種質在添加不同濃度DA-6 的MS 培養基中生長效果比較Table 3 Comparison of growing effects of three germplasms of B. balsamifera in MS medium supplemented with different concentrations of DA-6

從根長上看，當DA-6 為0.16 mg/L 時，3 個種質[L：（2.44±0.20）cm，M：（2.33±0.16）cm，H：（2.24±0.20）cm]均顯著高于其他組；當DA-6為0、0.08 mg/L 時，根長沒有顯著差異，可能是DA-6 質量濃度較低，生根效果不如較高質量濃度好；根長隨DA-6 質量濃度的升高先增加后降低，在0.32 mg/L 時降至最低。

從株高上看，當DA-6 為0.16 mg/L 時，其中2個種質[L：（3.46±0.27）cm，M：（3.17±0.21）cm]顯著高于其他組，H 種質在DA-6 為0.08、0.16 mg/L時沒有顯著差異，總的來看，DA-6 為0.16 mg/L 時對株高促進作用最明顯；當質量濃度達到0.32 mg/L時，株高顯著降低；當不添加DA-6 時，株高顯著低于添加低質量濃度DA-6 的植株。

綜上，當DA-6 在0.08～0.16 mg/L 時，能顯著提升3 個種質生長效果，當DA-6 為0.16 mg/L 時效果最佳，此時植株的生根數、根長以及株高均顯著增加。

3.4 艾納香3 個種質母株與克隆苗后代葉L-龍腦含量比較

對3 個母株單株完成組培擴繁后，煉苗移栽后得到克隆苗后代，觀察結果顯示植株外觀差異較小（圖4）。按照“2.7.1”項下進樣，得到3 個種質母株與克隆苗后代葉提取物總離子色譜圖（圖5），經計算后得相應的L-龍腦含量結果（圖6），結果顯示：母株間與克隆苗后代間L-龍腦含量有顯著差異，母株H 種質L-龍腦含量[（9.12±0.45）mg/g]顯著高于M[（5.11±0.31）mg/g]和L[（3.30±0.32）mg/g]，克隆苗后代H 種質L-龍腦含量[（7.28±0.34）mg/g]顯著高于M[（5.71±0.38）mg/g]和L[（4.41±0.40）mg/g]。

圖4 艾納香3 個種質克隆苗后代煉苗及移栽過程Fig.4 Process of refining and transplanting the cloned progeny of three B. balsamifera germplasms

圖5 艾納香3 個種質母株與克隆苗后代葉提取物總離子色譜圖Fig.5 Total ion chromatogram of leaf extracts from mother plants and cloned progeny of three B. balsamifera germplasms

圖6 艾納香3 個種質母株 (A) 與克隆苗后代 (B) L-龍腦含量比較Fig.6 Comparison of L-borneol content between mother plant (A) and cloned progeny (B) of three B. balsamifera germplasms

4 討論

4.1 艾納香3 個種質在添加不同質量濃度6-BA 的MS 培養基中不定芽增殖效率比較

植物生長調節劑是培養基中的關鍵性物質，根據組織培養的目的、外植體的種類、器官的不同和生長表現來確定植物生長劑的種類、濃度和比例關系，對植物組織培養起著決定性作用[24]。唐松等[18]以艾納香幼莖段為外植體，得到最佳增殖培養基為MS＋6-BA 2.5 mg/L＋NAA 0.3 mg/L，最佳生根培養基為1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L；楊仕冠等[19]研究顯示艾納香莖段最佳增殖培養基為MS＋6-BA 1.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L，且增殖率隨6-BA 質量濃度的增加而增高；肖永鋒[26]研究表明艾納香增殖培養基中添加6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.05 mg/L 時效果最佳，增殖系數達到3.91，生根培養基中添加0.1 mg/L NAA 時效果最佳，平均每個幼苗可長3.78 條根。前人研究6-BA 用于增殖時質量濃度在1.5～2.5 mg/L 內，本研究結果顯示6-BA 為1.5 mg/L 時，艾納香3 個種質從單位外植體芽數和芽長上看，均顯著提高，與之前研究相比顯著增加。NAA 與DA-6 在增殖培養基中也起著重要作用，通過以上研究得到艾納香3 個種質最佳增殖的培養基為MS＋6-BA 1.5 mg/L＋NAA 0.3 mg/L＋DA-6 0.16 mg/L＋維生素C 10 mg/L＋肌醇20 mg/L＋蔗糖30 g/L＋瓊脂6 g/L。

4.2 艾納香3 個種質在添加不同質量濃度NAA 與DA-6 的MS 培養基中生長效率比較

研究表明NAA 在0.1～0.5 mg/L 時對艾納香生根有促進作用[18-19,26]，本研究結果顯示NAA 濃度為0.2、0.3 mg/L 時均可顯著促進3 個種質生根效果，其中NAA 為0 mg/L 時根長顯著高于其他組，但生根數顯著降低，根數量較少植株煉苗移栽后逐漸死亡，株高偏低會使植株發育遲緩，進而影響藥用成分的有效利用。綜合比較，當NAA 為0.3 mg/L 時為最適生長濃度。與前人研究有所不同的是，本研究初次在艾納香組培中引入植物生長調節劑DA-6，此前研究發現其能顯著促進菊科植物紫錐菊再生芽的生長[27-28]，還能促進微藻生長[29]。本研究結果也反映：培養基中添加DA-6 對3 個種質組培苗生長有顯著影響，當添加DA-6 0.08、0.16 mg/L 時，生根數、根長和株高都高于只添加NAA 的處理組，但DA-6 濃度過高時也會抑制生根。因此當MS 培養基中同時添加NAA 0.3 mg/L 和DA-6 0.16 mg/L時，生根效果最佳。前人研究還表明添加NAA 艾納香生根數大致為12～18 條/棵[18-19]，而本研究引入DA-6 優化后生根數近乎翻倍，最高達到30 條/棵，表明DA-6 在艾納香生根培養基中是十分必要的。因此，最適合艾納香3 個種質生根的培養基為MS＋NAA 0.3 mg/L＋DA-6 0.16 mg/L＋維生素C 10 mg/L＋肌醇20 mg/L＋蔗糖30 g/L＋瓊脂6 g/L。

4.3 艾納香3 個種質母株與克隆苗后代葉L-龍腦含量比較

本研究通過完善培養基并獲得克隆苗后代群體，再利用GC-MS 分析技術分別對艾納香3 個種質母株單株、克隆后代群體L-龍腦含量進行比較，調查3 個種質母株的L-龍腦含量是否由遺傳因素決定，篩除可能外因導致其升高的單株。結果顯示，艾納香3 個特選種質母株單株的L-龍腦含量差異顯著，通過組培克隆、增殖、誘導生根、煉苗、移栽后3 個種質的克隆苗后代L-龍腦含量也呈現一致的低、中、高顯著差異，與母株L-龍腦含量規律一致，即確定了所選的3 個種質母株單株的L-龍腦含量高低差異規律是由遺傳因素決定的，H 種質高含量得以存續。

其中，L 種質母株的L-龍腦含量明顯低于克隆苗后代，M 種質母株L-龍腦含量與克隆苗后代差異不顯著，而H 種質母株L-龍腦含量明顯高于克隆苗后代，存在這種差異的原因主要有2 方面：一是母株受到生物和環境干擾較大。野外艾納香種群既有種子繁殖又有孽生苗無性繁殖，無法確定野外資源中的多棵植株是否為同一種質，因此每個種質只收集一棵。收集到資源圃中的單株受到病蟲害、光照和土壤等因素影響，導致母株中L-龍腦的積累被促進或抑制，缺乏植株間的生物學重復使個體差異中非遺傳因素無法排除。相比之下，通過組培克隆獲得的多棵具有一致遺傳背景的植株，克隆苗后代無病蟲害，在統一的光、溫、水、肥、基質條件下培養，排除了個體差異和環境差異的影響，因此更能準確地反映不同種質間的差異。二是母株與克隆苗后代的株齡不同。研究表明，植株的L-龍腦含量隨著株齡的變化而變化[21]。因此，僅比較單個種質的母株和對應的克隆后代缺乏可比性，因為株齡不同，高含量母株的克隆后代在苗期仍然具有較低的含量。為排除株齡差異帶來的干擾，本研究選擇了3 種含量不同的母株，同時獲得克隆苗，同時種植，相互作為對照。總之，克隆后代中既存在高于母株的情況，也存在低于母株的情況，這是正常的現象，母株的L-龍腦含量是基因和環境共同作用的結果，而克隆苗后代由于增加了生物學重復并排除了生物和環境影響，其L-龍腦含量更準確地體現了種質特性。

本研究得到了具有推廣前景的艾納香優良種質H，可通過無性繁殖獲得優良種苗和保持遺傳優勢，并建立了能夠保持特選種質優良品質遺傳穩定性的高效組培技術，有望對特選種質及其配套組培技術進行推廣，具有良好的產業前景。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突