膽管癌實驗模型研究進展

張雄?賀慧華?高緒照

【摘要】膽管癌是肝臟第二大常見的惡性腫瘤，早期癥狀不典型、惡性程度高、病死率高是其特點，目前全球范圍內膽管癌的總體發病率逐年遞增，且多數膽管癌患者的預后較差，迫切需要有效的診斷、治療策略來改變這一現狀。腫瘤建模是癌癥研究的一大熱點，建立膽管癌實驗模型有助于深入了解、研究膽管癌的發生、發展、藥物治療效應等，對膽管癌的早期診斷及治療具有重要意義。

【關鍵詞】膽管癌；體外模型；3D打印；體內模型；CRISPR/Cas9；基因工程

Progress in experimental models of cholangiocarcinoma Zhang Xiong△， He Huihua， Gao Xuzhao.△Jishou University， Jishou 416000， China

Corresponding author， Gao Xuzhao， E-mail： zjjgxzh@126.com

【Abstract】Cholangiocarcinoma is the second most common malignant tumor of the liver， which is characterized by atypical early symptoms， high malignancy and high mortality. Currently， the overall incidence of cholangiocarcinoma has been increased year by year worldwide and a majority of cholangiocarcinoma patients obtain poor prognosis. Effective diagnosis and treatment strategies are urgently required to change this situation. The establishment of disease models is a hot topic in cancer research. The establishment of experimental models of cholangiocarcinoma contributes to in-depth understanding and study of the incidence， development and drug therapeutic effect of cholangiocarcinoma， which is of significance for early diagnosis and treatment of cholangiocarcinoma.

【Key words】Cholangiocarcinoma； In vitro model； 3D printing； In vivo model； CRISPR/Cas9； Genetic engineering

生物建模作為一種研究復雜生物系統的實驗方法，在揭示癌癥分子機制和開發治療上發揮了巨大作用，但目前良好的模型設計及其實驗應用方面仍存在部分不足，在本綜述中，我們將探討建模的基本理論，常用實驗模型，并探討膽管癌基因組學和建模的進展。

一、膽管癌體外模型

常見的膽管癌體外模型包括細胞系模型、球狀體模型、類器官模型、3D生物打印模型等。體外模型一直是膽管癌研究的重要工具，因其具有實驗可重復性高、維護成本較低、可進行高通量藥物篩選、長期擴增穩定性好等優點而備受學者的青睞，但它們也有一些局限性，如模型與體內腫瘤微環境及其他細胞、生物介質信號的脫離，模型建立初期成本較高且成功率低等缺點。只有熟知各體外模型優缺點并結合自身實驗的特點，揚長避短，才能充分發揮模型的優勢。

1.膽管癌細胞系模型

細胞系是基礎研究中最常用，且特征明確、遺傳學穩定的二維模型，成本較低、易于培養、可進行基因改造、可重復性高且實驗結果獲取較快均是其顯著優點，但由于細胞系的二維分布以及易脫離腫瘤周圍環境，導致其無法真實還原原發腫瘤的異質性。Xue等［1］使用了QBC939和HuCC-T1 2種人膽管癌細胞，證實了Tweety家族成員3基因在2種膽管癌細胞中表達的上調不僅促進了膽管癌細胞的增殖、轉移和侵襲性，還可能通過Wnt/β-catenin信號通路促進膽管癌的上皮-間質轉化（EMT）。細胞系模型推動了學者們在細胞分子水平上對膽管癌的發生、發展等內在機制方面的深入研究與理解。

2.球狀體模型

球狀體模型是細胞系培養中自發建立的三維細胞系聚集體。眾所周知，多數癌癥源于具有類似干細胞自我更新和多向分化能力的癌細胞，而這類細胞常被稱為癌癥干細胞（CSC），也被認為是化學治療耐藥和腫瘤復發的重要因素，對癌癥耐藥研究具有重要意義［2］。球狀體模型是一種常用的CSC富集方法，Correnti等［3］研究了人絲氨酸蛋白酶抑制劑B3基因在膽管癌干細胞球狀體模型中的表達情況，并將其認定為預后不良患者的標志物。此模型同樣表現出類似細胞系模型的脫離腫瘤微環境的局限性。

3.類器官模型

類器官模型是由多能干細胞增殖、分化形成的具有一定自組織能力的三維細胞復合體。腫瘤類器官模型具有原發腫瘤特有的多種細胞類型和相似的組織學和基因學特性，能在體外培養體系中穩定擴增，可較好地再現原發腫瘤的異質性［4］。有研究者評估了患者來源的腫瘤類器官（PDO）在預測臨床患者對于抗癌藥物反應的潛力，結果顯示靈敏度達100%，特異度為93%，陽性和陰性預測值分別為88%和100%［5-6］。另外，膽管癌PDO和免疫細胞的共培養系統，可用于預測對患者有效的免疫檢查點抑制劑［6］。基于此，患者來源的腫瘤類器官模型可能是臨床前期及體外預測患者對抗癌藥物敏感性的理想模型，但目前存在成本較高、手工操作繁瑣、無法進行微環境調控等局限性。

4. 3D生物打印模型

3D打印技術以數字模型文件為基礎，結合可粘合材料，通過打印設備逐層、立體構造物體。與細胞相關的打印技術稱為3D生物打印，通過使用生物材料、細胞和（或）細胞因子等作為生物印刷墨水來構建人體組織或器官［7］。依據不同成型原理和打印材料，可分為基于噴墨的生物打印、基于擠壓的生物打印、光輔助生物打印、光固化生物打印四大類。現有文獻中暫時只見擠壓式模型被應用于膽管癌模型的報道，故只對其進行討論。

基于擠壓的生物打印是目前使用最廣的生物打印方法，它通過擠壓生物墨水使其從噴嘴中連續擠出纖化細絲沉積物來打印，其優點是具有較廣的生物印刷墨水相容性，但其產生的機械壓力和剪切力也會使細胞活性降低或死亡［8］。Mao等［9］使用擠壓打印建立了患者來源的膽管癌3D打印模型，并與初代細胞系進行了同步培養和對比評估，結果顯示3D打印模型的干性特征、纖維化程度和侵襲轉移能力等惡性指標均較細胞系模型顯著增強，且在隨后的抗癌藥物測試中表現出更強的耐藥性。3D生物打印模型在腫瘤進展、腫瘤微環境、藥物篩選評估中顯示出廣闊的前景，通過此項技術可以在體外重現原生的組織和血管結構，不僅可用于腫瘤建模研究，還可構建類器官模型及仿生組織［10-13］。

二、膽管癌體內模型

膽管癌體內模型常使用實驗鼠建立，常用模型包括腫瘤移植模型、基于化學致癌物的誘發模型、基因工程小鼠模型（GEMM）等。理想的膽管癌體內模型應具有腫瘤微環境及免疫力才能較好地還原人類腫瘤病理學特征和分子生物學改變。然而，現有動物模型存在不同的局限性，沒有完美的模型可以滿足膽管癌研究的所有需求，因此為不同實驗目的選擇合適的模型是關鍵，需考慮到腫瘤生物學特點、宿主免疫活性、腫瘤微環境、基因改變等多個因素，權衡利弊。

1.腫瘤移植模型

腫瘤移植模型是腫瘤體內研究常用的模型，一般使用不同品類及遺傳背景的實驗鼠建模，其使用便捷、可重復性好、成本適中、腫瘤形成時間短，常用于評估體內抗腫瘤藥物的療效及耐受性。由于膽管在肝臟內的存在環境獨特，因此原位移植模型比異位移植更適合模擬人類膽管癌的發展及演變，但原位移植常需超聲、微型CT、MRI等方法評估腫瘤大小及轉移情況。

異種移植模型常通過皮下注射將腫瘤細胞、組織移植于免疫缺陷小鼠或裸鼠中建立，建模成功后可較簡便地觀測到腫瘤體積、生長情況及完成腫瘤標本切取。在長期、連續的傳代培養中，由于特異性突變、亞克隆、選擇壓力以及缺乏腫瘤微環境等緣由，通常會使異種移植模型逐漸喪失腫瘤異質性［10］。針對上述缺點，有研究者使用PDO異種移植模型證實了即使在體內或體外經過長期擴增培養，PDO異種移植模型也可保留與初代膽管癌細胞相同的組織學結構和基因表達譜［11］。由于異種移植模型只能用于免疫缺陷宿主，不適合進行腫瘤免疫學研究，且腫瘤移植物與宿主不同物種之間微環境的不匹配可能會對實驗結果產生影響，因此異種移植模型的應用受到了限制。

同種移植模型使用同源實驗鼠建立，可在一定程度上避免宿主的免疫缺陷導致的實驗誤差。Aoki等［12］使用同基因型小鼠膽管癌細胞原位植入于同源小鼠的肝臟中，證實了阻斷胎盤生長因子基因可通過減少磷酸激酶B（AKT）的活化和膽管癌細胞的增殖及侵襲來抑制原位腫瘤的生長，為膽管癌治療提供了靶向方案。

2.基于化學致癌物的誘發模型

經口服、注射等途徑進入實驗鼠體內的化學致癌物通過破壞細胞DNA完整性、破壞細胞膜、誘導炎癥反應等產生基因毒性效應，從而誘發小鼠肝臟慢性炎癥，引起膽管的纖維化，使其進一步進展為膽管癌［13-14］。常用的化學致癌物有：二乙基亞硝胺（DEN）、二甲基亞硝胺（DMN）、呋喃、硫代乙酰胺或四氯化碳（CCl4）等［15］。雖然基于化學致癌物的誘發模型給藥簡便，具有良好的可重復性，但是除了誘導產生膽管癌之外，還有可能會誘發肝癌或其他全身性腫瘤，影響實驗結果，因此學者們常將該模型與膽汁淤積、吸蟲感染等模型聯用來提高膽管癌建模成功率［16］。

3.膽汁淤積模型

膽汁淤積模型，例如左膽管結扎（LMBDL）模型，通過產生慢性膽汁淤積來促使膽管癌病變的發生，目前已知原發性硬化性膽管炎、原發性膽汁性肝硬化和膽道閉鎖均為膽管癌癌前病變的高危因素，且均與膽汁淤積癥相關。Yang等［17］使用化學藥物LMBDL和DEN聯合建模，結果顯示可使50%的小鼠模型在第28周時形成膽管癌，而單獨接受LMBDL或DEN的動物膽管癌發生率為0%。膽汁淤積模型需行膽管結扎手術，對操作者的技能要求相對較高，且實驗鼠易受麻醉和手術風險因素的影響導致實驗失敗。

4.吸蟲感染模型

肝吸蟲感染模型是通過肝吸蟲感染誘導膽管產生慢性炎癥以及膽管上皮的損傷和對肝吸蟲抗原的免疫病理反應促使膽管癌的發生。Thamavit等［18］使用了肝吸蟲感染和DMN的組合建模，給實驗鼠喂食并感染肝吸蟲后再服用DMN，能使100%的實驗鼠發生膽管癌，該聯合模型建模成功率較高，能進一步節省實驗成本。需注意的是，由于小鼠的個體差異，在經受感染后，感染模型的潛伏期各不相同，會導致實驗可控性欠佳。

5. GEMM

GEMM是癌癥研究的重要工具，通過基因編輯、轉基因或基因轉導等技術使常見的致癌相關基因發生缺失（敲除）、過表達或突變等改變誘導實驗鼠產生腫瘤，常用于在特定基因水平上分析致癌基因、腫瘤抑制基因，以及復雜的生物信號途徑在腫瘤的發生、進展和治療轉歸等階段中的作用機制，是可有效地識別預后的生物學標志物，并可用于臨床前評估靶向藥物的治療反應［19］。由于腫瘤是在擁有完全免疫力的GEMM中自發發生的，能較好地模擬還原人類膽管癌的形成過程，但GEMM造價較高，且常無法還原膽管癌相關的慢性肝損傷、炎癥特征環境。

CRISPR/Cas9基因編輯系統是從細菌中發現的保護自身基因完整性的防御性機制，主要由RNA介導的Cas9核酸酶和單鏈引導RNA （sgRNA） 組成，sgRNA按堿基互補配對原則引導Cas9與目標DNA靶點結合，由Cas9蛋白切割、斷裂雙鏈DNA，在隨后的DNA修復過程中，在存有修復模板或非同源末端連接的情況下進行基因重組修復［20］。Gao等［21］使用CRISPR/Cas9基因編輯系統建立了異檸檬酸脫氫酶（IDH）突變的膽管癌細胞系模型，并證實了IDH1突變誘導的R-2-羥基戊二酸（R-2HG）基因可以通過調節FTO/m6A-methylated ERα/miR16-5p/YAP1信號通路來抑制膽管癌生長。CRISPR/Cas9已成為目前基因組工程中重要的基因編輯工具之一，具有快速、高效、操作簡便、成本相對較低、精準的基因編輯與調控能力等諸多優點，已經被成功應用于生物基因修飾與人類疾病的治療，對膽管癌診治有廣泛的應用前景，根據目的基因是否需要激活條件可分為條件激活型轉基因模型和非條件型基因轉導模型。

5.1條件激活型轉基因小鼠模型

條件激活型轉基因模型常借助Cre-LoxP重組酶系統，并聯合實驗鼠雜交來建立啟動子激活下的Cre重組酶特定基因改造小鼠［22］。Zhao等［23］借助Cre-LoxP系統及小鼠雜交，建立了白蛋白啟動子激活的攜有Cre重組酶的SMAD4及PTEN共敲除實驗鼠，證實抑癌基因CULLIN 3缺失后可間接誘導雙調蛋白Areg分泌，從而促進炎性因子的產生以形成腫瘤微環境，這就是肝臟特異性SMAD4基因和PTEN基因缺失模型。Ikenoue等［24］使用白蛋白啟動子激活的特異性KRAS基因和PTEN基因敲除的實驗鼠建立肝臟特異性KRAS基因激活和PTEN基因缺失模型，該模型腫瘤進展較快且只誘導肝內膽管癌發生，中位生存期僅為46 d，均有肝大、血性腹水以及黃疸和體質量減輕等癥狀，在實驗中也可觀察到MAPK和PI3K-mTOR信號通路的激活，是研究肝內膽管癌發生機制的有效模型。多數膽管癌條件激活型轉基因模型無法模擬慢性肝損傷、炎癥及遠處轉移等腫瘤環境，可能適用于非晚期膽管癌的研究。

5.2非條件基因轉導小鼠模型

非條件基因轉導模型的建立常通過在小鼠肝臟、膽管局部注射轉座子和（或）特異性啟動子介導的相關癌基因來建立。轉座子可以攜帶外源基因片段在動物體內進行高效轉位，是基因工程動物建模領域的重要工具，其中較常用的是睡美人轉座子。Hu等［25］通過水流動力學尾靜脈注射睡美人轉座子轉染AKT和NICD致癌基因至實驗小鼠，成功建立了Akt-NICD基因模型，并證實了抑制DNA甲基轉移酶（TEAD）或轉錄增強締合域蛋白可終止Akt-NICD軸驅動的由肝細胞向肝內膽管癌細胞的轉化，為膽管癌提供了新的靶向治療思路。與蛋白激酶B（AKT）相似，Yes相關蛋白（YAP）是一種與癌癥發展有關的轉錄共激活因子相關蛋白［26］。將攜有AKT/YAP基因質粒的睡美人轉座子混合物直接注射于小鼠膽管中可建立AKT/YAP基因模型。通過此模型，Zhang等［27］證實了YAP通過轉錄增強相關結構域（TEAD）依賴性轉錄激活并與β-Catenin通路相互作用誘導膽管癌的發生，而敲除Catenin Beta1基因后可顯著抑制其發生過程及膽管癌細胞的生長，該研究的發現對制定膽管癌治療策略具有重要意義。

三、總結與展望

膽管癌是一類預后較差的疾病，且目前致病機制尚未完全明確，癌癥實驗模型在癌癥的發病機制研究、疾病進展及治療評估中舉足輕重。本文介紹了不同類型的膽管癌模型和相關建模技術，以及部分模型的特點及不足，單個膽管癌模型存在一定的局限性，多種模型系統的組合聯用也將成為癌癥模型發展中取長補短的必由之路。這些模型可基于患者或動物樣本來源的基因組、表觀基因組、轉錄組和蛋白質組學等進行深入研究并解析膽管癌的致病機制、分子基礎、腫瘤轉移、與宿主的相互作用、腫瘤微環境的作用以及膽管癌的內在異質性，可為預測新的治療靶點、癌癥標志物以及促進藥物研發提供極大的幫助，對提高膽管癌早期防治水平意義重大。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2023-02-25）

（本文編輯：洪悅民）