產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵蛋白桑的培養(yǎng)基優(yōu)化

侯俊豪，陳帥君，吳 疆，米琴娜，張熙凱，童應(yīng)凱

天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院生物技術(shù)系 天津 300384

0 引 言

蛋白質(zhì)桑樹又稱飼料桑樹，是我國的一種優(yōu)質(zhì)蛋白桑樹品種。桑葉寬而豐滿，具有極其豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，粗蛋白質(zhì)含量20%～30%，桑樹分支上的蛋白質(zhì)有8%以上，碳水化合物含量0%～5%，還含有17 種氨基酸及鉀、鈣、銅、鋅、錳、VC、VB和VA，尤其是脫氧核糖核酸。脫氧核糖核酸是一種很強(qiáng)的葡萄糖苷酶抑制劑，具有抑制糖轉(zhuǎn)化、提高人體免疫力和抗病性等藥理作用［1-2］。桑樹葉含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪酸、碳水化合物、纖維素及多種維生素［3］和礦物質(zhì)。經(jīng)過提取工藝優(yōu)化，蛋白桑的蛋白質(zhì)提取率可達(dá)40%以上，粗蛋白的含量與大多數(shù)豆科類牧草非常接近，但粗纖維含量更低，鑒于此，蛋白桑飼料［4-5］的研究和開發(fā)利用成為熱點(diǎn)。將桑葉加入斷奶仔豬的飼料中可提高仔豬的抗氧化能力和抗病能力［6］。李玉榮［7］的研究報道中提到，在保育豬的飼料中添加5%的新鮮桑葉后，豬群的腹瀉率降低，血清中尿素氮含量提高，血糖和總膽固醇含量降低，能夠提高豬的生長能力，并具有較強(qiáng)的抗痢性。王崇洲等［8］的研究結(jié)果表明，在肉兔飼料中加入15%的桑葉能顯著提高肉兔的全凈膛和半凈膛率，以及肌肉中脂肪、蛋白質(zhì)、風(fēng)味氨基酸等的含量，肉色紅度、亮度和肌肉pH顯著升高。在日糧中添加桑葉粉后，泌乳水牛的生長激素、催乳素和甲狀腺素等激素的分泌增加，日產(chǎn)奶量、乳汁中蛋白質(zhì)和脂肪含量顯著升高［9］。研究發(fā)現(xiàn)，在肉羊飼糧中添加桑葉能夠降低羊肉膻味，提高熟肉率和嫩度，肉中蛋白質(zhì)和脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)含量也有明顯提升［10］。

在當(dāng)前優(yōu)質(zhì)牧草資源嚴(yán)重短缺、飼料價格上漲的背景下，把桑葉作為新型的飼料資源，不僅能提高利用率，還能提升蠶桑體系的綜合經(jīng)濟(jì)效益。但桑葉中存在單寧、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子，攝入過多會使牲畜的攝取能力受到限制，最終使其生長能力下降。發(fā)酵、蒸煮等能在一定程度上降低豆科作物中的單寧、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子含量，但如何降低或消除桑葉中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，且將桑葉更好地應(yīng)用于動物飼料，需要進(jìn)一步深入探究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

產(chǎn)朊假絲酵母，保藏于天津農(nóng)學(xué)院生物技術(shù)系微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

加入主原料10 g（其中含8 g 蛋白桑及2 g 麩皮），以此為培養(yǎng)基底物，加入一定量的蒸餾水。

1.1.3 供試材料

蛋白桑粉：市場購蛋白桑，60 ℃烘干2 h后粉碎獲得。

1.2 單因素試驗(yàn)

1.2.1 確定最佳KH2PO4用量

根據(jù)上文1.1.2 培養(yǎng)基的配方，在已有原料的基礎(chǔ)上分別加入0.005、0.01、0.015、0.02、0.025 g KH2PO4。按照培養(yǎng)基制備方法進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)束后，在40 倍光學(xué)顯微鏡下，用血球計數(shù)法測定產(chǎn)朊假絲酵母菌的菌數(shù)，以確定最佳的KH2PO4用量。重復(fù)試驗(yàn)3 次。

1.2.2 確定最佳（NH4）2SO4用量

根據(jù)上文1.1.2 培養(yǎng)基的配方，在已有原料的基礎(chǔ)上分別加入0.05、0.1、0.15 g的（NH4）2SO4固體顆粒。按照培養(yǎng)基制備方法進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)束后，在40 倍光學(xué)顯微鏡下，用血球計數(shù)法測定產(chǎn)朊假絲酵母菌的菌數(shù)，以確定最佳的（NH4）2SO4用量。重復(fù)試驗(yàn)3 次。

1.2.3 確定最佳MgSO4用量

根據(jù)上文1.1.2 培養(yǎng)基的配方，在已有原料的基礎(chǔ)上分別加入0.5、1、1.5 g MgSO4。按照培養(yǎng)基制備方法進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)束后，在40 倍光學(xué)顯微鏡下，用血球計數(shù)法測定產(chǎn)朊假絲酵母菌的菌數(shù)，以確定最佳的MgSO4用量［11］。重復(fù)試驗(yàn)3 次。

1.2.4 確定最佳葡萄糖用量

根據(jù)上文1.1.2 培養(yǎng)基的配方，在已有原料的基礎(chǔ)上分別加入0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 g 的葡萄糖固體顆粒。按照培養(yǎng)基制備方法進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)束后，在40 倍光學(xué)顯微鏡下，用血球計數(shù)法測定產(chǎn)朊假絲酵母菌的菌數(shù)，以確定最佳的葡萄糖用量。重復(fù)試驗(yàn)3 次。

1.2.5 確定最佳加水量

根據(jù)上文1.1.2 培養(yǎng)基的配方，在已有原料的基礎(chǔ)上分別加入0.1 g（NH4）2SO4、0.01 g KH2PO4、0.6 g葡萄糖、0.001 g MgSO4，改變培養(yǎng)基中蒸餾水的添加量為10、12、14、16、18、20 mL。按照培養(yǎng)基制備方法進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)束后，在40 倍光學(xué)顯微鏡下，用血球計數(shù)法測定產(chǎn)朊假絲酵母菌的菌數(shù)，以確定最佳加水量。重復(fù)試驗(yàn)3 次。

1.3 正交試驗(yàn)

1.3.1 對添加劑的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，為探究產(chǎn)朊假絲酵母的最適宜生長條件、優(yōu)化培養(yǎng)基配方，進(jìn)行KH2PO4、蒸餾水、MgSO4、葡萄糖、（NH4）2SO4五因素四水平 L16（45）正交試驗(yàn)，正交因素水平設(shè)計見表1，正交處理表見表2。按照上文1.1.2 中的培養(yǎng)基制備方法進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，使用40 倍光學(xué)顯微鏡，用血球計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)，得到產(chǎn)朊假絲酵母菌菌數(shù)，最后篩選出最優(yōu)組合。

表1 產(chǎn)朊假絲酵母菌發(fā)酵正交水平Tab.1 Orthogonal fermentation level of Candida utilis

表2 產(chǎn)朊假絲酵母菌發(fā)酵正交處理表Tab.2 Orthogonal fermentation treatment table of Candida utilis

1.3.2 正交試驗(yàn)準(zhǔn)確性驗(yàn)證

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，得到產(chǎn)朊假絲酵母菌的培養(yǎng)基最佳配方。重復(fù)試驗(yàn)3 次，驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。

1.4 產(chǎn)朊假絲酵母菌菌數(shù)的測定方法

取一支50 mL的離心管,在離心管中加入1 g培養(yǎng)好的樣品，加入蒸餾水至30 mL，旋渦振蕩儀振蕩3 min左右，振蕩結(jié)束后用移液管吸取1 mL樣品加入10 mL 刻度試管，加蒸餾水至10 mL，振蕩混勻，用微量移液器吸取100 μL菌液在血球計數(shù)板上，用40 倍光學(xué)顯微鏡觀察和計數(shù)。公式如下：

酵母細(xì)胞數(shù)值/1 g=（80 個小方格細(xì)胞總數(shù)/80×400×104×稀釋倍數(shù)）/樣品量

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

利用顯微鏡和血球計數(shù)板測定產(chǎn)朊假絲酵母菌的菌數(shù)。利用Excel軟件，算出平均值和極差，并繪制柱形圖。利用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件，處理數(shù)據(jù)的計算標(biāo)準(zhǔn)差、相關(guān)性和顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 KH2PO4 對產(chǎn)朊假絲酵母菌發(fā)酵的影響

為了探究KH2PO4含量對產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵的影響，設(shè)置了以下幾組不同的KH2PO4含量試驗(yàn)，結(jié)果見圖1。

圖1 KH2PO4 對酵母菌發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of KH2PO4 on yeast fermentation

在培養(yǎng)基中加入KH2PO4，磷和鉀是微生物生長繁殖所必需的因素。KH2PO4整體呈現(xiàn)弱酸性，在培養(yǎng)基中具有緩沖液作用，能夠維持酵母菌生長繁殖所需要的離子環(huán)境。當(dāng)KH2PO4加入量過多時，培養(yǎng)基中pH波動幅度較大，導(dǎo)致酵母菌數(shù)量減少。

后續(xù)正交試驗(yàn)中的KH2PO4水平選取0.015 g及其左右的數(shù)值濃度（即0.01、0.015、0.02、0.025 g）進(jìn)行。

2.2 (NH4)2SO4 對產(chǎn)朊假絲酵母菌發(fā)酵的影響

為了探究（NH4）2SO4含量對產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵的影響，設(shè)置了以下幾組不同的（NH4）2SO4含量試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 （NH4）2SO4 對酵母菌發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of（NH4）2SO4 on yeast fermentation

在發(fā)酵過程中，產(chǎn)朊假絲酵母菌消耗碳源，產(chǎn)生酸性物質(zhì)，導(dǎo)致培養(yǎng)基中的酸堿環(huán)境發(fā)生變化，影響產(chǎn)朊假絲酵母菌的生長繁殖。（NH4）2SO4是一種酸性鹽，其中的銨離子是緩沖離子，在為培養(yǎng)基提供氮源的同時，也作為緩沖液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的酸堿平衡。當(dāng)（NH4）2SO4加入量過多時，產(chǎn)朊假絲酵母菌的生長繁殖速率下降，產(chǎn)朊假絲酵母菌數(shù)量也因此減少。

后續(xù)正交試驗(yàn)中的（NH4）2SO4水平選取0.1 g及其左右的數(shù)值濃度（即0、0.05、0.1、0.15 g）進(jìn)行。

2.3 MgSO4 對產(chǎn)朊假絲酵母菌發(fā)酵的影響

為了探究MgSO4含量對產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵的影響，設(shè)置了以下幾組不同試驗(yàn)，結(jié)果見圖3。

圖3 MgSO4 對酵母菌發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of MgSO4 on yeast fermentation

MgSO4中含有大量的鎂離子，鎂離子是一種活化劑，能夠?yàn)楫a(chǎn)朊假絲酵母菌的生長繁殖提供無機(jī)營養(yǎng)元素。MgSO4可促進(jìn)培養(yǎng)過程中各反應(yīng)的進(jìn)行，能夠加快產(chǎn)朊假絲酵母菌的生長繁殖速度，使培養(yǎng)基上產(chǎn)朊假絲酵母菌的菌數(shù)增多。當(dāng)MgSO4加入量過多時，培養(yǎng)基中鹽含量較高，細(xì)胞的滲透壓增大，導(dǎo)致酵母菌失水死亡，使產(chǎn)朊假絲酵母菌菌數(shù)減少。

后續(xù)正交試驗(yàn)中的MgSO4水平選取0.001 g及其左右的數(shù)值濃度（即0、0.000 5、0.001、0.001 5 g）進(jìn)行。

2.4 葡萄糖對產(chǎn)朊假絲酵母菌發(fā)酵的影響

為了探究葡萄糖含量對產(chǎn)朊假絲酵母菌發(fā)酵的影響，設(shè)置了以下幾組不同葡萄糖含量試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 葡萄糖對酵母菌發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of glucose on yeast fermentation

葡萄糖在產(chǎn)朊假絲酵母的發(fā)酵培養(yǎng)基中有重要作用。發(fā)酵系統(tǒng)中，葡萄糖為主要供能物質(zhì)。在培養(yǎng)基中，葡萄糖為碳源，能為產(chǎn)朊假絲酵母菌的生長繁殖提供所需要的營養(yǎng)物質(zhì)。發(fā)酵過程中，將葡萄糖轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，作為原料可以使反應(yīng)繼續(xù)順利進(jìn)行。葡萄糖濃度過高會抑制菌體的生長繁殖，導(dǎo)致產(chǎn)朊假絲酵母菌的菌數(shù)減少。

后續(xù)正交試驗(yàn)中的葡萄糖水平選取0.9 g及其左右的數(shù)值濃度（即0.6、0.9、1.2、1.5 g）進(jìn)行。

2.5 加水量對產(chǎn)朊假絲酵母菌發(fā)酵的影響

為了探究水的含量對于產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵的影響，設(shè)置了以下幾組不同的加水量試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖5 加水量對酵母菌發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of water addition on yeast fermentation

水是微生物生長所必需的物質(zhì)。本次試驗(yàn)中，在培養(yǎng)基中加入一定量的蒸餾水，為產(chǎn)朊假絲酵母菌提供良好的生長繁殖環(huán)境，同時將其作為溶劑，溶解培養(yǎng)基中的蛋白桑、麩皮和無機(jī)鹽。加入蒸餾水后，讓培養(yǎng)基中各組分充分混合均勻。但若添加量過多會導(dǎo)致培養(yǎng)基中各物質(zhì)的濃度降低，從而影響酵母菌的生長繁殖速率，使得產(chǎn)朊假絲酵母菌的菌數(shù)減少［12］。

后續(xù)正交試驗(yàn)中的水添加量水平選取16 mL及其左右的數(shù)值（即12、14、16、18 mL）進(jìn)行。

2.6 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對5 個單因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，測定產(chǎn)朊假絲酵母菌數(shù)量，最終數(shù)據(jù)見表3、4。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)差Tab.3 Orthogonal experimental results and standard deviation

葡萄糖在發(fā)酵過程中能提供碳源，是影響酵母菌發(fā)酵最主要的因素［13］，可在產(chǎn)朊假絲酵母菌發(fā)酵的培養(yǎng)基中（NH4）2SO4作為氮源存在，在整個發(fā)酵過程中具有重要作用。KH2PO4呈弱酸性，在培養(yǎng)基中可作為緩沖液，能夠維持酵母菌生長繁殖所需要的離子環(huán)境，也會在一定程度上對產(chǎn)朊假絲酵母菌的生長繁殖產(chǎn)生影響［14］。MgSO4作為活化劑，促進(jìn)發(fā)酵過程中各種反應(yīng)的進(jìn)行。由表3 可知，葡萄糖、水和（NH4）2SO4的含量呈正相關(guān)，而MgSO4和KH2PO4的含量與測試結(jié)果呈負(fù)相關(guān)。由表4 可知，5 個因素對產(chǎn)朊假絲酵母菌數(shù)量的影響都極顯著（P＜0.01）。

表4 5 個因素對產(chǎn)朊假絲酵母菌菌數(shù)影響的方差分析Tab.4 Variance analysis of influence of five factors on number of Candida utilis

由表3 中K值分析可知，產(chǎn)朊假絲酵母菌最佳培養(yǎng)基配方為1.2 g葡萄糖、0.025 g KH2PO4、0.05 g（NH4）2SO4、0.001 g MgSO4、16 mL蒸餾水，經(jīng)3 次重復(fù)得到的菌數(shù)平均值為10.05 億/g。

3 結(jié) 語

本試驗(yàn)主要是對桑葉進(jìn)行研究，以產(chǎn)朊假絲酵母粉為發(fā)酵菌種，發(fā)酵培養(yǎng)基中的底物為8 g蛋白桑和2 g麩皮，對KH2PO4、蒸餾水、MgSO4、葡萄糖、（NH4）2SO45 種單因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，根據(jù)結(jié)果，得到發(fā)酵產(chǎn)朊假絲酵母的最佳培養(yǎng)基中各種微量元素的含量為1.2 g葡萄糖、0.025 g KH2PO4、0.05 g（NH4）2SO4、0.001 g MgSO4、16 mL蒸餾水。在120 ℃下滅菌25 min，冷卻至室溫，加入0.1 g的產(chǎn)朊假絲酵母粉，置于電熱恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)48 h，此時得到的產(chǎn)朊假絲酵母菌數(shù)量最多、產(chǎn)朊假絲酵母能在最佳條件下生長繁殖，菌數(shù)能夠達(dá)到10.05 億/g酵母菌。■