基于特征成分的料香均勻性方法建立及評(píng)價(jià)*

楊乾栩，趙 蔚，謝志強(qiáng)，楊洪明，李 超，劉 欣，張 偉

(云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心，云南 昆明 650231)

料香均勻性是指煙絲中所添加的料和香的分布均勻程度，是影響卷煙感官均勻性的關(guān)鍵指標(biāo)。目前評(píng)價(jià)料、香均勻性的手段通常以丙二醇作為標(biāo)記物，部分選取薄荷醇、檸檬黃、乙基麥芽酚等[1，2]。然而，這種選取單一特征指標(biāo)的評(píng)價(jià)方式具有兩方面的缺點(diǎn)：一是方法穩(wěn)定性不夠，單一指標(biāo)往往會(huì)受較多因素的影響，使得其并非穩(wěn)健指標(biāo)；二是代表性不夠，丙二醇作為料、香的重要添加劑，在料液和表香中均有較大含量，并非料或香的特征標(biāo)記物，薄荷醇等通常只在表香中進(jìn)行添加，底料配方中涉及較少，因此不具備較好的識(shí)別度[3]。目前雖然也發(fā)展了基于近紅外光譜[4]、圖像識(shí)別[5]等料、香均勻性檢測(cè)方法，但推廣性仍不廣泛。

為進(jìn)一步建立準(zhǔn)確、靈敏、實(shí)用的料、香均勻性的分析評(píng)價(jià)方法，本文提出了基于料、香特征組分的均勻性評(píng)價(jià)方法。通過以某規(guī)格卷煙葉組煙絲為對(duì)象，對(duì)其單獨(dú)加料和加香的樣品進(jìn)行了揮發(fā)性成分分析，采用權(quán)重分析方法(Weight Analysis)[6]和選擇比例法(Selective Ratio，SR)[7]對(duì)加料和加香葉組煙絲樣本進(jìn)行變量篩選分析，以煙絲中沒有且料香中含量差異較大的組分為篩選原則，確定對(duì)料、香樣本具有較強(qiáng)區(qū)分度的特征標(biāo)記物。結(jié)果表明，篩選的料香特征標(biāo)記物可有效區(qū)分料、香，通過與常規(guī)料香均勻性評(píng)價(jià)組分丙二醇和薄荷醇對(duì)比，料、香特征標(biāo)記物在評(píng)價(jià)料、香均勻性上具有較高準(zhǔn)確性和靈敏度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：某規(guī)格卷煙葉組煙絲、正常料液、表香。試劑：二氯甲烷(HPLC級(jí)，美國MREDA公司)；D5-吡啶(純度98%，加拿大TRC 公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

Turbo vap Ⅱ濃縮氮吹儀(瑞典Biotage公司)；HY-8 型機(jī)械振蕩器(常州國華電器有限公司)；7890B/5977A 氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；HP-INNOWAX(30 m×0.32 mm×0.5 μm)毛細(xì)管色譜柱(美國Agilent公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 取樣方法

分別在切絲、滾筒干燥、加香后3個(gè)工藝點(diǎn)取生絲、熟絲、加香煙絲樣品。為保證取樣量的均勻性和代表性，每個(gè)工藝點(diǎn)分別取9個(gè)樣品，其中在每個(gè)工藝點(diǎn)的前端、中間和后端各取3個(gè)樣品，每個(gè)樣品的取樣量不少于 100 g。

1.3.2 樣品分析

樣品前處理：稱取 2 g 煙絲于錐形瓶中，加入 30 mL 二氯甲烷，振蕩萃取 30 min，過濾煙絲后，萃取液經(jīng)氮吹濃縮至 1 mL，加入內(nèi)標(biāo)物D5-吡啶(3.05 μg/mL)轉(zhuǎn)移至色譜瓶中，進(jìn)GC-MS進(jìn)行分析。

GC-MS工作條件：色譜柱為HP-INNOWAX，進(jìn)樣口溫度為 260 ℃，程序升溫：初始溫度 60 ℃，保持 2 min，以 2 ℃/min 升至 230 ℃，保持 30 min；載氣為氦氣，流量為 1 mL/min；進(jìn)樣量為 1 μL，不分流進(jìn)樣；電離源：EI，250 ℃；傳輸線溫度 260 ℃。

1.3.3 標(biāo)記物篩選

樣品按照加料和加香不同分為兩組，色譜圖原始數(shù)據(jù)經(jīng)Zscore[8]標(biāo)準(zhǔn)化處理后，分別采用Weight Analysis和SR分析方法篩選出對(duì)料液和表香區(qū)分度較大的潛在特征標(biāo)記物。

1)Weight Analysis

Weight Analysis通過計(jì)算每個(gè)變量在兩組間的方差權(quán)重，從而獲得對(duì)兩組區(qū)分能力較大的變量，詳細(xì)算法可見文獻(xiàn)。

2)SR分析法

SR分析法主要通過將原始變量投影后，獲取變量的解釋能力和殘差值，根據(jù)二者之比，即可獲得變量對(duì)分組的貢獻(xiàn)能力即SR值，SR值越大則區(qū)分能力越強(qiáng)，詳細(xì)介紹可參考文獻(xiàn)。

1.3.4 料、香均勻性評(píng)價(jià)

對(duì)不同制絲工序上的每一個(gè)加料和加香樣品，分別取前、中、后3個(gè)平行樣品，分析樣品中的標(biāo)記物成分含量，并采用下述公式計(jì)算樣品的料或香的均勻性，公式見下：

1.4 數(shù)據(jù)分析

標(biāo)記物篩選采用Matlab r2016b完成，均勻性分析采用WPS表格完成。

2 結(jié)論與討論

2.1 加料、加香煙絲樣品的色譜分析

采用1.3.2的分析方法對(duì)加料后的煙絲樣品進(jìn)行分析。根據(jù)大量樣本GC-MS定性分析結(jié)果，其中所加料液煙絲的成分主要包括糠醛、2-乙酰呋喃、薄荷醇、苯甲醛、5-甲基糠醛、丙二醇、糠醇、苯甲醇、5-羥甲基糠醛等，丙二醇是料液的通用溶劑。圖1為加料、加香煙絲樣品的分析色譜示例圖。

圖1 加料、加香煙絲樣品的GC-MS色譜示例圖

同樣對(duì)加香后的煙絲樣品進(jìn)行定性分析。結(jié)果顯示，對(duì)煙絲單獨(dú)進(jìn)行表香添加后，其GC-MS色譜檢測(cè)到的成分主要包括薄荷醇、丙二醇、α-大馬酮、苯甲醇、苯乙醇、2-乙酰吡咯、麥芽酚、巨豆三烯酮、乙基香蘭素等，其中丙二醇也是表香的溶劑。

2.2 含料、香的煙絲樣品標(biāo)記物篩選

所考察樣本色譜圖原始數(shù)據(jù)經(jīng)Zscore標(biāo)準(zhǔn)化處理后，采用Csimpls[9]進(jìn)行分析，得分圖如圖2所示。可以看出，加料樣品和加香樣品可以通過兩個(gè)潛在變量明顯分成兩類(LV1和LV2)，表明加料樣品和加香樣品在成分上具有顯著差異，可通過變量篩選(Variable/Feature Selection)[10-12]的方法獲得對(duì)料、香樣品差異貢獻(xiàn)較大的成分。

圖3是對(duì)料、香樣本的Weight Analysis和SR的分析結(jié)果，其中兩種方法計(jì)算所得的權(quán)重值(Weight)及SR值越大，則表明對(duì)應(yīng)保留時(shí)間的成分在料、香樣本具有較大的差異，可能是區(qū)分料、香樣品的標(biāo)記物。結(jié)合二者分析結(jié)果來看，在74.42、90.90和 95.38 min 3個(gè)保留時(shí)間對(duì)應(yīng)的成分在加料和加香樣品具有較大含量差別。通過譜庫查詢，對(duì)74.42、90.90和 95.38 min 保留時(shí)間對(duì)應(yīng)的成分進(jìn)行定性，3種物質(zhì)分別為棕櫚酸甲酯、亞麻酸乙酯和二十四烷。

圖2 色譜數(shù)據(jù)得分圖

圖3 料、香樣本權(quán)重分析和選擇比例分析結(jié)果

2.3 標(biāo)記物含量差異及判別能力分析

圖4是初步篩選的成分對(duì)應(yīng)的峰面積在不同樣品中的差別，其中0代表加香樣品、1代表加料樣品。在含量分布上，棕櫚酸甲酯在料中含量分布略高，采用Mann-Whitney-Wilcoxon 非參數(shù)檢驗(yàn)[13]表明，其在料和香中含量分布差異p值為0.1162，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；亞麻酸乙酯在香樣品中含量分布較高，在料和香中含量分布上具有極其顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.0000)；二十四烷在料樣品中含量分布較高，在料和香中含量分布上具有極其顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.0000)。

同時(shí)本文也對(duì)丙二醇和薄荷酮在料、香樣品中的含量分布進(jìn)行了分析。薄荷醇在料中含量稍高，在料和香中含量分布差異p值為0.0143，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；丙二醇在香中分布含量較高，在料和香中含量分布上具有極其顯著地統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.0000)。

圖4 所選標(biāo)記物及薄荷醇、丙二醇在料、香樣品中的含量分布

可以看出，所篩選的標(biāo)記物除棕櫚酸甲酯外，亞麻酸乙酯和二十四烷在料和香中含量分布具有極顯著的差異，且含量分布差異強(qiáng)于丙二醇，可作為潛在的料香特征標(biāo)記物成分。

從不同峰面積散點(diǎn)圖可以看出(如圖5所示)，所篩選確定的3個(gè)成分共同用于料香區(qū)分時(shí)可以明顯區(qū)分加料和加香樣品。并且在區(qū)分能力上，二十四烷可對(duì)加料和加香樣品完全區(qū)分，識(shí)別正確率為100%；亞麻酸乙酯對(duì)料、香樣品也有極強(qiáng)的區(qū)分能力，識(shí)別正確率達(dá)98.15%；棕櫚酸甲酯對(duì)料香樣品區(qū)分能力一般，識(shí)別正確率達(dá)52.78%；薄荷醇和丙二醇對(duì)料香樣本區(qū)分能力一般，識(shí)別正確率分別為65.74%和83.30%。

圖5 不同料香標(biāo)記物組合料、香區(qū)分散點(diǎn)圖

依據(jù)建立的檢測(cè)方法，亞麻酸乙酯和二十四烷的保留時(shí)間都在 90 min 以后，化學(xué)性質(zhì)較為相近，可建立合適的方法進(jìn)行分離，且二者在料和香樣品中含量分布剛好相反，因此選擇亞麻酸乙酯和二十四烷作為料、香均勻性評(píng)價(jià)標(biāo)記物。

2.4 料、香均勻性評(píng)價(jià)方法應(yīng)用

圖6反應(yīng)了不同標(biāo)記物在制絲段不同工序?qū)?yīng)樣品的檢測(cè)結(jié)果。整體來看，所選標(biāo)記物對(duì)不同工序料香均勻性的評(píng)價(jià)結(jié)果較一致，除個(gè)別離閾值外，加料、滾筒干燥和加香工序的料香均勻度整體上均可達(dá)0.8以上；薄荷醇和丙二醇對(duì)不同工序料香均勻度的評(píng)價(jià)結(jié)果較差，二者在不同工序上的料香均勻度評(píng)價(jià)存在較大波動(dòng)。

圖6 不同標(biāo)記物在不同工序檢測(cè)折線圖

表1對(duì)比了所篩選確定的特征標(biāo)記物成分與常規(guī)標(biāo)記物丙二醇和薄荷醇的料香均勻性評(píng)價(jià)結(jié)果。其中采用亞麻酸乙酯和二十四烷成分評(píng)價(jià)，二者在不同階段的評(píng)價(jià)結(jié)果較為一致，均表現(xiàn)為滾筒干燥工序料香均勻性最高，加料階段其次，加香階段最差。采用薄荷醇評(píng)價(jià)，加料工序料香均勻性最高，加香工序其次，滾筒干燥工序最差。而采用丙二醇評(píng)價(jià)，則呈現(xiàn)出加香工序料香均勻性最高，滾筒干燥工序其次，加料工序最差的結(jié)果。從不同工序料香均勻性的具體數(shù)值來看，亞麻酸乙酯和二十四烷對(duì)加料、滾筒干燥和加香工序的均勻性評(píng)價(jià)結(jié)果較為吻合，二者評(píng)價(jià)結(jié)果的皮爾森相似性達(dá)0.999，而薄荷醇和丙二醇的評(píng)價(jià)結(jié)果則相似性較差，僅有0.136。

表1 方法穩(wěn)定性考察結(jié)果

對(duì)于制絲工序，加料、滾筒干燥、加香是依次進(jìn)行的加工過程，其中料液是加料工序階段添加，表香的添加則在加香工序階段。從實(shí)際經(jīng)驗(yàn)來看，滾筒干燥相對(duì)于加料工序經(jīng)過進(jìn)一步的混合，其料香均勻性要高于加料工序。而在加香工序，由于額外添加了表香，尚未經(jīng)過充分制絲工藝的混合，因此其料香均勻性會(huì)有一定程度降低。

因此從上述分析結(jié)果來看，所篩選的亞麻酸乙酯和二十四烷針對(duì)不同制絲工序料香均勻性的評(píng)價(jià)結(jié)果與實(shí)際經(jīng)驗(yàn)較為一致，而薄荷醇和丙二醇與實(shí)際經(jīng)驗(yàn)均存在一定偏差，表明所篩選確定的標(biāo)記物可以較好的表征料香在葉組煙絲中的分布均勻性。

3 結(jié)語

料、香均勻性評(píng)價(jià)是煙草行業(yè)較為重視的問題，現(xiàn)有研究所提及的均勻性評(píng)價(jià)方法在靈敏度、準(zhǔn)確度和實(shí)用性上尚存在不足。本研究采用化學(xué)計(jì)量學(xué)變量篩選手段，篩選了料、香中的特有標(biāo)記物，并首次以料、香特有標(biāo)記物為切入點(diǎn)，建立了基于料、香標(biāo)記物的均勻性評(píng)價(jià)方法。相比于常規(guī)丙二醇、薄荷醇作為評(píng)價(jià)標(biāo)記物，所篩選確定的亞麻酸乙酯和二十四烷表現(xiàn)出較優(yōu)的均勻性評(píng)價(jià)結(jié)果：一方面，亞麻酸乙酯和二十四烷特征標(biāo)記物，二者在不同工序的均勻性評(píng)價(jià)結(jié)果，表現(xiàn)出較好的一致性和穩(wěn)定性，另一方面，這兩個(gè)特征標(biāo)記物對(duì)不同工序的料、香均勻性評(píng)價(jià)結(jié)果，與實(shí)際生產(chǎn)認(rèn)知更為吻合。因此，本文提出的采用料香特征標(biāo)記物用于評(píng)價(jià)加料、加香樣品分布均勻性的方法，為料香均勻性評(píng)價(jià)的標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)提供了新思路。