HPLC測定甲磺酸二氫麥角堿緩釋片有關物質

張發成，張 丹，管 嵐，萬竹青，蔣雪琴

(1.寶利化(南京)制藥有限公司，江蘇 南京 210038；2.南通大學，江蘇 南通 226001)

甲磺酸二氫麥角堿 (1)是天然麥角生物堿的四種雙氫衍生物的混合物，其組分包括甲磺酸二氫麥角考寧、甲磺酸二氫麥角汀和甲磺酸二氫-α-麥角隱亭、甲磺酸二氫β-麥角隱亭。依舒佳林 (1緩釋片)是1、卡波姆934P等經制粒壓片而成，臨床上用于治療腦血管病后遺癥和老年病人的輕度血管性癡呆等[1]，具有臨床效果顯著、副作用小等優點。檢驗過程中發現色譜柱使用壽命較短，且發現加速試驗中的樣品有關物質和含量數據物料不平衡。經檢索文獻[2-3]發現，色譜柱壽命短，可能系卡波姆特性所致。因此，有必要研究新的樣品前處理及有關物質檢測方法，以改善這一不足。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀Waters e2695-2489，色譜工作站Empower3，電子天平Mettler Toledo XSE105DU (0.001 mg)，pH計Sartorius PB-10，超聲儀深圳歌能GS-100A，高速離心機赫西儀器 TG16MW。

試驗樣品，寶利化(南京)制藥有限公司，批號2110003、2106002、2009001、2004001。

甲醇為TEDIA HPLC級，批號21095154；鹽酸為分析純，南京化學試劑股份有限公司，批號為210306345H；磷酸氫二銨為分析純，南京化學試劑股份有限公司，批號為151019975E；氯化鈉為分析純，南京化學試劑股份有限公司，批號為201212699F；氯化鈣為分析純，國藥集團，批號：20191127。

2 試驗過程與結果

2.1 方法確定

按高效液相色譜法(《中國藥典》2020年版四部通則0512)的方法測定。取本品，研細，稱取細粉適量(約相當于甲磺酸二氫麥角堿 5 mg)，置 25 mL 量瓶中，加入2%的氯化鈉溶液 15 mL，搖勻，靜置 2 h，超聲處理 5 min，加乙腈稀釋至刻度。搖勻，離心(10000 r/min，5 min)，取上清液經孔徑為 0.45 μm 的濾膜(材質PTFE)過濾，棄去 2 mL 初濾液，取續濾液作為供試品溶液。精密量取供試品溶液 1 mL，置 50 mL 量瓶，用水-乙腈(體積比3∶2)稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液(2%)。稱取丁基羥基苯甲醚約 8 mg，置 25 mL 量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液；移取 1 mL 儲備液至 100 mL 量瓶中，用水-乙腈(體積比3∶2)稀釋至刻度，搖勻，作為丁基羥基苯甲醚溶液。精密量取對照溶液1 mL，置10 mL量瓶中，用水-乙腈(體積比3∶2)稀釋至刻度，搖勻，作為靈敏度溶液(0.2%)。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Phenomenex Gemini C18柱，φ4.6 mm×250 mm，5 μm 或效能相當的色譜柱)；以甲醇作為流動相A，0.005 moL/L 磷酸氫二銨(用10%磷酸調節pH至2.5±0.2)為流動相B，按下表進行線性梯度洗脫；檢測波長為 280 nm，進樣體積為 25 μL。

表1 洗脫梯度表

精密量取靈敏度溶液 25 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，主峰2的信噪比應不小于10。取對照溶液和供試品溶液各 25 μL 依次注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中主峰之間分離度應符合要求，如有雜質峰，主峰與相鄰雜質的分離度應符合要求，扣除輔料峰后，各雜質峰面積之和不得大于對照溶液色譜峰面積之和(2%)，小于靈敏度溶液(0.2%)主峰1峰面積的峰忽略不計。

2.2 前處理方法的開發

經檢索相關文獻[3]發現，卡波姆在pH 6～12時可形成水凝膠的結構，較為粘稠；當pH<3或pH>12時，粘度下降。而原質量標準中所使用的流動相pH≈8，故推斷導致色譜柱壓力升高、峰型變差和柱效下降等問題可能與卡波姆在流動相中粘度有關。因此，樣品前處理的重點是盡可能地去除供試品溶液中的卡波姆。

2.2.1 濾膜篩選

將同一溶劑空白溶液分別用不同材質的濾膜濾過后進樣檢測(色譜條件采用原標準方法)，同時與未過濾溶劑空白圖譜進行對比研究。試驗結果顯示PTFE的濾膜過濾后溶劑空白中未出現干擾峰。

取同1份樣品溶液，離心處理 5 min(10000 r/min)后，分別用不同品牌的同材質(PTFE)同孔徑大小(0.45 μm)同規格(直徑 13 mm)的微孔濾膜濾過，分別取棄去 0、1 和 2 mL 后溶液進樣檢測。試驗結果顯示，品牌為泰坦的PTFE濾膜，對1緩釋片中雜質幾乎無吸附，當棄去體積為0～2 mL 時，所測雜質總量均保持不變；而品牌為津騰的濾膜對雜質存在吸附，隨著棄去體積的增加，雜質總量逐步提高，當棄去體積增加至2 mL時，雜質總量與使用泰坦品牌濾膜所測結果一致。

2.2.2 提取溶液篩選

文獻報道[2-3]卡波姆可與陽離子，如Na+、Ca2+和Al3+等形成沉淀。向供試品溶液中加入不同濃度的含陽離子的溶液，使卡波姆膠體形成沉淀后除去。計算新處理方法對主成分和雜質提取率，同時考察濾過阻力。結果顯示，用CaCl2溶液和NaCl溶液處理后供試品的主成分相對于原方法提取更完全，但CaCl2溶液在溶劑峰位置存在較大干擾峰，且對雜質的提取率偏低；1%NaCl溶液對主成分和雜質提取率略高于2%NaCl，但2%NaCl溶液處理后供試品溶液的濾過阻力明顯小于1%NaCl溶液。

2.2.3 提取方法篩選

原質量標準[4]中有關物質供試品溶液的制備，采用“放置 2 h 后，充分振搖 10 min”，該步驟可能對1緩釋片中甲磺酸二氫麥角堿的提取率有比較大的影響，故設計試驗驗證：分別稱取約 500 mg 的1緩釋片片粉，置量瓶中，加占量瓶體積60%的氯化鈉溶液，搖勻后靜置 2 h，分別以旋渦振搖5/10/15 min、搖床振搖1/2/3 h、超聲5/10/15 min 后用乙腈稀釋，測定總峰面積。結果顯示，超聲5分鐘，對主成分甲磺酸二氫麥角堿的提取率最高，且超聲方式更為便捷快速。

2.3 色譜條件的開發與優化

2.3.1 色譜系統的初步建立

在原質量標準方法基礎上，采用梯度條件對供試品進行初步分離，經考察，確定初始有機相體積比為10%。結果顯示主成分色譜峰峰型及主成分峰與相鄰雜質峰的分離都得到極大改善。

2.3.2 緩沖鹽濃度優化

將流動相A中緩沖鹽濃度從 0.010 moL/L 降低至 0.005 moL/L 進行試驗，此時，色譜圖中基線漂移及干擾情況得到明顯改善，樣品中雜質與主成分峰基本得到分離。

2.3.3 流動相pH篩選

分別將流動相A的pH調至2.0、2.5和3.0，其余色譜條件不變，考察1緩釋片在不同pH值流動相中有關物質分離情況。結果顯示，流動相體系pH為3.0時，主峰2和主峰3間的分離度有所下降，同時雜質的檢測靈敏度也有所下降。當流動相pH為2.0時，基線波動幅度變大，故綜合考慮，選擇流動相pH為2.5。

2.3.4 柱溫篩選

考察1緩釋片在不同柱溫下有關物質的分離情況，和2%對照溶液在不同柱溫下的信噪比。結果顯示當柱溫設為 40 ℃ 時，基線抬高明顯，且主峰2、3間分離度也明顯下降，而當柱溫設為 30 ℃ 時，2%對照溶液中主峰2的信噪比下降明顯。

2.4 色譜條件優化

2.4.1 試驗結果

據單因素試驗結果，以柱溫、pH值、緩沖鹽濃度為自變量，以分離度(R1)、基線S/N(R2)為響應值，設計3因素3水平的響應面分析試驗。中心點重復2次，響應面因素及水平設計見表2。

2.4.2 模型方程的建立與方差分析

應用Design-Expert 12對表3中的數據進行二次多元回歸擬合，得到流動相pH值、緩沖鹽濃度、柱溫與色譜峰分離度之間的二次多項回歸方程：R1= -0.0975A2-0.0075B2-0.0225C2-0.015A×B+0.025A×C-0.015B×C-0.1A+0.01B-0.0625C+1.65。統計分析結果見表4，模型項P<0.01說明R1與x回歸方程的關系是極顯著的，該模型可用。

表2 Box-Behnken試驗因素和水平

表3 Box-Behnken試驗設計及數據處理

表4 方差分析結果—分離度

對表3中的數據進行二次多元回歸擬合，得到流動相pH值、緩沖鹽濃度、柱溫與基線S/N之間的多項回歸方程：R2=0.0125A-0.6B+1.29C+18.49。統計分析結果見表5，模型項P<0.01說明R2與x回歸方程的關系是極顯著的，該模型可用。

2.4.3 響應曲面分析

應用Design-Expert軟件進行進一步優化；根據回歸模型作出相應的響應曲面圖和等高線圖，考查擬合響應曲面的形狀，分析各因素對分離度的影響，結果見圖1，圖1反映了三因素中任意兩因素的交互作用對分離度的影響。試驗結果說明流動相的pH值和緩沖鹽濃度對分離度的交互影響最大。而依據各因素對S/N的方程，可知各因素對S/N沒有交互影響。

表5 方差分析結果-信噪比

圖1 各因素交互作用的響應面和等高線圖

2.4.4 參數優化

通過軟件分析，響應面法優化的分離度最佳條件以分離度、信噪比最大為目標，做條件優化，求出最佳色譜條件為pH值=2.3，緩沖鹽濃度為 5 mmoL/L，柱溫 36.4 ℃，此時分離度為1.63，S/N為19.4。鑒于色譜柱的耐受性pH值取2.5，柱溫取 35 ℃，緩沖鹽濃度仍為 5 mmoL/L，此時理論分離度為1.63，S/N為19.1。分離度、基線S/N可以接受。以此條件試驗，結果分離度為1.65，S/N為19.5。

2.5 方法學驗證

2.5.1 專屬性研究

以乙腈-2%NaCl溶液(體積比2∶3)為溶劑，試驗結果顯示空白溶劑無干擾。經單輔料定位確認 28 min 峰為淀粉引入，54 min 峰為丁基羥基苯甲醚引入，空白輔料典型圖譜如圖所示。

圖2 空白輔料色譜圖

圖3 輔料丁基羥基苯甲醚定位圖

圖4 供試品溶液色譜圖

2.5.2 破壞試驗

將1緩釋片研成細粉后，分別于光照、高溫、酸、堿和氧化條件下進行強制破壞，考察其降解雜質與主成分的分離，以及物料平衡情況。結果顯示，1緩釋片的片粉在光照、高溫、酸、堿和氧化條件下均有所降解，其中酸、堿降解產物一致；強光降解的樣品外觀變黃，各降解條件下物料平衡均達到95%以上，并且在各降解條件下產生的降解雜質與主峰間均能達到基線分離，主峰純度檢查均符合要求。

2.5.3 定量限與檢測限

將2%對照溶液逐級稀釋后分別進樣，計算各主峰信噪比，試驗結果顯示，0.2%對照溶液各主峰S/N值均大于10，故0.2%對照溶液為定量限濃度，0.1%對照溶液各主峰S/N值均大于3，故0.1%對照溶液可作為檢測限濃度。

圖5 強制降解的色譜圖

2.5.4 重復性

取定量限溶液(0.2%)，連續進樣6次，結果RSD為1.80%，符合要求。

2.5.5 線性與范圍

取供試品溶液，稀釋制成0.2%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%的系列質量分數溶液，對應質量濃度分別為0.41、1.025、2.05、4.10、6.15 μg/mL，分別進樣，以主峰面積和質量濃度作線性回歸，求得線性回歸方式為A=126625ρ+2334.8，相關系數r為0.99997，線性范圍為0.41～6.15 μg/mL(0.2%～3.0%)。

2.5.6 溶液穩定性試驗

對照溶液、供試品溶液室溫放置 48 h 內總峰面積的變化均小于2.0%。

2.5.7 耐用性試驗

將波長± 2 nm、柱溫 ±2 ℃、流速 ±0.1 mL/min、初始甲醇比例±2%和流動相pH2.5±0.2，對各條件下的結果和標準條件下的結果對比。各變動色譜條件下系統適用性滿足要求；各變動色譜條件下所測結果與初始條件結果相對偏差均≤5.0%。

2.6 樣品檢測結果

按照新開發的檢測方法檢測本品及近效期樣品，以原產品的注冊標準的有關物質限度判定。結果表明，新生產樣品和近效期樣品的有關物質均在2%的限度范圍內，符合產品的注冊標準。

表6 樣品的有關物質檢測結果

3 討論

1)本品長期24個月，質量穩定，有關物質無明顯變化；加速試驗降解迅速，本文以加速試驗6個月的產品作為有關物質方法開發的樣品，所開發方法可有效分離各雜質峰。

2)原質量標準中1緩釋片的處理方法是離心和過濾，不能有效去除卡波姆膠體。柱壓升高、柱效降低的原因可能是當卡波姆進入色譜柱后，卡波姆結構中的羧基與C18柱中的硅醇基形成氫鍵而吸附在柱頭，進而影響色譜柱的使用壽命。