款冬花多糖調控miR-889-3p/TLR4 對IL-6誘導的乳腺癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響*

張慧慈，商慶新

（1.山東中醫藥大學，濟南 250355；2.山東中醫藥大學中醫診斷學教研室，濟南 250355）

乳腺癌是導致女性死亡的第二大惡性腫瘤，手術切除、放射治療、靶向技術等已成功應用，但不良反應較大，因而尋找安全有效的藥物具有重要意義[1]。中藥在乳腺癌等多種疾病中發揮重要作用，并可改善患者預后[2]。白細胞介素-6（IL-6）是一種具有多效活性的細胞因子，在炎癥向腫瘤轉化過程中具有促進作用[3]。IL-6 可由腫瘤微環境中的間質細胞及腫瘤細胞本身分泌，是腫瘤微環境中間質細胞與腫瘤細胞、間質細胞之間“相互交流”的重要媒介[4]。Gprc5a-ko 小鼠中高水平的IL-6 可重新編程腫瘤基因表達從而促進乳腺癌的肺轉移[5]。同時，IL-6 加劇了乳腺癌細胞的增殖和侵襲[6-7]。這提示了IL-6 與腫瘤細胞的惡性行為是相互促進、相互依存的?？疃▽儆诰湛浦参锟疃母稍锘ɡ?，具有抗白血病、抗腫瘤和增強機體免疫力的作用[8]。此外，款冬花多糖可抑制食管癌細胞的增殖和侵襲[9]。然而，尚未知款冬花多糖對乳腺癌細胞的影響，以及否它可以參與IL-6 誘導的乳腺癌細胞生物學行為。

微小RNA（miRNA）屬于非編碼RNA 小分子，可調控mRNA 降解和翻譯抑制通過特異性識別和結合靶基因3’UTR，進而調控腫瘤發展。miR-889-3p 上調限制宮頸癌細胞增殖和遷移[10]。starBase 網站預測miR-889-3p 與Toll 樣受體4（TLR4）存在結合位點，而TLR4 促進了乳腺癌惡性表型[11]，但尚未未知miR-889-3p/TLR4 在乳腺癌中的作用機制。文章通過體外培養IL-6 誘導的乳腺癌細胞，探討款冬花多糖聯合miR-889-3p/TLR4 調控軸對乳腺癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 重組人IL-6、RNA 提取試劑盒與cDNA 合成試劑盒購自上海碧云天生物；款冬花購自亳州市佰林堂藥業有限公司；SYBR Green 試劑盒購自北京天根生化；SDS-PAGE 凝膠制備試劑、ECL 化學發光試劑購自武漢博士德；人乳腺癌細胞MCF-7 購自美國ATCC；LipofectamineTM 3000 購自美國Invitrogen；兔抗人TLR4 抗體與HRP 標記的山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）二抗購自美國Abcam 公司；美國Promega 公司設計構建野生型載體WTTLR4 與突變型載體MUT-TLR4；miR-889-3p 模擬物（miR -889 -3p mimics）、miR -889 -3p 抑制物（miR -889 -3p -inhibitors） 及陰性對照mimic NC（miR-NC）、inhibitor NC 序列（NC-inhibitor）購自廣州銳博生物公司；噻唑藍（MTT）、Matrigel 基質膠購自北京索萊寶公司；兔抗人基質金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9 抗體購自美國CST 公司。

1.2 方法

1.2.1 提取款冬花多糖[8]款冬花磨碎成粉末，取60 目篩篩選款冬花粉末，按照1∶27 比例加入95%乙醇脫脂，加入一定劑量水超聲浸提脫脂后的粉末，68 ℃提取36 min，提取3 次，收集并合并3 次濾液，濃縮后去除蛋白，醇沉、抽濾后依次用無水乙醇、丙酮、乙醚清洗，真空干燥后得到款冬花多糖，用苯酚-硫酸法檢測款冬花多糖的提取率（2.01%），用培養基稀釋款冬花多糖作為實驗濃度：20、40、80 mg/L。

1.2.2 實驗處理及分組 25 ng/mL 的IL-6 處理24 h[12]，記為IL-6 組。經20、40、80 mg/L 的款冬花多糖與IL-6 處理24 h，記為IL-6+款冬花多糖20 mg/L組、IL-6+款冬花多糖40 mg/L 組、IL-6+款冬花多糖80 mg/L 組。轉染miR-NC（5’-UUCUCCGAACGUG UCACGUTT-3’）、miR-889-3p mimics（5’-TTAATA TCGGACAACCATTGT-3’）25 ng/mL IL-6 處理，記為IL-6+miR-NC 組、IL-6+miR-889-3p 組。轉染NC-inhibitor（5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’）、miR-889-3p-inhibitors（5’-ACAATGGTTGTCC GATATTAA-3’）80 mg/L 款冬花多糖與25 ng/mL IL-6 處理24 h，分別記為IL-6+款冬花多糖80 mg/L+NC-inhibitor 組、IL-6+款冬花多糖80 mg/L+miR-889-3p-inhibitors 組。

1.2.3 MTT 檢測細胞增殖 每孔加入20 μL MTT溶液，2～4 h 后，加入150 μL DMSO，直至孔中甲臜溶解，應用酶標儀分析樣品（OD 490 nm）。

1.2.4 平板克隆形成實驗 MCF-7 細胞（500 個/孔），于37 ℃培養14 d，棄培養基。500 μL 甲醇固定20 min，1%結晶紫染色15 min 后，用相機對每孔進行單獨拍照。

1.2.5 TranswellTM實驗 遷移實驗：不含血清的培養基懸浮細胞，（5×104）個加入小室的上室，下室加入含10%胎牛血清培養液，于37 ℃培養箱內培養24 h，取出小室，將上室內的細胞擦去，多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染液染色20 min，用棉簽輕輕擦拭小室的上側，顯微鏡下統計遷移細胞數。侵襲實驗：將Matrigel 基質膠涂于上室聚碳酸酯膜表面，隨后1×105細胞被加入這個上室中，后續實驗步驟同遷移實驗。（放大倍數，200×）

1.2.6 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR） 1×107個細胞經1 mL Trizol 試劑裂解液裂解細胞后，參照BeyoRTTM ⅡcDNA 試劑盒合成cDNA。取50 ng cDNA 利用SuperReal 熒光定量預混試劑盒進行基因表達定量分析。采用2-ΔΔCt法計算miR-889-3p、TLR4 mRNA 表達。

1.2.7 雙熒光素酶報告實驗驗證miR-889-3p 對TLR4 的靶向調控 構建野生型載體WT-TLR4、突變型載體MUT-TLR4 熒光素酶表達載體后，與miR-NC、miR-889-3p mimics 共轉染至MCF-7 細胞，檢測其熒光素酶活性。轉染miR-NC、miR-889-3p mimics、NC-inhibitor、miR-889-3p-inhibitors 至MCF-7 細胞后，蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測TLR4 蛋白表達。

1.2.8 Western blot 加入蛋白裂解液提取總蛋白后，對樣品統一定量并上樣，在目的蛋白泳動到膠下緣停止電泳，將分離的蛋白凝膠轉移至PVDF 膜，將膜從電轉槽取出浸沒于封閉液2 h，分別加入TLR4、MMP-2、MMP-9、GAPDH 抗體孵育過夜，和二抗稀釋液孵育1 h，用ECL 試劑進行發光鑒定。

1.3 統計學方法 采用SPSS21.0 統計學軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，且均符合正態分布，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 款冬花多糖對IL-6 誘導的MCF-7 細胞增殖、遷移及侵襲的影響 與對照組比較，IL-6 組細胞增殖率升高，克隆形成數、遷移及侵襲細胞數增多，MMP-2、MMP-9 蛋白水平升高（P＜0.05）；與IL-6 組比較，IL-6+款冬花多糖20 mg/L 組、IL-6+款冬花多糖40 mg/L 組、IL-6+款冬花多糖80 mg/L 組細胞增殖率降低，克隆形成數、遷移及侵襲細胞數減少，MMP-2、MMP-9 蛋白水平降低（P＜0.05）。見圖1、圖2、表1。

圖1 Western blot 法檢測MMP-2、MMP-9 蛋白表達量Fig.1 Detection of MMP-2 and MMP-9 protein expression by Western blot method

表1 款冬花多糖對IL-6 誘導的MCF-7 細胞增殖、遷移及侵襲的影響（±s，n=9）Tab.1 Effects of polysaccharides from Tussilago farfara on IL-6-induced proliferation，migration and invasion of MCF-7 cells（±s，n=9）

表1 款冬花多糖對IL-6 誘導的MCF-7 細胞增殖、遷移及侵襲的影響（±s，n=9）Tab.1 Effects of polysaccharides from Tussilago farfara on IL-6-induced proliferation，migration and invasion of MCF-7 cells（±s，n=9）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與IL-6 組比較，#P＜0.05；與IL-6+款冬花多糖20 mg/L 組比較，△P＜0.05；與IL-6+款冬花多糖40 mg/L 組比較，▽P＜0.05。

組別 增殖率（%） 克隆形成數（個） 遷移細胞數（個） 侵襲細胞數（個） MMP-2 MMP-9對照組 0.00± 0.00 55.11±8.49 83.78± 2.22 75.44± 3.50 0.44±0.05 0.35±0.04 IL-6 組 211.12±18.62* 154.11±7.10* 210.56±11.95* 223.67±17.37* 0.95±0.06* 0.94±0.03*IL-6+款冬花多糖20 mg/L 組 143.41±11.65# 112.89±8.22# 176.44± 3.97# 181.56± 4.61# 0.73±0.02# 0.74±0.05#IL-6+款冬花多糖40 mg/L 組 54.67± 8.78#△ 94.44±1.94#△ 153.33± 8.32#△ 158.33± 5.07#△ 0.64±0.03#△ 0.62±0.02#△IL-6+款冬花多糖80 mg/L 組 25.01± 7.07#△▽ 73.11±2.42#△▽ 103.89± 2.09#△▽ 118.44±10.22#△▽ 0.54±0.03#△▽ 0.51±0.02#△▽

2.2 款冬花多糖對IL-6 誘導的MCF-7 細胞中miR-889-3p 與TLR4 表達量的影響 IL-6 處理抑制miR-889-3p 表達，促進TLR4 表達（P＜0.05）；而與IL-6 組比較，IL-6+款冬花多糖20 mg/L 組、IL-6+款冬花多糖40 mg/L 組、IL-6+款冬花多糖80 mg/L組miR-889-3p 的表達量升高，TLR4 的表達量降低（P＜0.05）。見圖3、表2。

圖3 Western blot 法檢測TLR4 蛋白表達量Fig.3 Detection of TLR4 protein expression Western blot method

表2 款冬花多糖對IL-6 誘導的MCF-7 細胞中miR-889-3p 與TLR4 表達量的影響（±s，n=9）Tab.2 Effects of polysaccharides from Tussilago farfara on IL-6-induced expression of miR-889-3p and TLR4 in MCF-7 cells（±s，n=9）

表2 款冬花多糖對IL-6 誘導的MCF-7 細胞中miR-889-3p 與TLR4 表達量的影響（±s，n=9）Tab.2 Effects of polysaccharides from Tussilago farfara on IL-6-induced expression of miR-889-3p and TLR4 in MCF-7 cells（±s，n=9）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與IL-6 組比較，#P＜0.05；與IL-6+款冬花多糖20 mg/L 組比較，△P＜0.05；與IL-6+款冬花多糖40 mg/L組比較，▽P＜0.05。

?組別 miR-889-3p TLR4 mRNA TLR4 蛋白對照組 1.00±0.06 1.00±0.03 0.29±0.06 IL-6 組 0.21±0.01* 4.19±0.14* 0.92±0.04*IL-6+款冬花多糖20 mg/L 組 0.44±0.02# 3.17±0.11# 0.72±0.02#IL-6+款冬花多糖40 mg/L 組 0.66±0.04#△ 2.08±0.07#△ 0.58±0.04#△IL-6+款冬花多糖80 mg/L 組 0.82±0.05#△▽ 1.30±0.05#△▽ 0.44±0.04#△▽

2.3 雙熒光素酶報告實驗驗證miR-889-3p 與TLR4 的靶向調控作用 starBase 預測顯示miR-889-3p 與TLR4 存在結合位點，見圖4A。miR-889-3p 轉染抑制細胞的熒光素酶活性（P＜0.05）；共轉染突變型載體MUT-TLR4 的MCF-7 細胞實驗中，兩組熒光素酶活性差異無統計學意義。見圖4B。與miR-NC 組比較，miR-889-3p 組TLR4 蛋白水平降低（P＜0.05）；與NC-inhibitor 組比較，miR-889-3pinhibitors 組TLR4 蛋白水平升高（P＜0.05）。見圖4C。

圖4 雙熒光素酶報告實驗驗證miR-889-3p 與TLR4 的靶向調控作用Fig.4 Validation of targeted regulation of miR-889-3p with TLR4 by Dual luciferase reporter assay

2.4 miR-889-3p 過表達對IL-6 誘導的MCF-7 細胞增殖、遷移及侵襲的影響 與IL-6+miR-NC 組比較，IL-6+miR-889-3p 組TLR4 蛋白水平降低，細胞增殖率降低，克隆形成數、遷移及侵襲細胞數減少，MMP-2、MMP-9 蛋白水平降低（P＜0.05）。見圖5、圖6、表3。

圖5 Western blot 法檢測TLR4、MMP-2、MMP-9 蛋白表達量Fig.5 Detection of TLR4，MMP -2，and MMP -9 protein expression by Western blot method

圖6 miR-889-3p 過表達對IL-6 誘導的MCF-7 細胞增殖、遷移及侵襲影響的細胞圖Fig.6 Cytological map of effect of miR-889-3p overexpression on IL-6-induced proliferation, migration and invasion of MCF-7 cell

表3 miR-889-3p 過表達對IL-6 誘導的MCF-7 細胞增殖、遷移及侵襲的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of miR-889-3p overexpression on IL-6-induced proliferation，migration and invasion of MCF-7 cells（±s，n=9）

表3 miR-889-3p 過表達對IL-6 誘導的MCF-7 細胞增殖、遷移及侵襲的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of miR-889-3p overexpression on IL-6-induced proliferation，migration and invasion of MCF-7 cells（±s，n=9）

注：與IL-6+miR-NC 組比較，*P＜0.05。

組別 miR-889-3p TLR4 蛋白 增殖率（%）克隆形成數（個）遷移細胞數（個）侵襲細胞數（個） MMP-2 MMP-9 IL-6+miR-NC 1.00±0.06 0.91±0.03 210.77±24.55 153.89±5.37 210.67±7.60 223.56±18.72 0.94±0.03 0.94±0.02 IL-6+miR-889-3p 2.20±0.09* 0.61±0.04* 88.14±12.19* 92.89±3.92* 156.78±8.66* 155.44± 9.68* 0.62±0.04* 0.58±0.04*

2.5 抑制miR-889-3p 表達可降低款冬花多糖對IL-6 誘導的MCF-7 細胞增殖的抑制作用 IL-6+款冬花多糖80 mg/L+NC-inhibitor 組、IL-6+款冬花多糖80 mg/L+miR-889-3p-inhibitors 組與IL-6+款冬花多糖80 mg/L+NC-inhibitor 組比較，IL-6+款冬花多糖80 mg/L+miR-889-3p-inhibitors 組TLR4 蛋白水平升高，細胞增殖率升高，克隆形成數增多（P＜0.05）。見圖7、圖8、表4。遷移及侵襲細胞數增多，MMP-2、MMP-9 蛋白水平升高（P＜0.05）。見圖9、圖10、表5。

圖7 Western blot 法檢測TLR4 蛋白表達量Fig.7 Detection of TLR4 protein expression by Western blot method

圖8 抑制miR-889-3p 表達對款冬花多糖引起IL-6誘導的MCF-7 細胞增殖抑制作用的細胞圖Fig.8 Gytological map of inhibitory effect of polysaccharides in Tussilago farfara on IL-6-induced proliferation of MCF-7 cells by inhibition of miR-889-3p expression

圖9 Western blot 法檢測MMP-2、MMP-9 蛋白表達量Fig.9 Detection of MMP-2 and MMP-9 protein expression

圖10 抑制miR-889-3p 表達對款冬花多糖引起IL-6誘導的MCF-7 細胞遷移及侵襲抑制作用Fig.10 Gytological map of inhibitory effect of polysaccharides in Tussilago farfara on IL-6-induced migration and invasion of MCF-7 cells by inhibition of miR-889-3p expression

表4 抑制miR-889-3p 表達對款冬花多糖引起IL-6誘導的MCF-7 細胞增殖抑制作用（±s，n=9）Tab.4 Inhibitory effect of polysaccharides in Tussilago farfara on IL-6-induced proliferation of MCF-7 cells by inhibition of miR-889-3p expression（±s，n=9）

表4 抑制miR-889-3p 表達對款冬花多糖引起IL-6誘導的MCF-7 細胞增殖抑制作用（±s，n=9）Tab.4 Inhibitory effect of polysaccharides in Tussilago farfara on IL-6-induced proliferation of MCF-7 cells by inhibition of miR-889-3p expression（±s，n=9）

注：與IL-6+款冬花多糖80 mg/L+NC-inhibitor 組比較，*P＜0.05。

克隆形成數（個）IL-6+款冬花多糖組別 miR-889-3p TLR4 蛋白 增殖率（%）1.00±0.05 0.45±0.05 25.22± 7.03 73.56±4.53 80 mg/L+NC-inhibitor IL-6+款冬花多糖80 mg/L+miR-889-3p-inhibitors 0.38±0.04* 0.78±0.04* 141.56±14.83* 123.78±3.27*

表5 抑制miR-889-3p 表達可對款冬花多糖引起IL-6 誘導的MCF-7 細胞遷移及侵襲抑制作用（±s，n=9）Tab.5 Inhibitory effect of polysaccharides in Tussilago farfara on IL-6-induced migration and invasion of MCF-7 cells by inhibition of miR-889-3p expression（±s，n=9）

表5 抑制miR-889-3p 表達可對款冬花多糖引起IL-6 誘導的MCF-7 細胞遷移及侵襲抑制作用（±s，n=9）Tab.5 Inhibitory effect of polysaccharides in Tussilago farfara on IL-6-induced migration and invasion of MCF-7 cells by inhibition of miR-889-3p expression（±s，n=9）

注：與IL-6+款冬花多糖80 mg/L+NC-inhibitor 組比較，*P＜0.05。

組別 遷移細胞數（個）侵襲細胞數（個） MMP-2 MMP-9 IL-6+款冬花多糖80 mg/L+NC-inhibitor 102.56±3.61 118.22±9.52 0.53±0.02 0.52±0.04 IL-6+款冬花多糖80 mg/L+miR-889-3p-inhibitors 171.56±9.99* 184.33±9.43* 0.79±0.03* 0.82±0.02*

3 討論

近年來，研究表明中藥可抑制乳腺癌細胞增殖及轉移，但作用機制仍需探究[13]。miRNA 作為一種進化保守的小RNA 能夠通過和靶mRNA 堿基互補配對參與包括乳腺癌在內的癌癥發展，研究指出miRNA 具有作為乳腺癌治療潛在靶點的潛力[14]。

款冬花多糖可通過抑制肺癌細胞增殖及促進細胞凋亡從而發揮抗肺癌作用[15]。研究表明款冬花提取物還可抑制炎癥因子的釋放從而緩解病理過程[16]。本研究結果顯示，IL-6 誘導的乳腺癌細胞增殖率升高，克隆形成數增多，分析原因可能為由于炎癥反應過于強烈或長期存在導致乳腺癌的發生，炎癥與腫瘤發生發展關系密切，同時炎癥反應可能激活癌基因從而促使細胞惡性轉化進而誘導腫瘤的發生，巨噬細胞、淋巴細胞、腫瘤細胞等可產生IL-6，IL-6 可參與炎癥反應而促進免疫細胞增殖從而引起腫瘤的發生，因而抗IL-6 治療可能作為治療腫瘤的方法之一。本研究指出款冬花多糖能降低IL-6 誘導的乳腺癌細胞增殖率，克隆形成數、遷移及侵襲細胞數增加。MMP-2、MMP-9 屬于鋅依賴性內肽酶家族成員，在轉移環境中能促使細胞轉移[17]。本文數據指出款冬花多糖處理能緩解IL-6 誘導的MMP-2、MMP-9 蛋白水平增加。以上結果表明款冬花多糖抑制IL-6 誘導的乳腺癌細胞增殖和運動。但款冬花多糖影響IL-6 誘導的乳腺癌細胞生物學行為的分子機制尚需進一步探究。

本研究發現IL-6 誘導的乳腺癌細胞中miR-889-3p 的表達量降低，而TLR4 的表達量升高，進一步分析發現隨著款冬花多糖作用劑量的增加，IL-6誘導的乳腺癌細胞中miR-889-3p 的表達量升高，TLR4 的表達量降低。研究表明miR-889-3p 在宮頸癌中表達下調，上調其表達可抑制宮頸癌發展進程[18]。同時本研究證實miR-889-3p 可特異性結合TLR4 mRNA 的3’UTR 而抑制其表達。研究表明TLR4 表達異常與炎癥反應有關，其與配體結合后可激活細胞核因子κB（NF-κB）通路從而促進炎癥因子的轉錄進而加重炎癥反應，最終誘導腫瘤細胞增殖及轉移[19-20]。本研究結果顯示，miR-889-3p 靶向調控TLR4，miR-889-3p 過表達對IL-6 誘導的MCF-7 細胞增殖、遷移及侵襲的影響具有抑制作用，抑制miR-889-3p 表達可降低款冬花多糖對IL-6誘導的MCF-7 細胞增殖的抑制作用。而且miR-889-3p 低表達能夠緩解款冬花多糖對IL-6 誘導的MCF-7 細胞遷移及侵襲的抑制。提示款冬花多糖可通過調控miR-889-3p/TLR4 軸發揮抗乳腺癌的作用。

綜上所述，IL-6 誘導的乳腺癌細胞中miR-889-3p 的表達量降低，而TLR4 的表達量升高，款冬花多糖可通過上調miR-889-3p 的表達而抑制TLR4產生進而介導IL-6 誘導的乳腺癌細胞表型變化，本研究為款冬花多糖治療乳腺癌提供潛在靶點。