內(nèi)鏡醫(yī)師快速現(xiàn)場評估在行免疫組織化學(xué)染色的胰腺實性病變診斷中的應(yīng)用

熊定堃 劉泳汝 馮云路 趙雨 吳晰 郭濤 蔣青偉 王強 伍東升 張晟瑜楊瑩韻 楊愛明

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100730；2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院病理科，北京 100730

作為消化內(nèi)鏡診療常規(guī)的一部分，內(nèi)鏡超聲引導(dǎo)下組織取樣（endoscopic ultrasound-guided tissue acquisition, EUS-TA）在胰腺實性病變中的價值越來越受到重視，目前已是公認安全、可靠的獲取診斷標本的重要手段[1]。根據(jù)使用的穿刺針型可將EUS-TA進一步分類為細針穿刺抽吸（fine-needle aspiration,FNA）和細針穿刺活檢（fine-needle biopsy, FNB）。相比FNB針，F(xiàn)NA針在獲取組織學(xué)評估所需的核心組織方面能力較弱，尤其是在缺乏快速現(xiàn)場評估（rapid on-site evaluation, ROSE）的情況下更是如此[2]。由細胞病理學(xué)醫(yī)師進行的ROSE可為內(nèi)鏡醫(yī)師提供實時反饋，從而提高EUS-FNA標本的充分性和準確性[3]。然而由于ROSE依賴于病理醫(yī)師在場，其實際應(yīng)用受到了限制[4-5]。目前已有經(jīng)驗表明，經(jīng)過培訓(xùn)的內(nèi)鏡醫(yī)師可以像細胞病理學(xué)醫(yī)師一樣準確地完成ROSE[3-4]。此外，使用具備斜面、切割、核心活檢等設(shè)計的FNB針進行EUS-TA可獲取更充足的標本，并減少針穿次數(shù)[5]。雖然內(nèi)鏡醫(yī)師可以通過肉眼即宏觀現(xiàn)場評估（macroscopic on-site evaluation, MOSE）[6]來判定EUS-FNB是否獲取了核心組織條，但無法同ROSE一樣區(qū)分正常組織和病變組織。并且既往評價ROSE對于EUS-TA準確性影響的研究中，大部分病例為惡性腫瘤患者，意味著ROSE涂片中可以見到明顯的異型細胞從而明確診斷[3]。而對于其他胰腺實性病變?nèi)缫认偕窠?jīng)內(nèi)分泌腫瘤（pancreatic neuroendocrine tumor, PNET）、胰腺實性假乳頭狀瘤（solid pseudopapillary tumor, SPT）、淋巴瘤及間葉源性腫瘤（包括平滑肌肉瘤、Ewing肉瘤）等，往往需要進行細胞學(xué)或組織病理的免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry, IHC）染色以明確診斷。目前對于ROSE在此類疾病中是否真正提高了EUS-TA的準確性尚無明確結(jié)論。因此，本項單中心、觀察性的回顧性研究比較了在依賴IHC染色明確診斷的胰腺實性病變中進行有或無由內(nèi)鏡醫(yī)師完成ROSE的不同類型EUS-TA的診斷效果。

資料與方法

一、一般資料

回顧性收集2018年8月至2022年10月間北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)鏡中心1 573例行EUS-TA患者的臨床資料。納入標準：（1）經(jīng)腹部超聲、CT、PET-CT或MRI證實為實性胰腺腫塊；（2）EUS-TA成功取得細胞學(xué)和（或）組織學(xué)標本；（3）6～12個月隨訪期間臨床或病理診斷明確為PNET、SPT、淋巴瘤及間葉源性腫瘤。排除標準：（1）無實性成分的胰腺囊性病變或假性囊腫者；（2）無明確臨床診斷或失訪者。最終納入65例。根據(jù)EUS-TA后內(nèi)鏡醫(yī)師進行或未進行ROSE，將患者分為ROSE組（36例）和非ROSE組（29例）；根據(jù)EUS-TA使用的針型，進一步分為FNA-ROSE組（26例）、FNB-ROSE組（10例）、FNA-非ROSE組（24例）、FNB-非ROSE組（5例）。

二、EUS引導(dǎo)下組織取樣

EUS由7名經(jīng)驗豐富的內(nèi)鏡醫(yī)師完成。采用線性陣列回聲內(nèi)鏡（GF-UCT260或GF-UCT240配備EU-ME2 Premier，日本Olympus公司）進行。EUS-TA選擇使用FNA或FNB以及具體的針型由內(nèi)鏡醫(yī)師根據(jù)其經(jīng)驗和對病灶的綜合評估（包括病灶大小、病灶位置及與周圍血管的關(guān)系）決定。FNA使用19G、22G、25G FNA針（Cook EchoTip Ultra?或Boston Scientific ExpectTM），F(xiàn)NB使用20G、22G FNB針（Cook EchoTip ProCore?或Boston Scientific AcquireTM）。

具體操作步驟：將內(nèi)鏡經(jīng)口腔插入并推進到胃或十二指腸，在識別和定位胰腺病灶后，應(yīng)用彩色多普勒以避開主要血管并確保安全，找到最佳穿刺路徑，然后經(jīng)胃或經(jīng)十二指腸（或兩者）進行穿刺活檢。取樣方法包括干抽法、濕抽法，帶或不帶負壓[7]，穿刺針在病灶內(nèi)前后移動15～20次以取得更多標本。將獲得的組織碎片均勻涂在若干張載玻片上，采用乙醇固定，將組織條固定于10%甲醛溶液中，其余樣本用于液基細胞學(xué)檢查。內(nèi)鏡醫(yī)師根據(jù)獲取的樣本量酌情決定是否進行重復(fù)穿刺。所有樣本最后均送至病理科，由經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師進一步行細胞學(xué)或組織病理學(xué)評估，必要時行IHC染色和分子生物學(xué)檢測以明確診斷。

三、ROSE操作步驟

7名內(nèi)鏡醫(yī)師均已獨立完成100例以上EUS-TA操作，或在過去12個月內(nèi)至少完成50例，且均已完成ROSE培訓(xùn)并獲得獨立閱片資格。培訓(xùn)內(nèi)容包括涂片的制片和染色技術(shù)，及ROSE閱片步驟和EUSTA涂片常見的慢性胰腺炎、自身免疫性胰腺炎、胰腺導(dǎo)管腺癌、PNET、SPT、轉(zhuǎn)移癌等胰腺細胞病理學(xué)特征。培訓(xùn)持續(xù)3個月，直到內(nèi)鏡醫(yī)師能夠熟練地獨立完成標準的ROSE并通過病理醫(yī)師的考核。

在EUS-TA成功穿刺病灶后，內(nèi)鏡醫(yī)師及助手將1張或多張取樣涂片風干，采用Diff-Quik染色法進行ROSE染色，隨后在床旁的光學(xué)顯微鏡下檢查是否存在異常細胞，同時評估穿刺取樣是否滿意或是否需要繼續(xù)穿刺取樣。在EUS-TA操作結(jié)束后，ROSE涂片與其他活檢標本一同送至病理科，由病理醫(yī)師進一步行細胞病理學(xué)診斷。

四、IHC染色

病理醫(yī)師對包含ROSE涂片的所有活檢標本完成評估，根據(jù)細胞病理學(xué)、組織病理學(xué)表現(xiàn)進一步進行IHC染色明確診斷。對疑似自身免疫性胰腺炎的切片用IgG4、CD38和CD138染色；疑似PNET的切片用CgA、Syn和CD56染色；疑似間質(zhì)瘤的切片用c-kit、CD34、DOG-1、α-SMA、Desmin和S-100染色；疑似淋巴瘤的切片用CD3、CD5、CD19、CD20、CD22、CD30、CD45RO、CD79a、PAX5和BCL2染色。

五、觀察指標

記錄患者的性別、年齡；EUS-TA前實驗室檢查結(jié)果包括膽紅素、CA19-9水平；影像學(xué)檢查結(jié)果包括病灶部位、病灶大小；EUS-TA數(shù)據(jù)包括病灶大小、穿刺針類型、針徑、穿刺點位置和穿刺針道數(shù)）；病理學(xué)常規(guī)及ROSE涂片、液基細胞學(xué)、組織病理學(xué)；隨訪結(jié)局。

六、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗或Mann-WhitneyU檢驗；計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。使用二項logistic多因素回歸分析ROSE及穿刺類型對診斷準確性和IHC成功率的影響。診斷準確率的計算方法為比較EUS-TA的細胞學(xué)或組織病理學(xué)診斷與最終診斷（包括病理診斷、隨訪及治療結(jié)局）之間的一致性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組患者臨床特征比較

65例患者中，46例（70.8%）為PNET，13例為SPT，6例為淋巴瘤及間葉源性腫瘤。病變多位于胰頭、胰頸和鉤突部（47/65，72.3%）。21.5%（14/65）的患者接受了手術(shù)治療并確診，其余患者均通過EUS-TA明確病理診斷或經(jīng)過治療與隨訪達到臨床診斷。各組患者性別、年齡、直接膽紅素、總膽紅素、CA19-9及CT或MRI下病灶部位、病灶大小等臨床特征差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性（表1）。ROSE組和非ROSE組，F(xiàn)NA-ROSE組和FNA-非ROSE組、FNB-ROSE組和FNB-非ROSE組患者的EUS病灶平均大小以及穿刺針徑、穿刺點位置、穿刺針道數(shù)的差異亦均無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

表1 不同類型內(nèi)鏡超聲引導(dǎo)下組織取樣及快速現(xiàn)場評估分組患者的臨床特征

二、應(yīng)用ROSE對診斷準確率和IHC成功率的影響

與非ROSE組比較，ROSE組有更高的診斷準確率（88.9%比79.3%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.023），但兩組的IHC成功率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.100）。在FNA-ROSE組和FNA-非ROSE組、FNB-ROSE組和FNB-非ROSE組之間進行亞組分析，未觀察到應(yīng)用ROSE對于診斷準確性和IHC成功率存在顯著影響。FNA-ROSE組較FNA-非ROSE組表現(xiàn)出更高的診斷準確率（88.5%比75.0%），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.100）。FNB-ROSE組和FNB-非ROSE組間診斷準確率及IHC成功率差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

表2 不同類型內(nèi)鏡超聲引導(dǎo)下組織取樣及快速現(xiàn)場評估的診斷準確率及免疫組織化學(xué)成功率（%）

進一步采用二項logistic回歸將是否行ROSE、使用的針型（FNA或FNB）、最終診斷納入多因素分析，沒有發(fā)現(xiàn)影響診斷準確率的獨立因素（表3）。

表3 影響診斷準確性的二項logistic多因素回歸分析

討 論

筆者所在的內(nèi)鏡中心是國內(nèi)最大的內(nèi)鏡中心之一，率先開展了內(nèi)鏡醫(yī)師實施ROSE的EUS-TA操作。本研究回溯了超過5年的病例資料，并聚焦于依賴病理切片IHC染色鑒別診斷的罕見病變，比較了ROSE在不同EUS-TA類型中的診斷準確率，旨在評估ROSE在此類疾病診斷中的有效性。

本研究結(jié)果表明，內(nèi)鏡醫(yī)師完成的ROSE可以提高EUS-TA的診斷準確性。但由于本研究涉及的疾病種類的罕見性及細胞病理學(xué)特征，納入的病例中不存在假陰性及假陽性結(jié)果，因此未計算分析靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值等指標。既往的研究顯示，ROSE可將EUS-TA的診斷能力提高約15%[8-9]，本研究表明ROSE可將EUS-TA的診斷準確率提高至接近90%。

理論上，ROSE是提高EUS-FNA診斷胰腺實性腫塊準確性和敏感性的理想輔助方法，不僅可以優(yōu)化穿刺策略，實時評估樣本質(zhì)量和數(shù)量，而且可以在操作同時作出初步的診斷，能最大限度地減少穿刺針道數(shù)，減少重復(fù)取樣，因此被歐洲消化內(nèi)鏡學(xué)會（European Society of Gastrointestinal Endoscopy，

ESGE）推薦使用[10]。然而，由于需要病理醫(yī)師的協(xié)助，ROSE的推廣在醫(yī)療資源緊缺的國家和地區(qū)受到了限制。基于此，筆者所在中心通過由內(nèi)鏡醫(yī)師開展ROSE為這一問題提出了解決方案。結(jié)果顯示，EUS-TA同時行ROSE使依賴IHC染色明確診斷的胰腺實性病變的診斷準確率提高了9.6%。類似地，Zhang等[3]的研究證實了內(nèi)鏡醫(yī)師的ROSE與病理醫(yī)師對標本進行細胞病理學(xué)評估的結(jié)果高度一致，并且內(nèi)鏡醫(yī)師的ROSE提高了24.7%的準確率。與既往研究中觀察到ROSE能減少穿刺針道數(shù)不同，本研究顯示ROSE組與非ROSE組的穿刺針道數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，由于回顧例數(shù)較少，這一結(jié)果值得進一步觀察驗證。在既往的研究中，絕大多數(shù)病例的診斷為惡性腫瘤，病變在ROSE涂片中可見明顯的異型細胞。本研究所涉及依賴IHC染色進行診斷的胰腺實性病變在ROSE的Diff-Quick染色下的表現(xiàn)特征為（1）PNET，腫瘤細胞呈帶狀或小梁狀排列，細胞有豐富的顆粒狀胞質(zhì)和大小一致的圓形或卵圓形核；（2）SPT，腫瘤細胞呈分支乳頭狀排列，大小一致的細胞組成微腺泡結(jié)構(gòu)，腺腔狀結(jié)構(gòu)內(nèi)可見玻璃樣小體；（3）淋巴瘤，散在分布單一類型的淋巴細胞，可見雙核細胞；（4）間葉源性腫瘤，細胞大小一致，核卵圓形或梭形。因此，目前已有的研究是否能夠反映ROSE在PNET等疾病中的價值仍存在疑問。本研究發(fā)現(xiàn)ROSE對于提高EUS-TA對該類疾病的診斷準確性具有潛在價值，并且這種作用可能不受FNA或FNB針型的影響。但由于疾病的罕見以及本研究內(nèi)鏡醫(yī)師的ROSE開展時間較短，可納入的樣本量受限，最終結(jié)果仍需更大樣本量的多中心前瞻性研究驗證。

目前已有較多研究表明，對于依賴IHC染色進行診斷的胰腺實性病變，EUS-FNB相較EUS-FNA具有更高的診斷準確率和IHC成功率[11-13]。但本研究中未能觀察到這樣的差異，可能由于使用FNB針型的病例數(shù)明顯少于FNA針型，存在樣本的選擇偏倚，也一定程度上解釋了在總體和亞組分析時ROSE對診斷準確率影響作用的不一致。盡管存在樣本量和針型的限制，本研究率先比較了EUS-TA在有無內(nèi)鏡醫(yī)師實施ROSE情況下診斷PNET等需要IHC染色鑒別的胰腺實性病變的準確性，初步提示了ROSE在此類疾病診斷中的臨床應(yīng)用價值，后續(xù)可通過前瞻性多中心臨床研究進一步驗證。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明熊定堃：數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，文章撰寫；劉泳汝：數(shù)據(jù)整理、論文審閱；馮云路：研究設(shè)計、研究指導(dǎo)、論文審閱；趙雨：研究指導(dǎo)、病理閱片、ROSE培訓(xùn)；吳晰、郭濤、蔣青偉、王強、伍東升、張晟瑜、楊瑩韻：研究開展，數(shù)據(jù)收集；楊愛明：研究設(shè)計、研究指導(dǎo)、經(jīng)費支持