275nm波長UVC光的皮膚安全性研究

宋承華，楊晰雅，史愛華，魏嘉麗，李虞鋒，呂毅，吳榮謙

1.西安交通大學第一附屬醫院 a.陜西省再生醫學與外科工程研究中心；b.精準外科與再生醫學國家地方聯合工程研究中心，陜西 西安 710061；2.國科溫州研究院，浙江 溫州 325001；3.陜西省信息光子重點實驗室，陜西 西安 710049

引言

波長在200～280 nm 的C 波段紫外線（Ultraviolet C，UVC）光殺菌已廣泛應用于日常生活的各個方面，如污水處理[1-3]、食品加工[4-5]、醫院殺菌[6]等。臨床上有部分基于UVC 光的設備已獲得醫療器械許可，并在臨床使用[7]，大部分設備所采用UVC 光發射光源的中心發射波長為254 nm，主要歸因于254 nm 光源比較容易獲得且價格低廉。但長期或者短時間大劑量暴露于254 nm UVC 光輻射下會誘導皮膚癌變，并會引起角膜損傷、角膜糜爛等眼部問題[8-9]，因此，尚未實現254 nm UVC 光在人體健康領域的實際廣泛應用。

近年來新光源技術的快速發展促使研究人員對不同波長UVC 光的殺菌效果和安全性進行了大量的研究。222 nm 波長的光源已被證實在一定劑量下，既不會誘導DNA 損傷，也不會導致表皮損傷，即其在一定照射劑量下對小鼠皮膚和角膜具有一定的安全性[10-14]。然而，受限于光源自身難以獲得且價格昂貴等問題，目前采用222 nm UVC-LED 作為光源的研究較少。此外，還有少量的研究聚焦于265 nm[15-16]和280 nm[17]波長。缺乏對275 nm UVC-LED 光在活體抗菌治療中的應用及安全性的系統研究。由于色氨酸和酪氨酸在波長270～280 nm 處有很強的吸收峰，270～280 nm 波長的UVC 光通常被認為是通過破壞微生物的蛋白質結構和功能來滅活微生物[18]。而核酸的最大紫外吸收峰位于260 nm 附近，270～280 nm 波長的UVC 光對核酸損傷相對較小。因此，基于275 nm 光的醫用裝置具有廣闊的應用前景。基于以上研究背景，在團隊已有實驗成果的基礎上，本項目采用自主設計搭建的275 nm UVCLED 光源，對275 nm UVC-LED 光照射對皮膚細胞和血管內皮細胞生存和生長的影響加以研究，并進一步在裸鼠皮膚上對其皮膚安全性進行探索，旨在為其應用于臨床提供理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 一般材料

本實驗采用6～7 周的Balb/c nude 雄鼠為研究對象，由西安交通大學實驗動物中心提供，本實驗過程中對動物所有的處置均符合西安交通大學醫學倫理委員會的相關要求。

1.2 275 nm UVC-LED光源

本實驗所采用的275 nm UVC-LED 光源由西安交通大學電信學院固態照明中心李虞鋒教授團隊自主設計和加工完成。光源的具體參數已在前期發表工作中加以詳細介紹[19]。如圖1a所示，光源系統由燈管、防水保護套管、恒流源驅動電路、3.7 V 鋰電池以及電池充電器組成。燈管的總長度約為2900 mm，寬 2 mm，安裝有15 塊中心輻照波長為275 nm UVC 光的5050 LED 芯片（PCD-10-V1，Photon Wave Co.,Ltd.，韓國），芯片間隔距離為20 mm。如圖1b所示，該UVC-LED 燈管發射UVC 光的波長范圍為260～290 nm，中心輻照波長為275 nm。為了確定UVC-LED 光源的具體工作參數，在前期研究中對距離光源不同距離處發射UVC 光的功率密度進行了測定。功率密度隨著與光源距離的增加呈指數下降，距離燈管1 mm 處的功率密度約為8.20 mW/cm2，距離3 mm 處約為5.00 mW/cm2，距離光源10 mm 處約為0.60 mW/cm2，距離光源15 mm 處約為0.40 mW/cm2。

圖1 275 nm UVC-LED光源的構造與發射光譜圖

1.3 275 nm UVC-LED光的細胞安全性研究

1.3.1 正常細胞生存

采用細胞計數試劑盒-8 [ Cell Counting Kit-8，CCK-8，東仁化學科技（上海）有限公司]測定不同照射劑量的275 nm UVC-LED 光對正常細胞生存的影響。即將處于對數生長期的人類永生化表皮細胞（Human Immortalized Keratinocytes，HaCaT，北京北納創聯生物技術研究院）和人臍靜脈內皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs，北京北納創聯生物技術研究院）用胰酶細胞消化液（上海碧云天生物技術有限公司）消化并收集后，采用無菌磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate-Buffered Saline，PBS，pH=7.4，上海碧云天生物技術有限公司）離心清洗3 次，最終分散至PBS中，將細胞濃度稀釋至1.5×106cells/mL。吸取40 μL細胞懸液加入定制細胞培養板（尺寸：長125 mm，寬83 mm，高17 mm，孔深10 mm，孔直徑8 mm，孔間隔20 mm）中，采用275 nm UVC-LED 光源在距離孔底15 mm 的高度處（功率密度約為0.40 mW/cm2），分別照射培養板0、3、5、8、12、20 s 后（每個時間設置3 個復孔），吸取20 μL（包含3×104個細胞）細胞懸液并轉移至已添加100 μL 對應培養基的96 孔板中（圖2a）。繼續培養48 h 后，分別給每孔加入10 μL CCK-8 試劑，繼續培養孵育1～3 h 后，采用酶聯免疫檢測儀（Thermo公司，美國）記錄每孔在450 nm 處的吸光度值，計算細胞的存活情況。細胞存活率=（實驗組的吸光度值-空白吸光度值）/（對照組的吸光度值-空白吸光度值）×100%。

圖2 采用275 nm UVC-LED光照射細胞培養板的操作示意圖（a）和采用275 nm UVC-LED光照射小鼠背部皮膚的操作示意圖（b）

1.3.2 正常細胞增殖速度

采用iCELLigence 多功能實時無標記細胞分析儀（ACEA 公司，美國）對275 nm UVC-LED 光照射對細胞增殖速度的影響進行監測，照射細胞后，吸取10 μL（包含1.5×104個細胞）細胞懸液，轉移至已添加290 μL對應培養基的E-plate L8 孔板中。每個照射時間設置3 個復孔。之后，將E-plate L8 孔板放入iCELLigence系統上，確定接觸完好后，以細胞增殖模式開始運行程序。共監測48 h，數據采集程序設定為1 min：1 min/次；8 h：1 min/次；40 h：15 min/次。取3 個復孔的平均值繪制細胞增殖曲線。

1.4 275 nm UVC-LED光照射對小鼠皮膚的影響

1.4.1 單次大劑量照射

將5 只BALB/c Nude 雄鼠（6～7 周）采用4%水合氯醛進行麻醉。用黑色耐酒精記號筆在其背部脊柱兩側分別標記出4 個1 cm×1 cm 的正方形標記。用275 nm UVC-LED 光源單次照射標記區域60 s（功率密度約為5.00 mW/cm2，能量密度約為300 mJ/cm2，能量密度=功率密度×照射時間），見圖2b。分別在照射后0、1、5、12、24 和48 h 采集正方形內的皮膚樣本（n=3），浸泡在4%多聚甲醛溶液中，過夜后進行組織學分析。

1.4.2 多次不同劑量照射

將10 只BALB/c Nude 雄鼠（6～7 周）采用4%水合氯醛進行麻醉。用黑色耐酒精記號筆在其背部脊柱兩側分別標記出4 個1 cm×1 cm 的正方形標記。275 nm UVCLED 光源分別照射標記區域0、10、20 和60 s[功率密度約為5 mW/cm2，能量密度分別為0 mJ/cm2（0 s）、50 mJ/cm2（10 s）、100 mJ/cm2（20 s）和300 mJ/cm2（60 s）]。每天照射1 次，連續照射7 d。照射后立即觀察被照射皮膚的大體外觀，并對小鼠背部進行照片采集。此外，分別在照射后的第7 天對被照射區域的背部皮膚進行取樣。皮膚樣品置于4%多聚甲醛溶液中。

1.4.3 組織學分析

本實驗中的組織學分析主要委托武漢賽維爾生物科技有限公司進行操作。將收集到的皮膚組織在4%多聚甲醛溶液中浸泡固定24 h 以上，用手術刀將目標部位修復平整，放入脫水盒中進行梯度酒精脫水后，將組織浸入融化的石蠟中。將浸好蠟的組織放入石蠟包埋劑中進行包埋。然后，采用石蠟切片機（上海徠卡儀器有限公司）制備4 μm 厚的石蠟組織切片，進行脫蠟和補液操作后，對切片進行蘇木精-伊紅染色；同時，組織切片在經過脫蠟和補液操作后，將切片浸入檸檬酸抗原修復緩沖液中孵育，進行抗原修復。然后，用3%過氧化氫溶液阻斷內源性過氧化物酶活性。經PBS 清洗后再用3%牛血清白蛋白進行血清封閉。為了檢測環丁烷嘧啶二聚體（Cyclobutane Pyrimidine Dimer，CPD）抗體（Kamiya Biomedical Company，美國）的形成和代謝情況，將組織切片與抗CPD 抗體在4℃下孵育過夜。然后，將切片放入PBS 中洗滌3 次，將切片與辣根過氧化物酶標記的二抗進行共孵育。在PBS 中洗滌3 次后即可加入二氨基聯苯胺進行顯色反應，最后進行蘇木精染色即可。切片影像采用徠卡切片掃描顯微成像系統獲得。通過在200 倍放大倍數下，隨機取5 個視野統計CPD 陽性細胞個數。

2 結果

2.1 275 nm UVC-LED光照射對正常細胞生存的影響

選用HaCaT 和HUVECs 兩種細胞，研究275 nm UVC-LED 光照射對細胞生存的影響。結果如圖3所示，輕微照射即可損傷一定量的HaCaT，但是照射3、5 和8 s 時對HaCaT 存活率的影響差別不大，照射8 s 時依然有超過75%的細胞存活，但照射20 s 時細胞的存活率只有10%左右。而對于HUVECs，其對275 nm UVC光的反應更加靈敏，照射3 s 和5 s 時依然有超過80%的細胞存活，但是照射8 s 時細胞存活率下降至40%，照射20 s 時只有5%左右的細胞存活。說明在低劑量直接照射時，275 nm UVC 光具有一定的皮膚相關細胞安全性。但是高劑量的275 nm UVC 光照射會對細胞產生較大傷害。

圖3 采用275 nm UVC-LED光直接照射HaCaT和HUVECs不同時間后，繼續培養48 h后細胞的存活情況

2.2 275 nm UVC-LED光照射對正常細胞增殖速度的影響

對275 nm UVC 光照射后對細胞增殖速度的影響研究結果如圖4所示，275 nm UVC 光照射確實在一定程度上減緩了細胞的增殖速度，且隨著光照劑量的增加，細胞增殖速度明顯降低。相比于HaCaT，HUVECs 對275 nm UVC 光的響應更加靈敏，與細胞存活實驗的結果一致。

圖4 采用275 nm UVC-LED光照射HaCaT（a）和HUVECs（b）不同時間后對細胞增殖速度的影響

2.3 單次大劑量照射275 nm UVC-LED光對小鼠皮膚DNA的影響

采用大劑量275 nm UVC-LED 單次照射小鼠皮膚，通過追蹤小鼠皮膚中CPD 的代謝情況來研究其是否會誘導小鼠皮膚的DNA 損傷。結果如圖5所示，在275 nm UVC-LED 光單次照射60 s 后，即可在小鼠表皮中檢測到CPD 表達的細胞，并發現其主要分布在棘層。但是，CPD 在小鼠皮膚中的代謝也極為迅速。在照射1 h 時，CPD 陽性的細胞個數已減少大約20%；在照射5 h 時，CPD 陽性的細胞個數已減少大約55%；在照射12 h 時，依然可在棘層上部檢測到CPD 表達細胞，但其已減少至約30%；而在照射24 h 時，僅在表皮表面檢測到少量的CPD 表達細胞；在照射48 h 時，超過97%的細胞中的CPD 被完全代謝。說明用275 nm UVC-LED 燈大劑量照射后，小鼠可快速修復所產生的CPD，CPD 不會在皮膚中進行累積。

圖5 采用275 nm UVC-LED光單次大劑量照射小鼠皮膚后小鼠皮膚組織中CPD的表達量

2.4 多次不同劑量照射275 nm UVC-LED光對小鼠表皮損傷的影響

低光照劑量或者高光照劑量的275 nm UVC-LED 光多次照射小鼠表皮，研究其對小鼠表皮的影響。結果如圖6所示，與未照射的小鼠相比，低光照劑量和高光照劑量下多次照射275 nm UVC-LED 光的小鼠皮膚完好無損，沒有觀察到任何曬傷、蛻皮、皮疹、水腫或者紅腫等現象。

圖6 采用275 nm UVC-LED光連續照射7 d小鼠背部皮膚不同時間（0、10、20和60 s）小鼠背部皮膚的變化情況

采集照射7 d 后小鼠照射區域的皮膚組織進行組織學分析，結果證實了275 nm UVC-LED 光在實驗劑量下的安全性。在照射7 d 后的小鼠皮膚組織切片中未觀察到組織損傷、壞死或者炎癥反應等，總體與正常皮膚組織幾乎沒有任何區別，見圖7。

圖7 采用275 nm UVC-LED光連續照射7 d小鼠背部皮膚后小鼠背部皮膚組織的組織學結果

3 討論

Freeman 等[20]在20世紀60年代發現相比于250 nm的UVC 光，波長在200～230 nm 的UVC 光誘導人體皮膚紅斑的可能性大幅減少，這主要是不同波長UVC 光的穿透性決定的。研究表明200～230 nm 的UVC 光并不能穿透角質層到達真皮組織層[21]。同時，由于受到眼睛角膜層的保護作用，該波段也不能穿透角膜層到達視網膜，因此，其對眼睛的損傷也是相對較小的。但其依然可以穿透厚度遠小于人體皮膚細胞的細菌以及病毒等微生物的膜結構，進而將其殺死[12,22]，提示該波段可以兼具殺菌作用的同時，減弱對人體皮膚和眼睛的傷害作用，是最有潛力應用于臨床的。目前影響該技術臨床推廣的一個重要因素就是高質量的200～222 nm 光源昂貴的價格，且光源制造技術難度較大。

目前臨床上應用最廣泛的UVC 光中心波長為254 nm，一方面主要利用其大功率下的殺菌作用用于室內環境消毒；另一方面，雖然254 nm UVC 光照射下會誘導皮膚病變以及角膜損傷，但按規定的低劑量照射在殺滅患處的病原物的同時，還有促進組織生長、加速傷口恢復的功能[23-24]。將其直接用于癌癥導致的口腔潰瘍[25]、皰疹[26]、糖尿病足[27]、皮膚損傷及感染[28]、斑禿[29]以及術后傷口的恢復治療[30]方面已取得一定成果。市場上短波紫外線治療儀已不少見（如北京君德醫療設備有限公司[26,30]、廊坊市豪邁醫療器械有限公司以及廊坊市天月醫療器械有限公司等公司研發的紫外線治療儀等）。此外，254 nm UVC 光的另外一個重要醫用場景是血液制品的病原菌殺滅技術。目前已有文獻報道基于254 nm UVC 光的THERAFLEX 系統用于血液中的病原菌滅活[31-33]。波長254 nm 的UVC 光在照射生物體表面特別是人體皮膚時會產生大量的CPD，阻礙DNA 的復制與轉錄進而造成細胞死亡，并可能引起細胞變異，進而誘發皮膚癌[34-37]。因此其應用依然存在很多限制。波長270～280 nm 的UVC 光與蛋白質的最大紫外吸收峰一致，偏離核酸的最大紫外吸收峰。因此，其主要是通過破壞微生物的蛋白質結構和功能來達到滅菌作用[18]。可見，270～280 nm UVC 光對核酸的損傷較小，且殺菌效果相對較好[19]。目前275 nm 的UVC 光主要是應用于各種手持式、壁掛式的殺菌裝置，且價格容易接受。但是，幾乎沒有活體應用的相關報道，因此，UVC 光有一定的人體應用潛力，故對其進行安全性的研究非常有意義。

結合不同波長UVC 光的特性，本研究證明了275 nm UVC 光具有一定的細胞安全性和皮膚安全性。低劑量照射時對皮膚和血管相關細胞的存活增殖速度不會產生顯著影響，且對活體使用275 nm UVC-LED光照射60 s 后，小鼠皮膚既沒有發生細胞DNA 損傷，也沒有表皮損傷。同時，光照射治療的操作方法簡單方便，不會產生噪音和氣味污染，易于被患者接受。因此，275 nm UVCLED 光在臨床治療皮膚感染方面前景廣闊。此外，雖然按照本實驗中的照射條件，275 nm UVC-LED 光照射不會對皮膚造成損傷，但是其他照射劑量的275 nm UVCLED 光直接長期或者短期照射對皮膚的影響仍然未知。因此，在275 nm UVC-LED 光投入臨床應用前仍有許多問題和挑戰。

綜上所述，275 nm UVC-LED 在一定照射劑量下既不會誘導小鼠皮膚DNA 損傷也不會引起表皮損傷，具有一定的皮膚安全性，具有臨床應用前景。