代謝組學前沿技術進展及在中藥現代研究中的應用

劉慧敏，張 悅，王佳藝，聶嘉璇，宋麗麗，李遇伯

天津中醫(yī)藥大學中藥學院，天津 301600

代謝組學是繼基因組學、轉錄組學和蛋白組學發(fā)展起來的一門新興組學技術，可以對機體內的小分子物質進行捕捉[1]；同時代謝組學作為系統生物學的重要組成部分，具有整體性和動態(tài)性的特點，可以探究整個機體的生理和病理變化[2]。

中藥因其治療效果好、不良反應小等被廣泛用于各種疾病的治療[3]，同時在預防和保健方面都有著卓越的貢獻[4]，中藥的“多組分”能夠作用于“多靶點”協同發(fā)揮治療作用[5]，因此普通分析方法很難全面分析中藥的藥效和毒性機制。代謝組學“整體性、動態(tài)性、綜合性”與中藥“多組分、多靶點、多途徑”的特點不謀而和[6]，目前已利用代謝組學技術在中藥作用機制[7]、中藥安全性[8-10]、中藥化學成分[11]、中藥鑒定[12]等中藥相關領域進行研究。但由于當前組學技術的限制，代謝組學技術檢測缺少空間維度信息，無法準確反映組織的動態(tài)代謝過程及代謝網絡[13]，因此亟需發(fā)展高分辨、高覆蓋的分析方法用于代謝組學的定性定量分析。

原位質譜、質譜成像、代謝流、單細胞代謝組學等技術的出現能夠快捷、方便、全面、深入地為中藥研究提供提示和導向，基于以上的代謝組學新技術對中藥進行快捷實時的定性分析；其次通過對內源性及外源性物質在不同組織、器官等的可視化，更直觀地分析藥物在生物體內的分布；再者，通過對生物體中代謝產物的動態(tài)跟蹤，了解代謝物在生物體內整個變化過程和流向；最后深入分析單個細胞或亞細胞層面的代謝物。上述的代謝組學前沿技術為解決中藥現代化問題提供新的研究思路，促進了代謝組學技術的創(chuàng)新與發(fā)展（圖1）。

圖1 代謝組學前沿技術Fig.1 Metabolomics frontier technologies

1 4 種代謝組學前沿技術的概述

1.1 原位質譜

Taka?ts 等[14]在2004 年發(fā)明了解吸電噴霧電離（desorption electrospray ionization，DESI）技術，開創(chuàng)了常壓敞開式離子化技術的先河，并且首先研究了DESI 質譜技術的實際應用[15]，隨著原位電離質譜技術的引入，質譜領域進入了一個新時代，原位質譜是能夠在普通樣品的原生環(huán)境中進行，不需要通過在儀器外制造離子進行預分離[16]，能夠簡化分析流程，但其準確度和精密度相對較低。目前原位質譜在中藥研究[17]、食品安全檢測[18]、癌癥研究[19]、臨床診斷[20]、法醫(yī)刑偵[21]等領域得到了廣泛應用。原位質譜實時分析不需要大量樣品的制備過程，能夠避免代謝物在進行樣品制備時發(fā)生生物反應改變其狀態(tài)，進一步擴展其適用性，實現快速的分析。但還需提高對代謝物檢測的準確性和精密度。根據所構建的離子源不同原位質譜可分為以下幾類：DESI[22]、激光燒蝕電噴霧電離[16]、紙噴霧電離（paper spray ionization，PSI）[23]、探針電噴霧電離（probe electrospray ionization，PESI）[24]、液體萃取表面分析（liquid extraction surface analysis，LESA）、實時直接電離技術（direct analysis in real time，DART）[25]、介質阻擋放電電離[26]、快速蒸發(fā)電離[27]和二次電噴霧電離（secondary electrospray ionization，SESI）[28]。原位質譜操作流程見圖2-A。

圖2 不同前沿技術操作流程Fig.2 Operation flow of different cutting-edge technologies

1.2 質譜成像

質譜成像是一種無標記的分子成像技術，能夠將質譜數據轉變?yōu)榭梢暬碾x子成像圖，無需復雜的樣品處理就能快速分析中藥和天然化合物的前景技術[29-30]，可以無靶向地檢測各種生物分子和異種生物[31]；但在絕對定量分析方面還存在一定困難；質譜成像在中藥研究[32]、病毒研究[33]、生物標志物的研究[34]、腫瘤研究[35]、法醫(yī)偵探[36]等領域已得到廣泛應用。在代謝組學的研究中，利用質譜成像可準確識別并定位多種代謝物在組織及細胞間的差異性分布[37]，實現動物組織中外源性藥物和植物組織中內源性代謝物的可視化分析，為代謝物的轉運途徑和積累規(guī)律提供了新方法。但目前的冷凍法操作存在較長的時間間隔，使代謝物的狀態(tài)發(fā)生改變，難以進行實時快速活體分析成像，而無法準確反映組織的動態(tài)代謝過程以及代謝通路[38]。質譜成像技術根據離子源的原理不同可分為MALDI-MS、SIMS 及電噴霧電離技術[33,39]。質譜成像分析基本流程見圖2-B。

1.3 代謝流

代謝組學能夠對體內的小分子代謝物進行大規(guī)模的高通量表征，提供關于代謝物豐度的寶貴信息，但未能揭示代謝物在體內的動態(tài)變化，然而代謝物的蓄積既可能是合成途徑的激活也可能是代謝途徑的抑制[40]。代謝通量分析（metabolic flux analysis，MFA）是使用穩(wěn)定同位素示蹤的方法跟蹤動態(tài)代謝活動[41]，其綜合底物吸收及產物形成速率、生物合成、化學計量反應、中間代謝物的生物合成等[42]。目前代謝流分析在中藥[43]、腫瘤[41]、植物代謝[44]、微生物代謝[45]等方面已得到廣泛應用。代謝流技術定位于某一關鍵代謝底物或中間代謝產物，在代謝組學研究中，通過對不同狀態(tài)的生物體進行代謝流分析，監(jiān)測代謝物在特定代謝通路的活躍程度，及該種狀態(tài)對代謝通路的影響程度，但實驗成本較高且數據分析較為復雜[46-47]。代謝流分析基本流程見圖2-C。

1.4 單細胞代謝組學

細胞是生物體生命活動和形態(tài)結構的最基本單元，生物體的各種生命活動都是在細胞層次上實現的[48]。單細胞代謝組學是對生物體內相對分子質量低于1 000 且與細胞表型相關的小分子即包括中間產物在內的某些代謝物變化情況的研究[49-50]。單細胞代謝組學現已廣泛用于植物學[50]、腫瘤學[51]、神經病學[52]等的研究。在單細胞水平進行代謝物的分析，能夠對單個細胞進行精準分析，檢測代謝通路中的小分子，為代謝物的轉運途徑、代謝通路和積累規(guī)律提供了新技術和新方法；并將細胞代謝與細胞的各種生命活動聯系起來[48]。但由于單細胞體積小，代謝物種類多且含量差異大，因此在樣品的取樣和預處理上仍存在一定難度。

1.4.1 細胞分離 采樣的第1 步是從有機體中分離出適當的細胞[53]，因此通常采用梯度稀釋、FACS、微孔板、微流控陣列等技術并結合立體顯微鏡及微操作器，以實現高效的提取或解吸細胞的內容物。

1.4.2 細胞代謝物鑒定 利用MALDI-MS、ESI-MS等技術[54]對細胞代謝物進行鑒定和分析。

1.4.3 數據分析 對于單細胞代謝組學研究中所獲得的原始數據規(guī)模大且性質復雜[55]，目前單細胞代謝組學數據分析工具主要有主成分分析、線性判別分析等分析工具進行統計學分析[56]，根據分析結果與數據庫配對分析單細胞代謝產物及細胞間的差異代謝物。單細胞代謝組學分析基本流程見圖2-D。

2 4 種代謝組學前沿技術的比較

上述的4 種技術各有優(yōu)勢和缺點：（1）原位質譜的優(yōu)點是在質譜真空裝置外對復雜樣品進行直接電離，以減少提取和濃縮步驟，簡化分析流程[57]，其可依據復雜中藥樣品的實際特點，有目標的設計適用于待測樣品的上樣及離子化方式，從而實現傳統色譜-質譜聯用方法難以實現的原位、實時分析等特定場景；然而，原位質譜在實際應用中面臨著許多挑戰(zhàn)其樣品具有多樣性且基質復雜[58]，同時在目前的應用研究中，原位電離源主要是在實驗室中與大型質譜儀進行聯用，無法滿足現場實時分析的需求[59]，因此需要開發(fā)體積小巧便攜、儀器性能良好的小型質譜儀與原位電離源組成的小型分析系統。（2）質譜成像技術能夠將質譜數據轉變?yōu)榭梢暬碾x子成像圖，具有前處理簡單及結果清晰直觀的優(yōu)勢[32]。質譜成像可直觀呈現給藥前后藥物在各組織中的代謝變化，輔助探討中藥的作用機制并用于研究中藥毒性成分的分布位點，為中藥安全性研究帶來新的方向。然而在利用質譜成像達到對目標成分的絕對定量分析還存在一定的困難，質譜成像過程不涉及化合物的分離過程，因此僅憑借質譜成像無法區(qū)分化學異構體[60]。（3）代謝流分析技術的特點是與靜態(tài)代謝組學相比能夠以動態(tài)的方式探索代謝活動、揭示代謝通路的活性并且可以量化通路中的代謝通量，明確代謝前體轉化的中間代謝產物濃度[61]；其缺點在于MFA 樣品的處理及數據測定分析都非常復雜且該方法所需的質譜、核磁等實驗儀器較為昂貴，底物用同位素標記的成本也非常高[62]，且如何保持代謝物的處于穩(wěn)定狀態(tài)也是關鍵。（4）單細胞代謝組學技術能在細胞水平上進行的高通量代謝分析，獲得細胞與細胞間的代謝物，并且能結合質譜成像技術進一步洞悉單細胞內或細胞器間代謝物的差異分布[37]，幫助解決來自同一器官或集群細胞所造成的問題[54]，但由于細胞直徑較小且代謝物能快速轉化或降解且代謝物不能進行放大，因此對于樣品進行取樣和預處理是不便的；其次，單細胞中物質含量低且每個細胞的代謝物濃度差異可高達1×106～1×109倍[48]。因此要求所用檢測方法能對多種物質進行響應且不破壞細胞狀態(tài)同時具有較高靈敏度，見表1。

表1 代謝組學前沿技術的應用優(yōu)缺點Table 1 Advantages and disadvantages of application of frontier technologies in metabolomics

3 4 種代謝組學前沿技術在中藥現代研究中的應用

3.1 中藥安全性的研究

中藥逐漸走向國外市場，中藥的安全性也備受關注，傳統的藥物安全性評估方法步驟繁雜，需要耗費大量的時間和精力[63]。隨著質譜技術發(fā)展，一些代謝組學前沿技術也在中藥安全性研究中得到廣泛應用。Chen 等[64]利用DART-MS 對菊三七、千柏鼻炎顆粒、花紅顆粒制劑進行分析，表明該方法用于鑒定和分析吡咯里西啶類生物堿的可行性，比較了DART-MS 的結果與高效液相色譜質譜的結果吻合較好，且分析速度更快。Li 等[65]利用DART-MS方法研究烏頭類生物堿經過大鼠腸內菌代謝后的代謝譜，共鑒定出來自3 種烏頭類雙酯型生物堿的36種代謝產物，并且該方法還能滿足原位及代謝物的定量分析要求。與ESI-MS 和超高效液相色譜-串聯質譜相比，具有高速、高通量方法的優(yōu)點。Shi 等[66]采用高分辨成像、超高效液相色譜和高分辨率質譜法，檢測補骨脂樣品中未知化合物并鑒定其肝毒性，通過光譜-毒性相關性分析篩選出與肝毒性高度相關的有毒化合物，并通過高分辨成像驗證了這6 種化合物單體的肝毒性。Wang 等[67]采用基于氣流輔助DESI 質譜成像的原位代謝組學方法對馬兜鈴中的馬兜鈴酸I 處理大鼠腎臟切片進行分析。結果顯示，在馬兜鈴酸I 治療組中有10 種代謝物發(fā)生顯著變化且通過分析馬兜鈴酸I 治療組的圖像發(fā)現，相較于腎髓質，腎皮質的代謝物改變更為顯著表明腎皮質比髓質更容易受到馬兜鈴酸I 的影響。綜上，代謝組學前沿新技術為實現中藥中毒性成分的快速篩查及中藥毒性機制的研究提供了一種具有簡便、高速、高通量特點的方法。

3.2 中藥藥效物質及作用機制的研究

中藥藥效物質及作用機制的科學闡釋是解決制約中藥現代化發(fā)展的有效途徑，由于中藥具有多成分、多靶點的特性[68]，傳統的研究方法忽視了各藥效物質的協同作用，難以系統性辨識中藥藥效物質。王星[69]采用DART-MS 分析方法能夠快速區(qū)分出各人參樣品中所含人參皂苷的類型并對其含量進行比較，證明DART-MS 法可作為人參樣品質量評估的快速方法；Gao 等[70]利用DESI 質譜成像技術對大鼠腦中7 種鉤藤堿定量成像進行了系統研究，成功地量化了生物堿在13 個腦區(qū)的分布及不同的鉤藤生物堿在大鼠大腦中的分布趨勢。特別是首次在松果體中直接檢測到鉤藤生物堿，其在該區(qū)域的富集現象對今后的藥效學研究具有指導意義。Wang 等[71]對銀杏提取物（Ginkgobilobaextract，GBE）抗心肌梗死的機制和物質基礎進行研究，其應用MFA研究異丙腎上腺素誘導的缺血樣心肌細胞的能量代謝通量紊亂和GBE 成分的調節(jié)節(jié)點，表明GBE 的活性成分是通過挽救受損的三羧酸循環(huán)通量，保護心肌梗死。上述研究表明，代謝組學前沿技術提高中藥質量控制檢測效率，并且實現藥物的藥效物質在體內分布的可視化，及從代謝通路定位藥物的作用靶點，為進一步研究藥物的靶點、藥物代謝提供一種新穎的方法。

3.3 中藥炮制機制的研究

中藥經過炮制能夠降低藥材毒性，提升純凈度，使藥物更好地用于臨床治療，同時方便保存與儲藏，延長藥材使用時間。在炮制過程中，必然發(fā)生了復雜的化學變化。曾星星[72]通過PSI-MS 對炮制山茱萸中化學成分進行歸屬，并對其歸屬進行了驗證，發(fā)現5-羥甲基糠醛和7-α-乙氧基莫諾苷為炮制品中新增的化學成分，可作為鑒別酒蒸品與生藥材的依據。喬菲等[73]應用質譜成像技術對巴戟天不同炮制品空間分布進行數據采集，質譜成像技術實現了環(huán)烯醚萜和寡糖空間分布的可視化分析，其結果與超高效液相色譜法含量測定結果基本一致。上述研究表明，代謝組學前沿技術為快速準確鑒定中藥炮制前后化學成分變化規(guī)律及炮制后化學成分的分布變化提供一種新思路。

3.4 藥用植物代謝產物分布的研究

藥用植物的次生代謝產物具有一定的生理活性及藥理作用[74]，但次生代謝產物復雜多樣。因此，代謝產物的合成途徑、積累規(guī)律及在藥用植物中的分布等研究都具有重要意義。朱亮等[75]采用電噴霧內部萃取電離質譜技術，對大蒜中的化學組分直接快速分析，結果表明該技術可在無需樣品預處理的情況下實現大蒜組織中蒜氨酸和大蒜多糖的直接質譜分析，實現對藥用植物中的活性物質的直接快速分析。米要磊等[76]首先分析瑪咖的活性成分咪唑生物堿等的裂解規(guī)律，再通過MALDI 質譜成像定位咪唑生物堿在根橫切面的空間分布，結果表明2 種咪唑類生物堿的組織分布非常接近，均集中分布在表皮和皮層中，為藥用植物活性成分在組織中的特異性分布及其累積規(guī)律提供了重要的科學依據；任風鳴[43]利用13C 穩(wěn)定同位素標記酪氨酸培養(yǎng)毛黃堇植株，高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜檢測代謝通路中化合物的同位素標記。結果顯示，在生物堿合成通路中檢測到21 個化合物被同位素標記，標記的形式與預測通路中化合物代謝規(guī)律一致，且證實毛黃堇中脫氫卡維丁等生物堿合成上游途徑與酪氨酸途徑合成異喹啉生物堿一致。Kajiyama 等[77]采用激光微采樣和納米流液相色譜-電噴霧電離質譜相結合的方法，在單細胞基礎上對蝴蝶草花瓣細胞中花青素的相對含量進行分析，實驗表明，同一組織不同細胞的花青素代謝存在明顯差異。此方法為獲得單個植物組織中每個細胞的精確代謝譜提供了一種簡便的方法。上述研究表明，利用代謝組學前沿技術對藥用植物的次生代謝物進行分析是一種更靈敏、更高通量的分析方法，能更準確地闡明次生代謝途徑和代謝網絡調控機制。

4 結語與展望

中醫(yī)藥的應用具有悠久的歷史，在我國醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)中具有重要作用[78]，中藥的作用機制復雜，傳統一對一單靶點的研究方法已經不能滿足中藥復雜機制的研究需求[79]，上述4 種代謝組學前沿技術以獲取高質量質譜數據為基礎，結合多樣化的數據處理方法，找到與實驗目的相關的生物學信息其不僅體現代謝組學“整體性、動態(tài)性、綜合性”的特點，并且彌補了代謝組學的不足。越來越多的研究者將這些技術結合應用，以此實現對代謝物更高效、全面的研究；Zhu 等[80]建立了原位單細胞代謝物質譜檢測技術，該技術結合原位電離和單細胞代謝技術，既可以確保所取樣細胞的活性，也可以在獲得該細胞的電生理活動等信息的同時對其內代謝物組成和含量進行分析；此外，該技術與同位素標記技術相結合，可以在單細胞水平上研究標記的代謝物在神經元內的代謝路徑；質譜成像技術更是單細胞可視化分析和空間分辨代謝組學的強有力分析手段[81]。本文所總結的原位質譜、質譜成像、代謝流技術均已在中藥的研究中得到應用。由于中藥成分復雜其代謝機制復雜，而細胞內代謝物含量極低，細胞狀態(tài)的改變會影響代謝物質的種類和濃度的變化，在單細胞層面仍有大量物質無法被檢測，導致不能完整的闡釋中藥的代謝機制。因此，目前還沒有使用單細胞代謝組學技術研究中藥的文獻報道，在未來的研究中要提高質譜技術對單細胞內代謝物的檢測靈敏度，將單細胞代謝組學應用于中藥的研究中，更重要的是將幾種技術進行聯合應用，通過整合不同代謝組技術的分析策略對中藥的研究具有顯著優(yōu)勢。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突