基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究“葫蘆巴-迷迭香”提取物治療Ⅱ型糖尿病的潛在作用機(jī)制及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證*

張彥昕，柴貝貝，石玉節(jié)，李海利

(1.鄭州賽科藥業(yè)科技有限公司，河南 鄭州 450000；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450000)

近年來，全世界范圍內(nèi)糖尿病的患病率約為10%，糖尿病是一種表現(xiàn)為高血糖的代謝病，由胰島素分泌異常、胰島素抵抗或這兩種因素共同導(dǎo)致，其中Ⅱ型糖尿病(T2DM)高達(dá)90%。發(fā)展到一定程度可以出現(xiàn)許多并發(fā)癥[1]，作為全球流行病，T2DM對世界各國人民健康造成極大危害[2]，被評為世界第四大易致死性疾病。

葫蘆巴是豆科屬的一種草本植物，又名胡盧巴，具有多種生物功效，中醫(yī)常用于溫腎補(bǔ)陽、祛寒止痛。近幾年有研究發(fā)現(xiàn)葫蘆巴堿與胰島素分泌、參與糖代謝過程酶的活性、體內(nèi)活性氧、神經(jīng)元興奮性等密切相關(guān)[3]，盧芙蓉等[4]探究葫蘆巴總皂苷可以抑制鏈脲佐霉素誘導(dǎo)大鼠血小板聚集和血小板活化同時(shí)可以降低血糖升高胰島素水平。葫蘆巴的種子有助于降低食物中血糖負(fù)荷的成分，從而減少碳水化合物和單糖對血糖的影響[5-6]。

迷迭香是一種芳香的常綠灌木植物，屬于唇形科，原產(chǎn)于地中海地區(qū)和南美洲，其鮮葉和干葉已被廣泛用于調(diào)味和傳統(tǒng)藥物。歷史上，迷迭香被用作藥物治療腎絞痛和痛經(jīng)、刺激頭發(fā)生長、緩解呼吸系統(tǒng)疾病。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，迷迭香提取物經(jīng)常用于治療與焦慮相關(guān)的疾病，同時(shí)藥理學(xué)研究表明，迷迭香提取物具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤和抗高血糖的特性[7-12]。

中藥具有多途徑、多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法能夠從中藥調(diào)控的整體進(jìn)行分析，具有快速高效的特點(diǎn)，因此被越來越廣泛的應(yīng)用到中藥藥理作用解析中[13-16]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)特點(diǎn)，構(gòu)建“葫蘆巴-迷迭香”治療Ⅱ型糖尿病蛋白網(wǎng)絡(luò)，解析其治療Ⅱ型糖尿病的作用機(jī)制，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.1 中藥活性成分及其靶點(diǎn)收集

運(yùn)用 BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫，以拉丁名檢索，收集葫蘆巴和迷迭香所有的有效活性基因分子，在設(shè)置參數(shù)處設(shè)定P值為0.1進(jìn)行篩選，得到其有效活性成分；用PubChem數(shù)據(jù)庫獲取各活性成分的SMILES號，導(dǎo)入SwissTarget Prediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測各成分對應(yīng)的靶點(diǎn)。

1.2 疾病靶點(diǎn)收集

以“Type 2 diabetes”為關(guān)鍵詞，使用GeneCards靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(篩選條件：相關(guān)性>40)、OMIM數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫搜索及篩選糖尿病的靶標(biāo)基因，刪除重復(fù)靶點(diǎn)，得到Ⅱ型糖尿病相關(guān)疾病靶點(diǎn)。

1.3 葫蘆巴-迷迭香治療Ⅱ型糖尿病的靶點(diǎn)預(yù)測(韋恩圖)

利用韋恩圖制作在線網(wǎng)站繪制出“葫蘆巴-迷迭香”作用靶點(diǎn)與Ⅱ型糖尿病疾病靶點(diǎn)交集的韋恩圖。

1.4 葫蘆巴-迷迭香治療Ⅱ型糖尿病蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建

為清楚地解析“葫蘆巴-迷迭香”與糖尿病之間的蛋白信息，將葫蘆巴-迷迭香和疾病靶點(diǎn)合集導(dǎo)入STRING在線數(shù)據(jù)庫，選定物種為“智人”，中等置信度設(shè)置>0.7，進(jìn)行靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建。

1.5 基因本體(GO)及通路分析

為了研究“葫蘆巴-迷迭香”中活性成分的靶點(diǎn)在基因和通路的作用，利用Metascape網(wǎng)站輸入重復(fù)靶點(diǎn)基因，依據(jù)P<0.01，篩選“葫蘆巴-迷迭香”治療Ⅱ型糖尿病的信號通路和生物過程并進(jìn)行分析，利用微生信在線平臺(tái)生成基因富集氣泡圖。

成語中還有很多古今異義的現(xiàn)象，比如“走馬觀花”中的“走”是“跑”的意思，而非“行走”之意。“赴湯蹈火”中的“湯”是“開水”的意思，并不是“菜湯”之意。“感激涕零”中的“涕”是“眼淚”之意，并不是“鼻涕”之意。

2 實(shí)驗(yàn)研究

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠50只(200±20)g，購自北京華阜康生物科技有限公司，許可證號：SCXK(京)2019-0008。飼養(yǎng)于焦作賽科動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)環(huán)境：室溫(25±2)℃，12 h 黑暗/12 h 人工光照，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。

2.2 試劑與儀器

葫蘆巴和迷迭香提取物(HMTQW)由鄭州賽科研發(fā)中心提取純化得到，復(fù)配為低劑量(0.5 g/kg)、中劑量(1.0 g/kg)、高劑量(2.0 g/kg)；鏈脲佐菌素(STZ，美國 Sigma)；檸檬酸、檸檬酸鈉(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司)；甘油三酯試劑盒(TG)、膽固醇試劑盒(TC)、低密度脂蛋白試劑盒(LDL-C)、高密度脂蛋白測定試劑盒(HDL-C)(均購于上海科艾博生物技術(shù)有限公司)；酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(賽默飛世爾)；多功能酶標(biāo)儀(TECAN 瑞士)。

2.3 動(dòng)物分組及造模

1)動(dòng)物分組 將50只健康SD大鼠隨機(jī)分為空白組、Ⅱ型糖尿病模型組和HMTQW低、中、高劑量治療組，每組10只。

2)糖尿病模型的建立 空白組正常飲食，模型組和給藥組大鼠使用高糖高脂飼料喂食8周，術(shù)前禁食 12 h，腹腔注射2%STZ，劑量 45 mg/kg，空白組腹腔注射等劑量的檸檬酸緩沖液。注射七天后，大鼠尾靜脈采血，測量空腹血糖，判斷標(biāo)準(zhǔn)為血糖范圍≥13.0 mmol/L，同時(shí)出現(xiàn)多飲、多食、多尿現(xiàn)象，表明模型建立成功。

3)實(shí)驗(yàn)給藥 模型建立成功次日開始藥物治療，每天灌胃給藥2次，連續(xù)給藥4周。

3 結(jié)果

3.1 篩選中藥活性成分及其靶點(diǎn)收集

BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫設(shè)置參數(shù)后得到“葫蘆巴-迷迭香”有效活性成分56個(gè)，其中葫蘆巴的活性成分33個(gè)，迷迭香的活性成分23個(gè)，經(jīng)篩選(活性成分與靶點(diǎn)相關(guān)度>0.1)后得到靶點(diǎn)764個(gè)。

3.2 疾病靶點(diǎn)篩選結(jié)果

通過Genecards、DisGeNET數(shù)據(jù)庫檢索“Type 2 diabetes”得到相關(guān)基因，收集基因信息(Relevance Score>40)，刪除重復(fù)基因后共獲得554條基因結(jié)果。

3.3 中藥治療疾病靶點(diǎn)韋恩圖

將活性成分靶點(diǎn)與T2DM 靶點(diǎn)繪制韋恩圖(見圖1)，二者重合區(qū)域即為交集基因，得到126個(gè)靶基因。

3.4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建及其核心基因分析

交集靶點(diǎn)互作(見圖2)共得到126個(gè)節(jié)點(diǎn)，726條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值12.1，局部聚類系數(shù)0.484。說明“葫蘆巴-迷迭香”提取物治療 T2DM 的作用機(jī)制可能與這 126個(gè)潛在靶點(diǎn)有關(guān)。蛋白交互篩選到關(guān)鍵靶點(diǎn)如表1所示。

圖1 藥物活性成分與疾病靶點(diǎn)韋恩圖

注：節(jié)點(diǎn)為交集靶點(diǎn)蛋白，邊為蛋白之間的互作關(guān)系圖2 “葫蘆巴-迷迭香”提取物與 疾病交集靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

表1 部分關(guān)鍵靶點(diǎn)

3.5 基因富集與通路結(jié)果分析

取前20位進(jìn)行GO分析和KEGG通路富集分析(見圖3)，GO富集共確定了497個(gè)條目，其中細(xì)胞組分富集有95條，包括膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、質(zhì)膜筏、受體結(jié)合物等；分子功能富集有134條，包括蛋白激酶活性、配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、磷酸酪氨酸活性等；生物過程富集有268條，包括正向細(xì)胞因子遷移、血管生長、上皮細(xì)胞增殖等。KEGG通路分析主要涉及 癌癥通路、AGE-RAGE 信號通路、糖尿病心肌炎、鈣通道、PI3K/Akt信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、HIF-1信號通路等。通路與富集靶點(diǎn)數(shù)目見表2。

圖3 GO、KEGG富集結(jié)果

表2 靶向通路及其靶點(diǎn)數(shù)目

3.6 網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

“葫蘆巴-迷迭香-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖如圖4，“葫蘆巴-迷迭香-活性成分靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖如圖5。

注：綠色節(jié)點(diǎn)是藥物，黃色節(jié)點(diǎn)是活性 成分，紅色節(jié)點(diǎn)是靶點(diǎn)圖4 “葫蘆巴-迷迭香-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

注：黃色節(jié)點(diǎn)是藥物，紅色節(jié)點(diǎn)是成分靶點(diǎn)， 綠色節(jié)點(diǎn)是疾病，紫色節(jié)點(diǎn)是疾病靶點(diǎn)圖5 “葫蘆巴-迷迭香-活性成分靶點(diǎn)-疾病 靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

3.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果

3.7.1 空腹血糖水平比較結(jié)果

與空白組比較，糖尿病模型組的血糖明顯升高，給藥低劑量組結(jié)果有下降趨勢，但未見顯著性差異，中劑量與高劑量給藥組與模型組相比可降低大鼠血糖水平，見圖6。

與空白組比較，###P<0.001； 與模型組比較，***P<0.001，**P<0.01圖6 大鼠空腹血糖水平比較 (n=10)

3.7.2 血清中甘油三酯、膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平結(jié)果

與空白組比較，糖尿病模型組血清中總甘油三酯和總膽固醇升高，高密度脂蛋白膽固醇降低，低密度脂蛋白膽固醇升高，與模型組相比，給藥組低劑量沒有顯示出明顯降低血清中總甘油三酯的作用，給藥組中劑量和高劑量具有一定作用，如圖7(a)；與模型組相比，給藥組低劑量和中劑量沒有顯示出明顯降低血清中總膽固醇的作用，高劑量給藥干預(yù)后，大鼠血清中總膽固醇下降，如圖7(b)；與空白組比較，模型組的高密度脂蛋白膽固醇降低，低密度脂蛋白膽固醇升高，經(jīng)給藥后可看出低劑量組結(jié)果與模型組沒有顯著性差異，中劑量和高劑量組顯示出良好的干預(yù)效果，如圖7(c)、 7(d)。

(a) (b) (c) (d)

3.7.3 血清中炎性因子，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和表皮細(xì)胞生長因子水平結(jié)果

與空白組比較，糖尿病模型組血清中的IL-6、IL-2、TNF-α水平顯著升高，VEGF及EGF含量明顯降低；與糖尿病模型組相比，HMTQW低劑量組沒有明顯差異，HMTQW中劑量和高劑量組血清中的IL-6、IL-2、TNF-α水平下降，VEGF和EGF水平均明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖8與圖9。

(a) (b) (c)

(a) (b)

4 討論

葫蘆巴與迷迭香中所含有的多種化合物發(fā)揮著穩(wěn)定且多樣的植物藥理學(xué)功能，廣泛用于香料、食品、醫(yī)藥行業(yè)。血脂、膽固醇升高，急、慢性并發(fā)癥，血糖水平異常，胰島素抵抗是Ⅱ型糖尿病患者顯著的特征。

4.1 “葫蘆巴-迷迭香”提取物可降低血脂、血糖

與癌癥通路相關(guān)的凋亡細(xì)胞如MAPK1和MMP9等在肥胖、糖尿病等疾病中發(fā)揮重要作用[17]。體外研究表明，迷迭香具有胰島素樣作用，可抑制肝細(xì)胞產(chǎn)生葡萄糖，顯著抑制HepG2肝細(xì)胞的糖異生。在另一項(xiàng)研究中，迷迭香提取物調(diào)節(jié)AMPK和PPAR信號通路增加肝細(xì)胞的葡萄糖消耗。此外，細(xì)胞內(nèi)糖原含量顯著降低，糖酵解率增加[18-20]。

4.2 “葫蘆巴-迷迭香”提取物可減少糖尿病并發(fā)癥

糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病的微血管并發(fā)癥。在糖尿病微血管系統(tǒng)中，細(xì)胞內(nèi)高血糖通過炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞與足細(xì)胞的交互作用以及外泌體等多種病理生理過程導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷。

作為代謝最活躍的組織之一，視網(wǎng)膜對生物機(jī)體血糖水平的波動(dòng)極其敏感。視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞因缺血、氧化應(yīng)激和促炎因子的釋放而受損。TNF是糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)研的關(guān)鍵靶標(biāo)，參與與肥胖有關(guān)的Ⅱ型糖尿病的生理、病理過程[21]，研究表明，IL-1、TNF-b、VEGF和NF-kB均可刺激內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)[22-24]。GO富集關(guān)鍵靶點(diǎn)血管內(nèi)皮因子A(VEGFA)對血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化、增殖和存活尤其重要，可促進(jìn)內(nèi)皮依賴性血管舒張和提高血管通透性[25]。葫蘆巴中劍麻皂素可上調(diào)VEGFA表達(dá)，從而減少患者視網(wǎng)膜病變的發(fā)生。

PI3K/Akt/mTOR通路是糖尿病腎病的重要通路，患者體內(nèi)異常糖代謝發(fā)生時(shí)，PI3K/Akt信號通路刺激葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，當(dāng)相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)時(shí)會(huì)傳導(dǎo)至葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4受體分子，從而激活葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4，易位至細(xì)胞膜，將葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究發(fā)現(xiàn)迷迭香中的木犀草素、槲皮素、香葉木素和葫蘆巴中的一些黃酮、皂苷類可抑制PI3K/Akt信號通路，減少細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖[26-28]。

4.3 “葫蘆巴-迷迭香”提取物可增強(qiáng)血糖調(diào)節(jié)能力

II型糖尿病患者體內(nèi)一般會(huì)含有大量不可逆糖基化終產(chǎn)物(AGEs)，高水平的AGEs會(huì)損傷胰島 β 細(xì)胞功能，誘導(dǎo)其凋亡。AGE-RAGE信號通路可激活下游核轉(zhuǎn)錄因子(NF-KB)，抑制CASP3酶的活性，迷迭香提取物抑制胰島β細(xì)胞的凋亡，改善胰島β細(xì)胞的分泌功能，增加胰島素分泌量并提高患者內(nèi)源性血糖調(diào)節(jié)能力[29-30]。從“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖中可知，迷迭香中鼠尾草酸、迷迭香酸發(fā)揮了調(diào)節(jié)血糖的能力，同時(shí)，酚酸類物質(zhì)還可以抑制α-葡萄糖苷酶活性來降低葡萄糖的吸收速率[31-32]。

4.4 “葫蘆巴-迷迭香”提取物可改善體內(nèi)胰島素抵抗

酪氨酸蛋白磷酸酶(PTPs)與酪氨酸蛋白激酶一起控制參與細(xì)胞生長、代謝、分化、增殖和存活的信號通路，I型酪氨酸蛋白磷酸酶非受體(PTPN1)是一種酪氨酸磷酸酶，作為一種胰島素信號通路負(fù)調(diào)控因子，PTPN1、PTPN2、PTPN9、PTPN11、PTPRS和DUSP9等PTPs可干擾胰島素信號傳導(dǎo)并觸發(fā)T2DM[33]，Sun等[34]實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一可能存在的藥物靶點(diǎn)，抑制與胰島素抵抗相關(guān)的PTPN1，PTPN9，PTPN11和PTPRS的催化活性，減少胰島素抵抗，從而達(dá)到降低血糖的效果。

AKT1、AKT2參與葡萄糖代謝在內(nèi)的細(xì)胞過程，與糖尿病、炎癥反應(yīng)等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能引起胰島素抵抗，研究顯示IL-6、TNF在糖尿病患者體內(nèi)表達(dá)顯著升高，炎性因子過度表達(dá)與胰島素抵抗程度呈正相關(guān)，導(dǎo)致胰島素分泌功能障礙[35]。葫蘆巴中的黃酮類化合物(葫蘆巴堿、柚皮素、異葒草素等)具有抗氧化和抗炎作用，可降低IL-6和腫瘤壞死因子-α的合成及分泌，進(jìn)而抑制炎性遞質(zhì)的產(chǎn)生，改善胰島素抵抗。同時(shí)這與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相符合。

綜上，中藥“葫蘆巴-迷迭香”治療T2DM具有可行性，作為藥食同源的葫蘆巴和迷迭香目前在臨床上的應(yīng)用研究還較少，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選擇了幾個(gè)典型性指標(biāo)進(jìn)行檢測，解釋了“葫蘆巴-迷迭香”提取物可調(diào)節(jié)血脂代謝、減少炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到降糖的作用。