基于網絡藥理學和分子對接的補腎固齒丸治療腎虛血熱型牙周病物質基礎與作用機制研究*

樊媛芳，熊開鵬，務勇圣，顏冬蘭

（1.九芝堂股份有限公司，長沙 410221；2.成都九芝堂金鼎藥業有限公司，成都 610101）

牙周病特指只出現于牙周支持組織的各種病變，是造成牙齒松動的重要原因，在老年人群中的發生率超過80%～90%，是口腔衛生的頭號“殺手”[1]。牙周支持組織的損傷可致炎性浸潤及炎癥因子的增多，而病菌及其產物、細胞內毒素、肽基精氨酸脫亞胺酶等毒力因子可侵入體循環，誘發全身性疾病[2]。目前臨床上通常采用一般治療及抗生素等藥物輔助治療，雖具有消炎殺菌、使用方便、起效快的作用特點，但是長時間、大劑量反復用藥易引起耐藥性，胃腸道及肝腎毒性等不良反應大且病情反復，達不到提高宿主免疫防御功能的效果[3]。中醫更加注重整體的辨證論治，認為腎臟為精氣之根本，腎主骨，齒為骨之余，精固則齒堅，齒病則因在于腎[4]。因此中醫在治療牙周病時，多秉持著外散風火、內清積熱、滋陰補腎、清熱解毒、涼血活血和祛瘀止痛的原則。對腎虛血熱型牙周病的治療旨在助陽補腎、滋陰清火，達到扶正祛邪、標本兼治的目的[5]。

補腎固齒丸能顯著提高牙周炎患者的臨床有效率，炎癥反應及牙周狀態均有明顯改善，體現為血清炎性因子超敏C 反應蛋白（hsCRP）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平得到顯著抑制；菌斑指數評分（PLI）、探診出血（BOP）、探診深度（PD）、臨床附著喪失（CAL）等均有明顯降低，患者口腔功能恢復[6-8]。并通過調節血清骨鈣素（OCN）的表達水平改善慢性牙周炎模型大鼠牙槽骨吸收、促進牙槽骨修復重建過程[9]。方中各藥配伍，共奏滋陰補腎、強筋健齒、活血消瘀、涼血解毒之功。因此該研究旨在通過采用網絡藥理學及分子對接的方法對補腎固齒丸復方治療腎虛血熱型牙周病有效物質基礎及作用機制進行探討，以期為該方在后續實驗研究及臨床應用提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/index.php），本草組鑒（HERB，http：//drug.ac.cn/），中醫藥百科全書（ETCM，http：//www.tcmip.cn），中醫藥整合藥理學研究平臺（TCMIP）v2.0（http：//www.tcmip.cn），有機小分子生物活性數據（PubChem，http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），蛋白質數據庫（UniProt，http：//www.uniprot.org/），Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/，http：//www.swisstargetprediction.ch/），在線《人類孟德爾遺傳》（OMIM，https：//omim.org/），人類基因數據庫（GeneCards）（https：//www.genecards.org/），蛋白質互作數據庫（STRING，http：//string-db.org/），富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）（http：//www.genome.jp/kegg/），Cytoscape 3.8.2 軟件，Metascape 基因富集分析平臺（https：//metascape.org/），世界蛋白質數據庫（RCSB PDB，https：//www.pdbus.org/），分子操作環境（MOE）2019 軟件，補腎固齒丸（成都九芝堂金鼎藥業有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 補腎固齒丸化學成分靶標 在TCMSP/HERB 等數據庫和平臺中檢索補腎固齒丸復方中“熟地黃”“地黃”“雞血藤”“紫河車”“鹽骨碎補”“漏蘆”“酒丹參”“酒五味子”“山藥”“醋郁金”“炙黃芪”“牛膝”“野菊花”“茯苓”“枸杞子”“牡丹皮”“鹽澤瀉”“肉桂”共18 味藥材對應的活性成分，按照相應的藥物代謝動力學（ADME）參數，根據口服生物利用度（OB）和類藥性（DL），設定0B≥20%且DL≥0.1，及Lipinsk 五原則（Mw ≤500，miLogP ≤5，nOHNH≤5，nOH≤10）的條件進行篩選。并在蛋白數據庫查詢靶標的基因名和Uniprot ID。

1.2.2 牙周病相關基因 在Genecards 及OMIM 數據庫查詢 “Kidney deficiency and blood heat periodontal disease”“Kidney blood heat type periodontal disease”所對應的靶標作為疾病靶標信息。

1.2.3 補腎固齒丸復方治療牙周病相關靶標預測 采用R 語言代碼對補腎固齒丸治療牙周病的共同靶標統計，并對此進行蛋白互作（PPI）網絡分析，通過Cytoscape 3.8.2 軟件進行可視化及模塊分析，篩選均大于介數中心性及度中心性平均值的成分，留作后續分析。在該軟件中篩選這些成分大于度中心性平均值的靶標，作為后續分析的靶標。

1.2.4 基因功能估計分析 將篩選的靶基因通過Metascape 平臺進行GO 功能富集分析，P 值＜0.01，并以條形圖展示。

1.2.5 KEGG 富集分析 采用Metascape 平臺對篩選的靶基因進行KEGG 通路富集，挑選與腎虛血熱型牙周病相關的信號通路，設定P 值＜0.01。

1.2.6 補腎固齒丸復方核心成分與關鍵蛋白分子對接 下載核心成分2D 結構的sdf 文件及PDB 格式的蛋白結構。按照文獻[10]進行蛋白篩選，具體原則如下：來源于HUMAN，分辨率≤2.5 ?、并盡可能低，結構中有共晶小分子配體且配體與待對接小分子相似度高（RMSD≤2 ?），蛋白結構氨基酸序列較完整。利用MOE 2019 軟件對蛋白進行準備（去水、去小分子、能量最小化等），并利用分子空洞技術判斷活性位點（例如軟件中site Finder 模塊，根據經驗規律，疏水殘基最多的空洞為活性位點）后進行誘導性對接；通過結合能Score 值來判斷兩者結合能力的大小，Score 值越小，結合能力越強，表示小分子越容易與受體蛋白結合。

2 結果

2.1 固齒丸復方中活性成分及疾病及成分對應靶標預測 在TCMSP 及HERB、ETCM、TCMIP 數據庫及平臺中查詢到符合篩選條件的“補腎固齒丸”復方中活性成分共1 081 個。在Genecards 及OMIM 數據庫共收集到腎虛血熱型牙周病相關靶標5 310 個，合并后去除重復數據，得到3 193 個疾病靶基因。將各個平臺及數據庫中查詢篩選出的1 081 個化學成分對應的靶標，通過Uniprot 數據庫查詢蛋白的基因名，去除重復數據后共得到2 060 條靶基因。

2.2 補腎固齒丸有效活性成分治療牙周病相關靶標的PPI 網絡構建與分析 將補腎固齒丸復方中篩選得到的藥物靶標與得到的疾病靶標利用R 語言代碼進行韋恩圖及交集靶標的分析，并按照≥介數中心性及度中心性均值的條件篩選得到12 個核心成分，見表1。其共同靶標有296 個，大于度中心性均值的前25 位的靶標分別為核受體輔激活因子2（NCOA2）、環加氧酶1 （PTGS1）、雌激素受體1（ESR1）、雄激素受體（AR）、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARG）、醛糖還原酶抗體（AKR1B1）、尿激酶（PLAU）、雌激素受體2（ESR2）、雌激素合成酶（CYP19A1），作為后續分析的靶標。

表1 補腎固齒丸復方12 位核心成分Tab.1 Twelve core components of Bushen Guchi Pill compound

運用R 語言對296 個關鍵靶標進行可視化，并形成條形圖，見圖1。同時在String 平臺將上步中得到的25 個藥物靶基因進行分析，結果顯示該網絡中共有節點25 個，邊96 條，見圖2。兩者交集的靶基因有3 個，分別為ESR1、EGFR、PIK3CA，說明這3 個靶基因在疾病治療過程中發揮重要作用。

圖1 296 個交集靶標PPI 網絡關鍵蛋白樹形圖Fig.1 Bar graph of key proteins in the PPI network of 296 intersection targets

圖2 25 個關鍵靶標PPI 網絡關系圖[中等置信度（0.400）]Fig.2 Bar graph of key proteins in the PPI network of 25 intersection targets[medium confidence(0.400)]

2.3 補腎固齒丸“活性成分-成分對應靶標-牙周病相關靶標” 網絡的構建 利用Cytoscape 3.8.2 軟件構建補腎固齒丸“活性成分-成分對應靶標-牙周病相關靶標”網絡。并進行網絡拓撲學結構分析，按照文獻[11]（以均≥介數中心性及度值均值）篩選條件篩選出關鍵靶標126 個，含有PTGS1、AR、CYP19A1、ESR2、ESR1、11-β-羥基類固醇脫氫酶1（HSD11B1）、孕激素受體（PGR）、聚[ADP-核糖]聚合酶1（PARP1）、環加氧酶2（PTGS2）、人腺苷A2A 受體（ADORA2A）等關鍵靶標。見圖3。

圖3 補腎固齒丸“活性成分-成分對應靶標-牙周病相關靶標”相互作用網絡Fig.3 Interaction network of “active ingredient-component corresponding target-periodontitis related targets” in Bushen Guchi Pill

2.4 GO 功能分析結果 在Metascape 平臺對2.3步中篩選出來的25 個關鍵靶基因進行GO 生物學功能富集分析，設定P＜0.01。發現這25 種關鍵蛋白主要參與的生物過程有程序性細胞死亡的正向調節、細胞對有機氮化合物的反應、酶聯受體蛋白信號通路、miRNA 轉錄的調控、神經元凋亡過程的調節、凋亡信號通路、平滑肌細胞增殖的調節等。主要參與的分子功能為核受體活性、蛋白激酶活性、酶激活劑活性、生長因子結合、血紅素結合、內肽酶活性、蛋白質同二聚活性。細胞組分主要富集在核膜、轉錄調控復合體、染色體/端粒區及細胞前緣位置。詳見圖4、5、6。

圖4 補腎固齒丸治療腎虛血熱型牙周病相關潛在靶標生物過程的GO 分析Fig.4 GO analysis of biological processes of potential targets related to kidney deficiency blood heat periodontal disease treated with Bushen Guchi Pill

圖5 補腎固齒丸治療腎虛血熱型牙周病相關潛在靶標分子功能的GO 分析Fig.5 GO analysis of molecular functions of potential targets related to kidney deficiency blood heat periodontal disease treated with Bushen Guchi Pill

圖6 補腎固齒丸治療腎虛血熱型牙周病相關潛在靶標細胞組分的GO 分析Fig.6 GO analysis of the cellular components of potential targets related to kidney deficiency blood heat periodontal disease treated with Bushen Guchi Pill

2.5 KEGG 通路富集分析 將25 個關鍵靶基因通過Metascape 平臺進行通路富集。共得到10 條KEGG 通路，其中與牙周病相關的有2 條，分別為細胞腫瘤抗源（P53）信號通路及核因子-κB（NF-κB）通路。說明這2 條信號通路在補腎固齒丸治療腎虛血熱型牙周病過程中起到重要作用。見圖7。

圖7 補腎固齒丸復方治療腎虛血熱型牙周病的KEGG 信號通路分析Fig.7 KEGG signaling pathway analysis in kidney deficiency blood heat periodontal disease of treated with Bushen Guchi Pill

將2.3 中篩選出的19 個關鍵靶基因和2 條牙周病相關的信號通路導入Cytoseape 3.8.2 軟件構建“化學成分-靶基因-信號通路”網絡。見圖8。

圖8 補腎固齒丸復方中化學成分所對應的靶標與通路Fig.8 Targets and pathways corresponding to the chemical components in the Bushen Guchi Pill compound

2.6 核心成分與核心蛋白分子對接分析 將2.2結果中得到的12 種核心成分與3 種網絡靶標（ESR1、EGFR、PIK3CA） 所對應的蛋白復合晶體進行對接。以結合能Score 得分及相互作用對的數目判斷其親和力的大小，S＜0（小分子配體與蛋白受體能自發結合），S≤-4.25 kcal/mol（配體與受體有一定的結合能），S≤-5 kcal/mol（配體與受體結合能力較高，形成的構象能量低，結構穩定），S≤-7 kcal/mol（配體與受體結合能力較強）。發現各小分子配體與受體蛋白均有一定的相互作用；其中Garcinone D、Calycosin、Crotepoxide、Cnidiadin 及L -Octanoylcarnitine 分子與ESR1，137704501、Garcinone D 分子與EGFR，137704501、Garcinone D 及Crotepoxide 分子PIK3CA 結合能力較強。見表2、圖9。

圖9 配體結合靶標蛋白相互作用氨基酸位點示意圖（S≤-7.0 kcal/mol）Fig.9 Schematic diagram of amino acid sites of ligand-binding target protein interactions（S≤-7.0 kcal/mol）

3 總結

牙周病即為通常所說的牙齦發炎、出血和牙齒松動，是口腔最常見的疾病之一，也是成年人牙齒丟失的首位因素；具有病發率高、發病隱蔽、病程較長、危害性高的特點。按照病程及危及組織的不同，牙周病可分為2 種類型，一種是牙齦病（gingival disease），另一種為牙周炎（periodontitis）；其中牙齦病僅累及牙齦組織，而牙周炎則損害牙周深層組織（牙周膜、牙槽骨、牙骨質）。牙周病所致的炎癥反應可隨著體循環，引起全身性疾病（例如關節炎、腎小球腎炎、心臟內膜炎癥等），同時也是造成神經系統疾病[12]、心腦血管/糖尿病[13]、呼吸系統/骨質疏松癥、早產等疾病的發病因素[5，14]。西醫表明牙周病的病因主要在于牙菌斑（dental plaque）細菌及其產物在牙齒表面的黏附以及因營養代謝障礙、內分泌紊亂、自主神經功能紊亂等導致細菌侵襲與宿主防御間動態平衡的破壞有關。根據中醫理論，腎藏精，主骨，是人體生長發育的主要器官，腎精具有促進骨骼生長發育和修復的作用；齒為骨之余，與骨同源，賴于腎精充養而生長發育，腎虛精虧血少，齒失濡養，引起骨質瘺軟，兼以陰虛火旺，虛火上炎于齦肉，久則牙齒動搖、根露；或因宿體虛弱，或因久病耗傷正氣，氣血不足，牙齦失于滋養而病邪乘虛而入，以致齦肉菱縮，血不循經，齒齦出血，故成此病。因此，牙齒的生長和脫落與腎氣的盛衰密切相關，有“腎虛齒豁”的觀點，所以在治療腎虛血熱型牙周病時，要注意補腎涼血，從而強固牙齒[15]。

補腎固齒丸由熟地黃、生地黃、紫河車等18 味藥材組成，其中，熟地黃填精益髓、補益肝腎，為君藥；紫河車、鹽骨碎補、生地黃、雞血藤、山藥、枸杞子、炙黃芪補肝腎、益精血，又能活血涼血、通經活絡，共為臣藥；丹參、五味子、鹽澤瀉、牛膝、漏蘆、牡丹皮、野菊花能生津潤肺、健脾利濕，又能祛瘀排膿、消腫止痛，共為佐藥；肉桂引火歸原，為使藥。本著“腎生骨生髓”“齒為骨之余”的中醫理論，既補腎益精、治其本，又能清熱解毒治其標，具有補腎固齒，活血解毒的功效，故適用于治療腎虛火旺所致的牙齒酸軟、咀嚼無力、松動移位、齦腫齒衄，而慢性牙周炎體現為上述癥狀。

研究證實，補腎固齒丸0.8 g/（kg·d） 給藥30 d即可顯著改善SD 大鼠牙周組織炎癥反應、降低骨膠原酶13（MMP-13）的表達，延緩牙周組織破壞[16]。聯合消炎湯治療腎虛火旺型牙周炎的應用中，患者總有效率為82.98%，可有效改善牙齦出血、牙齒松動等癥狀，臨床療效顯著[17]，且牙槽骨密度增高、腎虛火旺主癥（牙齒酸軟、咀嚼無力、齦腫、齒衄及松動移位）及次癥（耳鳴、腰膝酸軟、五心煩熱、潮熱盜汗、口咽干燥、發脫、神疲乏力及舌象）評分等級降低、安全性良好[18]。

這與現代藥理學研究的發現不謀而合[19]。牙齦卟啉單胞菌（P.g）是導致牙周病的最大因素之一，它是一種非酵解糖的革蘭氏陰性厭氧球桿菌，形成的牙菌斑生物膜積聚在牙齒和牙根表面，導致牙周結締組織和牙槽骨的破壞，是牙齒丟失最常見的原因之一[20]。中藥及其提取物對炎癥反應、細胞生長及組織修復等具有顯著效應。

槲皮素作為廣譜抗菌活性的黃酮類物質，具有較強的抑菌活性，尤其是革蘭陰性菌；通過抑制NF-κB/血管緊張素（NLRP3）炎癥通路，降低炎癥因子TNF-α 誘導下人牙周韌帶干細胞受損[21-22]，提高其抗氧化能力，增強間充質干細胞的成骨分化能力，逆轉脂多糖誘導的成骨細胞凋亡，同時激活核因子NF-E2 相關因子（Nrf2）信號通路，降低牙周炎組織中活性氧（ROS）水平，緩解牙槽骨丟失，保護其成骨能力[23-25]。

大黃素可顯著抑制脂多糖（LPS）誘導的人牙周膜細胞的增殖活性[26]，在抑制NF-κB 信號通路表達，降低炎性因子IL-1β、白細胞介素-4（IL-4）和IL-6 合成及分泌的同時，提高牙周組織過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR）-γ 表達，從而減輕炎性因子對牙周組織的破壞、降低機體的炎癥反應[27]；并通過調節酸性哺乳動物幾丁質酶（AMCase），一種參與骨重建的生物標志物的表達，顯著降低破骨細胞分化因子（RANKL）誘導下破骨細胞生成，提高牙周組織中骨鈣素（BGP）水平，促進牙周組織恢復、降低炎癥反應及牙槽骨的丟失[28-29]；蛇床子素（Cnidiadin）亦然[30-31]。

異甘草素（Isoliquiritigenin）源于甘草，具有廣泛的生物和藥理活性，例如抗氧化、抗血小板聚集、抗腫瘤及雌激素活性等；已有研究證實其可通過下調自噬和NF-κB 信號通路的表達抑制體內破骨細胞形成和炎性骨吸收來防治骨破壞、促進成骨細胞增殖及分化；P53 是成骨/破骨細胞增殖分化中重要的調節因子，通過誘導細胞周期停滯和/或凋亡來保護細胞免于轉化，當其表達被抑制后，其下游信號分子抑癌基因（P21）表達也相對減少，成骨細胞分化增加，血管內皮生長因子（VEGF）誘導的血管生成分化增加；由此可見，P53 信號通路可能為異甘草素抑制發揮抗炎、促進成骨細胞增殖分化的新途徑[32-33]。

辛酸（Octanoic acid）為茯苓、牛膝及肉桂中的成分，有研究報道：作為食品添加劑，辛酸具有對P.g殺菌活性，抑制菌斑生物膜的形成[34]；雖然目前暫未有其他小分子及辛酸對牙周重建等的相關研究，但對疾病關鍵靶標ESR1、EGFR、PIK3CA 均具有較好的結合能力，表明這些小分子將有可能是防治牙周病的新型治療物質，具體作用機制有待進一步研究。

綜上所述，文章通過采用網絡藥理學的方法對補腎固齒丸治療腎虛血熱型牙周病的物質基礎、作用靶標及通路進行預測分析，建立了復方活性成分-疾病靶標-作用通路相互作用網絡圖；并進一步通過分子對接手段對起主要作用的12 個關鍵成分為槲皮素（Quercetin）、辛酸（Octanoic acid）及大黃素（Emodin） 等與3 種核心靶標蛋白（ESR1、EGFR、PIK3CA）所對應的蛋白復合晶體進行對接，均具有較好的結合能力。說明補腎固齒丸可通過多靶標、多通路的干預，對牙周病相關牙菌斑生成、免疫調節及炎癥反應、抗氧化應激、減輕牙槽骨丟失等方面起到調節作用，以達到治療腎虛血熱型牙周病的作用。