放療對卵巢癌順鉑耐藥細胞的影響

姜清芳

(開封市腫瘤醫院放療科,河南 開封 475000)

卵巢癌是常見的女性生殖系統惡性腫瘤,發病率、病死率分別居女性惡性腫瘤的第五位、第一位,且>80%的患者在確診時已發生遠處轉移(如腹部轉移),預后不良[1]。目前腫瘤細胞減滅術聯合鉑類藥物為主的化療仍是治療卵巢癌的主要方式,可在一定程度上改善患者預后,但5年生存率僅為30%～40%[2]。順鉑(cisplatin,CDDP)是臨床一線抗腫瘤化療藥,其耐藥所致的腫瘤原發部位或腹腔轉移部位復發是化療失敗及患者死亡的主要原因。由此可見,探究逆轉卵巢癌CDDP耐藥的有效方式至關重要。放療是19世紀以來廣泛應用于醫學領域的治療方式,同步放化療可盡可能徹底殺滅包括遠處轉移的癌細胞,保留器官功能,推測與其化療增敏效應有關。再次或多次化療可能導致多藥耐藥進而降低腫瘤化療敏感性已是共識,但目前關于放療是否會影響化療耐受的報道并不多[3-4]。本研究通過選取卵巢癌SKOV3細胞株及SKOV3/CDDP耐藥細胞株,探究放療對其耐藥性的影響,并探討相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 SKOV3、SKOV3/CDDP細胞株購自廣州天元生物科技有限公司,培養于RPMI 1640培養基(pH值 7.2～7.4,含有10%新生牛血清,鏈霉素100 U·mL-1,青霉素100 U·mL-1),標準條件(飽和濕度,37 ℃,5% CO2)培養箱。培養SKOV3/CDDP細胞株時加入濃度1 mg·L-1的CDDP用于維持其CDDP耐藥性,隔日換液,倒置顯微鏡下觀察,細胞貼壁生長,形態良好。SKOV3/CDDP細胞株在用于實驗前停用含有CDDP的培養基>2周。

1.1.2 藥物、主要試劑和儀器 CDDP(貴州漢方制藥有限公司,國藥準字H20020273,規格:50 mL:CDDP 50 mg與氯化鈉450 mg);二甲基噻唑(dimethylthiazole,MTT)溶液、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶液(北京中生瑞泰科技有限公司);FITC-Anexin V染液、碘化丙啶(propidium iodide,PI)染液(上海聯邁生物工程有限公司);β-鏈蛋白(β-catenin)、p-β-catenin、骨髓細胞瘤病毒癌基因(cellular-myelocytomatosis viral oncogene,c-myc)、細胞周期蛋白-D1(cyclin-D1)單克隆抗體(美國Abcam公司);辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗(北京中山金橋生物技術有限公司)。SpectraMax M5/M5e酶標儀(美國Molecular Devices公司);FACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司);Fluor Chem FC2凝膠成像系統(美國Life Technologies公司)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測SKOV3、SKOV3/CDDP對CDDP敏感性 取對數期SKOV3、SKOV3/CDDP細胞,0.25%胰蛋白酶消化,稀釋為密度8×104mL-1單細胞懸液,接種至96孔板(每孔100 μL),標準條件(37 ℃,5% CO2飽和濕度)培養24 h,將孔中培養液吸出,加入RPMI 1640培養液稀釋CDDP為1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、32.0、64.00 mg·L-1,每孔100 μL,并設置僅含有RPMI 1640培養液的空白對照組,及僅含有細胞及RPMI 1640培養液的陰性對照組。同條件繼續培養48 h,加入新鮮制備MTT溶液(每孔20 μL,5.00 g·L-1),4 h后棄上清,加入DMSO溶液(每孔150 μL),充分振蕩10 min至甲瓚顆粒充分溶解,酶標儀檢測各組吸光度值(A492 nm),計算增殖抑制率(%)=(1—實驗組A492 nm/空白對照組A492 nm)×100%,繪制抑制率曲線,獲取CDDP對SKOV3、SKOV3/CDDP細胞的半數抑制劑量(half inhibitory concentration,IC50),并計算耐藥指數(resistance index,RI)=SKOV3/CDDP細胞的IC50/SKOV3細胞的IC50。

1.2.2 MTT法檢測放療對SKOV3/CDDP的殺傷作用 取對數期SKOV3/CDDP細胞,采用CDDP處理,濃度及方式同1.2.1。將細胞帶至放療室,采用不同照射模式,低劑量分割:0.5 Gy×4次放療,分別在連續兩日的10:00、16:00進行放療,低劑量與常規劑量在低劑量組分割最后一次放療時分別以0.5 Gy、2 Gy劑量進行放療。繼續培養48 h后,加入新鮮制備MTT溶液(每孔20 μL,5.00 g·L-1),4 h后棄上清,加入DMSO溶液(每孔150 μL),充分振蕩10 min至甲瓚顆粒充分溶解,酶標儀檢測各組吸光度值(A492 nm),計算增殖抑制率,獲取耐藥逆轉倍數(reversal fold,RF)=IC50(CDDP)/IC50(放療+CDDP)。

1.2.3 平板克隆實驗 取對數期SKOV3/CDDP細胞,細胞鋪滿80%左右時經0.25%胰蛋白酶消化,加入培養基終止,輕吹細胞至成細胞懸液,調整濃度至50個·mL-1。接種至12孔板,加入細胞懸液(每孔2 mL),每組設置5個復孔。于標準條件(37 ℃,5% CO2飽和濕度)繼續培養,每3 d更換新鮮培養基,第10天計數各孔中細胞集落數,集落形成標準:細胞數≥50個/克隆。細胞集落形成率=細胞集落數/初始細胞接種數×100%。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率 取對數期SKOV3/CDDP細胞,采用CDDP濃度為8.00 mg·L-1的RPMI 1640培養液培養48 h,同時在該時間段每天的10:00、16:00進行0.5 Gy×4次放療,設為低劑量分割放療組,取僅CDDP處理的SKOV3/CDDP細胞設為空白組。收集2組干預至48 h的細胞,PBS洗滌3 min×2次,重懸,2 800 r·min-1離心15 min,加入FITC-Anexin V、PI染液各5 μL,搖勻后避光孵育30 min,binding buffer標記液洗滌3 min×2次,1 h內經流式細胞儀檢測凋亡率,CellQuest軟件分析。

1.2.5 PI染色檢測細胞周期 取空白組、低劑量分割放療組細胞,細胞鋪滿80%左右時經0.25%胰蛋白酶消化,加入培養基終止,輕吹細胞至松散,轉移至離心管中,4 ℃,2 800 r·min-1離心15 min,棄上清;加入5 mL 70%預冷乙醇,混合均勻,4 ℃固定過夜,2 500 r·min-1離心5 min,5 mL預冷PBS沖洗、重懸細胞;加入PI染液(RNaseA 10 μL,染色緩沖液0.5 mL,PI染液25 μL),遮光冰浴25 min;采用300細胞濾網過濾,流式細胞儀檢測488 nm波長位置紅光通道熒光信號,經配套軟件行周期擬合分析。

1.2.6 Western blot檢測cyclin-D1、c-myc、p-β-catenin、β-catenin蛋白表達 取空白組、低劑量分割放療組細胞,PBS洗滌3 min×2次,RIPA細胞裂解液冰上裂解30 min,BCA蛋白試劑盒定量蛋白,根據定量結果校正蛋白樣本。將蛋白與上樣緩沖液按照比例混合,100 ℃水浴5 min使蛋白變性;每孔上樣40 μg待測樣本,恒定電壓下行SDS-PAGE凝膠電泳分離,濕法轉膜,加入封閉液常溫封閉2 h,加入兔抗人cyclin-D1、c-myc、p-β-catenin、β-catenin(工作濃度1∶1 000)單克隆抗體,4 ℃孵育過夜,TBTS漂洗3 min×2次,加入山羊抗兔IgG二抗(1∶8 000),常溫孵育2 h,TBTS漂洗。暗室加入ECL顯影劑顯影,Fluor Chem FC2凝膠成像系統掃描、分析,以目的基因灰度值/內參GAPDH灰度值表示蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 不同濃度CDDP對SKOV3、SKOV3/CDDP細胞的增殖抑制作用 CDDP對SKOV3、SKOV3/CDDP細胞的IC50分別為2.41、6.15 mg·L-1,SKOV3/CDDP對DDP的RI為2.55倍,與購買耐藥細胞株時的說明書基本符合。見表1、圖1。

圖1 CDDP對SKOV3、SKOV3/CDDP細胞的增殖抑制率

表1 不同濃度CDDP對SKOV3、SKOV3/CDDP細胞的增殖抑制率比較

2.2 不同放療方式對SKOV3/CDDP細胞的增殖抑制作用 不放療、0.5 Gy、0.5 Gy×4次、2 Gy時,CDDP對SKOV3/CDDP細胞的IC50分別為6.15、5.17、3.92、4.31 mg·L-1,0.5 Gy、0.5 Gy×4次、2 Gy時RF分別為1.19、1.57、1.43,表明0.5 Gy×4次放療對SKOV3/CDDP細胞化療增敏效果最好。因此,將順鉑濃度8.00 mg·L-1、0.5 Gy×4次放療作為后續實驗條件。見表2、圖2。

圖2 不同放療方式對SKOV3/CDDP細胞的增殖抑制率

表2 不同放療方式對SKOV3/CDDP細胞的增殖抑制率比較

2.3 克隆形成率比較 空白組、低劑量分割放療組克隆形成率分別為(40.26±5.73)%、(22.94±3.30)%,低劑量分割放療組克隆形成率低于空白組(P<0.05)。見圖3。

圖3 平板克隆實驗結果

2.4 凋亡率比較 空白組、低劑量分割放療組凋亡率分別為(17.02±2.58)%、(36.94±4.01)%,低劑量分割放療組凋亡率高于空白組,差異有統計學意義(P<0.05)。圖4。

2.5 細胞周期比較 低劑量分割放療組G0/G1占比高于空白組,S、G2/M占比低于空白組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3、圖5。

圖5 細胞周期分布流式圖

表3 2組細胞周期分布比較

2.6 cyclin-D1、c-myc蛋白表達,p-β-catenin/β-catenin比較 低劑量分割放療組cyclin-D1、c-myc蛋白相對表達量,p-β-catenin/β-catenin低于空白組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表4、圖6-7。

圖6 空白組p-β-catenin、β-catenin、cyclin-D1、c-myc蛋白表達Western Blot圖

圖7 低劑量分割放療組p-β-catenin、β-catenin、cyclin-D1、c-myc蛋白表達Western Blot圖

表4 2組cyclin-D1、c-myc蛋白表達,p-β-catenin/β-catenin比較

3 討論

卵巢癌細胞的耐藥性多發生于用藥過程中,在化療初期,腫瘤細胞較正常細胞對化療藥物更為敏感,但隨著藥物的長期應用,腫瘤細胞較正常細胞對所用抗癌藥物及其他結構甚至作用機制不同的化療藥物敏感性更低,即產生耐藥性[5-6]。卵巢癌CDDP耐藥是多因素、多基因綜合作用所致,目前關于其發生機制尚待完全明確,通常認為與細胞中CDDP有效濃度降低、CDDP介導DNA損傷時致命信號通路改變、DNA損傷修復能力增強、凋亡相關基因異常表達等有關[7-8]。CDDP耐藥性可顯著影響卵巢癌患者生存率,故探尋合適的化療增敏方式,抵抗化療耐藥是改善耐藥卵巢癌預后的關鍵。

放化療聯合的序貫治療,有利于降低局部腫瘤負荷,且對卵巢癌切除術后殘留微小病灶的患者效果更佳[9]。盡管卵巢癌病灶對放射線具有中度敏感性,但病灶周圍組織對放療的耐受性較低,易導致泌尿系統、消化系統等并發癥。然而,有學者發現[10],與常規劑量放療不同,低劑量輻射可誘導糖酵解,促進正常細胞與組織對后續高劑量放療產生適應性保護,增強放療抗性,提示低劑量放療在腫瘤治療中更具優勢。AL-RAJHI等[11]報道指出,在多西紫杉醇和CDDP誘導化療聯合同步放化療的同時加用低劑量分割放療在局部區域控制率及無遠處轉移生存率上可獲取更高收益。而關于放療對化療增敏性方面,有研究[12]認為,低劑量全腹放療聯合每周紫杉醇治療鉑類耐藥卵巢癌具有協同活性,并觀察到令人鼓舞的療效。由此可推測,低劑量分割放療可能具有化療增敏作用,用于化療耐藥腫瘤的治療。本研究結果顯示,采用低劑量分割放療處理SKOV3/CDDP耐藥細胞株,可抑制其增殖,促進其凋亡,將細胞阻滯于G0/G1期,使其不能進入S期而死亡,提示低劑量分割放療可增強卵巢癌CDDP耐藥細胞化療敏感性。

Wnt/β-catenin信號通路是常見的腫瘤干細胞通路,其作為交叉環節介導多種信號通路轉導,參與細胞分化、增殖及腫瘤發生。有研究[13]顯示,激活Wnt/β-catenin信號通路可增強胰腺癌細胞的多藥耐藥性,且降低該通路活性可抑制胰腺癌細胞增殖及上皮間質轉化介導的轉移,以該通路相關分子作為化療增敏的新靶點備受腫瘤及藥物研究者的關注。β-catenin、cyclin-D1、c-myc是Wnt/β-catenin信號通路重要成員,其中β-catenin作為一種黏附分子通過結合鈣依賴性跨膜糖蛋白胞內段等來介導細胞間黏附,并維持其形態,隨著其表達增加,多耐藥基因水平相應上調,從而增強細胞耐藥性。有證據表明[14-15],β-catenin在細胞中大量累積是Wnt/β-catenin信號通路活化的關鍵,β-catenin自胞漿轉至細胞核結合對應基因并激活cyclin-D1、c-myc等下游基因,抑制Wnt/β-catenin信號通路主要通過調節β-catenin表達及其磷酸化作用實現。c-myc、cyclin-D1同時具備刺激細胞增殖、誘導細胞凋亡的作用,通過調節細胞周期發揮生物學效應,當其異常高表達時將加快細胞分裂至S期的速度,同時抑制細胞程序性凋亡,降低細胞化療敏感性。ZHU等[16]在研究柚皮苷對卵巢癌SKOV3/CDDP細胞CDDP耐藥性逆轉的作用時發現,細胞中p-β-catenin、c-Myc和cyclin D1蛋白水平顯著降低,推測該通路可能與卵巢癌耐藥性的獲得相關。本研究結果顯示,采用低劑量分割放療處理SKOV3/CDDP耐藥細胞株后cyclin-D1、c-myc蛋白相對表達量及β-catenin磷酸化水平明顯降低,提示低劑量分割放療對卵巢癌耐藥細胞株的化療增敏作用可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路相關基因表達來實現。

綜上所述,低劑量分割放療可抑制卵巢癌順鉑耐藥細胞增殖,促進其凋亡,具有化療增敏作用,推測其作用機制與抑制Wnt/β-catenin信號通路有關。然而,本研究尚存在一些不足,即對低劑量分割放療影響化療敏感性的機制尚在猜測階段,在客觀條件的限制下未使用Wnt/β-catenin信號通路激活劑進行反向實驗,可作為今后研究方向。