中藥苦味成分的發現策略與方法研究進展

劉 惠，宋 嬌，林俊芝，蘇 娟，柯秀梅，仇 敏，楊 明，張定堃*

1.成都中醫藥大學藥學院，西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137

2.成都中醫藥大學附屬醫院，代謝性疾病中醫藥調控四川省重點實驗室，四川 成都 610072

3.重慶醫科大學藥學院，重慶 400016

4.江西中醫藥大學，現代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌 330004

中藥苦味成分來源廣泛，結構多樣，呈味特征復雜。如何精準發現與辨識中藥苦味成分，是推動中藥抑苦掩味技術精準化發展的重要前提。經過多年的現代研究，部分臨床常用苦味中藥的主要呈味物質已相對清晰，基本擺脫了“黑箱”狀態。如黃連的主要苦味成分是小檗堿、表小檗堿、藥根堿等生物堿類[1]；穿心蓮的主要苦味成分是穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯等萜類[2]；雞內金的主要苦味成分是L型苦味氨基酸等[3]。然而，由于中藥苦味成分的靶向分離面臨技術瓶頸，導致很多中藥的苦味成分仍有待闡明，整體研究尚處于“灰箱”狀態。具體表現在以下2 個方面。（1）挖掘苦味成分的導向性不夠：中藥苦味成分種類多，包括生物堿、黃酮、萜類、氨基酸、無機鹽及雜醇等大類成分，部分藥物可能同時含有多類苦味成分，導致傳統苦味成分分離方法缺乏導向性。同時，各類苦味成分的理化性質并不完全相同，分離過程容易出現苦味部位分散的情形，增加苦味成分示蹤難度。（2）苦味驗證的還原性不足：中藥的苦味呈現往往是多種同系物、同分異構體等化合物的苦味疊加，成分濃度、成分種類對口感影響大。此外，藥物中的酸味成分會增強苦味的感知、咸味成分會抑制苦味的感知[4]，這些影響因素使得苦味成分在單一狀態下與在中藥復雜體系下的呈味特征存在差異。

基于此，本文通過對中藥苦味成分的發現方法進行總結，并進一步提出辨識中藥苦味成分的新方法、研究苦味成分的新思路，推動中藥苦味成分解析方法的傳承創新，為深入理解中藥苦味成分的結構特征與呈味規律，科學制訂抑苦掩味技術方案提供支撐。

1 基于本草學知識發現苦味成分

1.1 基于中藥性能特征發現苦味成分

中藥傳統藥性理論中的“五味”理論，記載了藥物的酸、苦、甘、辛、咸5 種藥味。其中，苦味的性能特點為能泄、能燥，功效表現為清熱瀉火、通泄大便、燥濕堅陰等，多集中于清熱藥、瀉下藥等。但長久以來，傳統本草文獻中對于藥物性能藥味的記載與真實滋味的記載混雜，部分藥物作為性能的五味與真實滋味相同，如黃連、苦參等。也有部分藥物作為性能的五味與真實滋味并不完全一致，如雞內金藥性為甘味，突出其健胃消食功效，但其真實滋味又為微苦味。文獻記載的藥性“五味”與口嘗滋味的混雜，為藥性理論研究帶來了困惑，但也為藥物真實滋味的研究提供了線索。對于一些臨床使用頻率較低、藥味研究較薄弱的中藥或民族藥，可通過文獻藥性記載或功效特點初步判斷其真實滋味，繼而尋找苦味成分。胡亞楠[5]建立了苦味性、效生物網絡，從現代科學的角度闡釋真實苦味和性能苦味相關靶點的一致性，探究苦味中藥與清熱解毒生物靶點間的關聯程度，提示可遵循該線索發現中藥的苦味成分。

1.2 基于苦味植物來源發現苦味成分

藥用植物親緣學在尋找替代藥源、開發植物新類群中具有重要的指導作用[6]，為挖掘苦味新成分和開發中藥苦味新應用拓展了思路。研究苦味中藥的植物來源，主要分布于菊科、蕓香科、百合科、豆科、唇形科、傘形科、五加科（圖1）等，苦味成分廣泛分布的類群可能蘊含更多的潛在苦味成分。在植物分類學中，親緣相同或相近的物種表現出相似的外觀性狀，可能蘊含相似的生物學信息，遺傳規律下可能具有相同或相近的次生代謝產物合成途徑，因此含有某些相同成分的幾率更大。以人參為例，苦味主要來源于人參皂苷類成分，其同科同屬近種的西洋參與三七也具有類似的苦味、含有相同的人參皂苷類成分。此外，三七中人參皂苷含量顯著高于人參、西洋參，因此，三七的苦味更為強烈。挖掘苦味成分時，從中藥植物親緣性出發，可為判別苦味來源縮小篩選范圍、減少研究的盲目性，即優先選擇與已知苦味中藥親緣相近的物種作為苦味研究的對象。

圖1 按主要苦味成分劃分的中藥分布Fig.1 Distribution of traditional Chinese medicine by main bitter components

2 苦味成分的分離與分析方法

2.1 苦味部位的逐步分離與精制

采用分離技術將苦味成分從中藥中逐步分離、濃集，是研究苦味成分的關鍵。系統分離法結合大孔吸附樹脂分離是獲得苦味成分集中部位的常用方法。根據苦味成分的化學結構特征，大多數苦味成分都有一定疏水性或疏水結構[7]，主要存在于中低極性溶劑部位。根據“相似相溶”原理，系統溶劑分離法[8]可獲得相應溶劑的提取部位。相較于離子交換色譜多應用于分離具有離子官能團的成分，凝膠濾過色譜主要用于分離存在相對分子質量差異的成分，大孔樹脂吸附分離法應用范圍更廣泛，更適用于各種天然產物的分離純化[9]，通過對初分離得到的苦味成分群進行吸附和洗脫，可實現苦味成分的進一步精制、富集。由于不同樹脂型號對不同化合物吸附能力不同，根據潛在苦味成分的結構特征選擇合適的樹脂型號，可達到更好的分離效果。

2.2 現代分析方法鑒定苦味成分

結合感官導向的現代分析技術是研究中藥苦味成分的重要手段，有助于提高發現苦味成分的效率。Pickrahn 等[10]通過二維液相色譜結合滋味稀釋分析方法，從茴香提取物的256 種組分中識別到苦味閾值最低的成分2-甲基丁酸反式假異戊烯醇，現代分析方法與感官導向方法有助于從復雜滋味成分中快速篩選關鍵苦味成分。超高效液相色譜聯合飛行時間串聯質譜是現代應用最廣的分析技術之一[11]，能實現中藥組分的識別與鑒定。Yu 等[12]在感官引導下借助高效液相色譜串聯質譜鑒定出杭白芷中的水合氧化前胡素、佛手柑內酯、花椒毒酚、歐前胡素、異茴芹內酯和氧化前胡素6 種苦味成分。Ke 等[13]通過溶劑萃取、色譜分離、感官分析、超高效液相色譜飛行時間質譜鑒定等多種分析方法的聯用，從花椒中分離出了7-甲氧基香豆素和8-異戊烯基山柰酚2 種苦味成分。

2.3 主客觀方法聯用評價苦味特征

藥物口感評價包括感官評價等主觀分析方法和動物偏好實驗、電子舌評價、電生理實驗等客觀分析方法[14]，其中，感官評價和電子舌應用較多。感官評價是經典的苦味評價方法，運用范圍最廣、時間最久、最能反映真實味覺，志愿者可準確描述藥物的苦味特征及其他感官特征。但由于志愿者個體差異大，評價結果受志愿者生理、心理及環境因素的影響[15]，評價結果差異較大；此外，對于部分存在毒性、刺激性樣品難以適用。電子舌是味覺評價的重要方法，采用膜電位傳感器模擬人體的味覺感受器，將苦味化合物濃度信號轉換為電勢信號予以量化表征，具有檢測靈敏、樣品消耗量少等優點。Zhang 等[16]采用電子舌評價輔助發現穿心蓮的4 種關鍵苦味成分——穿心蓮內酯、新穿心蓮內酯、14-去氧穿心蓮內酯與脫水穿心蓮內酯。但電子舌傳感電極工作原理始終不同于人體真實的味覺細胞，評價結果與真實的味覺感受存在一定差異[17]。感官評價與電子舌評價各有所長，滋味研究中通常將2 種方法聯用以彌補不足，相互佐證實驗結果，增加實驗結果的可靠性。張璞等[18]以不同苦味中藥水煎液為研究對象，將感官評價與電子舌評價相結合，探究了不同種類苦味成分的苦度疊加規律。

2.4 成分敲入法還原驗證苦味

對于分離出的單一苦味成分，其苦味特征可能與中藥材或水煎液的整體苦味特征有明顯差異。因此，潛在苦味成分既需要單一口感驗證，也需要置于整體背景下進行驗證。成分敲入法是指將潛在苦味成分按照不同濃度梯度分別加入到藥液樣品中，通過比較敲入前后不同組別樣品的口感差異，評價潛在苦味成分對于整體口感的貢獻度，探究其“含量-苦味強度”關系[19-20]。成分敲入法[21]符合中藥復雜體系組成特征，能在整體背景下還原驗證潛在成分苦味，是一種較好的驗證方法。丁涌波等[22]在挖掘花椒精油苦味來源的研究中，通過減壓蒸餾份離出各餾份，在感官導向下定位苦味餾份，利用氣相色譜-質譜法鑒定出了花椒中芳樟醇、崖伯酮、香芹酮、隱品酮4 種主要的苦味成分，最后采用對照品加入法結合苦味閾值相關性分析驗證其苦味。苦味成分分離、分析、評價、驗證過程見圖2。

圖2 苦味成分分離、分析、評價、驗證過程Fig.2 Process of separating, analyzing, evaluating, and verifying of bitter components

3 基于結構相似性的苦味成分發現策略

結構相似性是發現新成分或現有成分新活性的重要識別手段，通過對“模板”成分進行結構對比，推測具有一定結構相似性的未知成分可能具有“模板”成分的相同或相似性質，結構上的差異性又導致該成分表現出不同于“模版”成分的性質。以黃連為例，其化學成分小檗堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、藥根堿的合成前體物都是苯丙氨酸，類別上均屬于異喹啉類生物堿，結構中都含有異喹啉環、氮堿基，使其均具有相似的苦味[23]。但由于這幾種生物堿在供氫體數量、可旋轉鍵數量、相對分子質量、疏水性等結構參數上存在差異，苦味強度總體呈現出黃連堿＞表小檗堿＞小檗堿＞巴馬汀＞藥根堿[24]。

大量研究表明，苦味成分的苦味強度受到相關連接基團的影響。咖啡堿、柚皮苷、膽汁因含重氮基團而呈現苦味，生物堿的苦味強度受氮元素雜化狀態影響[25]；無機鹽因含鋰、鈣、銣、銫等堿金屬離子可與某些成分絡合從而產生苦味[26]；蛋白質、多肽、氨基酸因暴露的疏水性基團而呈現苦味[27]；酚類成分的苦味與相對分子質量有關[28]。此外，糖苷類、萜類成分的苦味與化學鍵有關，含硫苷鍵、氮苷鍵、氰苷鍵的苷類成分大多具有苦味，萜類成分因其內酯、內縮醛、內氫鍵、糖苷羥基等可形成螯合物而呈現苦味[29]。綜上，各類成分的苦味主要與官能團、相對分子質量及化學鍵有關（表1）。BitterPredict 是一個基于機器學習算法的苦味分類器，主要以BitterDB 數據庫為苦味分子數據集，以現有文獻中檢索到的非苦味分子為非苦味分子數據集，在機器算法下通過化合物的化學結構預測其是否味苦，在一些外部測試集和感官驗證中正確分類了70%～90%的化合物[32]。此外，BitterPredict 在苦味分類過程中突出了總電荷、表面相關性質和毒性等分子性質作為區分苦味與非苦味的重要依據，為深入理解苦味分子的結構特征和呈味規律提供參考。基于結構相似性或苦味基團發現苦味成分的重要前提是化學結構已知，故此法多應用于結構已知成分的苦味判斷。

表1 苦味種類及其代表性苦味成分、呈苦原因Table 1 Bitter types and their representative bitter components, cause of bitter

4 基于苦味受體的苦味成分發現策略

苦味受體對苦味成分的識別作用是判斷化合物苦味的重要依據。苦味分子激活苦味受體，引起苦味細胞膜去極化、釋放神經遞質，信號傳導至大腦皮層形成苦味的認知。苦味感知實際是苦味物質與苦味受體在結合位點的結構互補、能量互補。三點接觸理論是目前公認度最高的苦味成分結構理論，認為苦味化合物分子與苦味受體均應具有AH（親電性基團）、B（親核性基團）及X（疏水基團），其中，化合物AH 與受體A′結合，化合物X 與受體X′結合，而B′位置懸空，方能形成苦味[33]。基于苦味受體的識別作用，梳理出分子對接、藥效團模型等虛擬篩選方法，細胞膜色譜法、親和超濾法等生物垂釣篩選方法[34]，及等溫滴定量熱法、鈣離子測定等理化檢測篩選方法（表2）。

表2 苦味物質研究方法Table 2 Research methods for bitter components

分子對接和藥效團模型基于苦味受體理論快速篩選潛在苦味成分，為苦味分子與苦味受體的結合作用提供重要信息，輔助苦味成分的結構分析；細胞膜色譜法和親和超濾法基于苦味受體對苦味成分的識別作用，利用苦味受體篩選中藥混合組分中的苦味物質；等溫滴定量熱法測量反應發生過程中的熱量變化，檢測苦味分子的存在，判斷成分的苦味強弱；鈣離子測定是苦味信號的間接表征，鈣離子信號的強弱反映苦味成分的多少。相較于依據成分的結構相似性判別苦味，基于苦味受體對苦味分子的結合作用，采用計算機虛擬篩選、生物化學檢測方法，判別苦味成分與苦味受體的結合能、反應熱、反應信號，利用超濾膜、生物柱色譜濾過篩選苦味成分，所得實驗結果更具象，也更具說服力。

4.1 虛擬篩選

4.1.1 分子對接 分子對接是基于受體結構篩選配體分子的虛擬篩選方法，在中藥活性成分篩選中發揮著重要作用。分子對接法借助化合物數據庫、對接軟件對化合物分子和生物受體進行對接模擬，利用機器算法對對接結果進行評價[35]，以評價結果判斷化合物分子與生物受體親和力，以此篩選高親和力的目標成分。對接過程主要包括數據庫選擇化合物分子、化合物與受體三維結構轉化、對接方法選擇、對接結果評價等。BitterDB 是應用較多的公共苦味分子數據庫，涵蓋700 多種苦味成分的名稱、結構、能激活的苦味受體及苦味成分間的相似度[36]，為苦味分子對接提供了數據平臺。韓彥琪等[37]利用同源建模、分子對接，初步推測延胡索中原小檗堿型化合物可能是其主要的苦味成分。李軒豪等[38]采用分子對接技術，發現翼首草中的苦味成分主要是8-表馬錢苷酸、馬錢苷酸等環烯醚萜苷類成分和新綠原酸、咖啡酸等酚酸類成分。需要注意的是，分子對接結果的準確性主要依賴于對接方法及評價打分，對接分數高不代表分子配體與生物受體結合作用一定好，后續還需進行生物實驗驗證。

4.1.2 藥效團模型 藥效理論認為相同活性的分子有結構相同的藥效團。藥效團模型在苦味成分篩選中發揮著重要作用，是應用較多的虛擬篩選方法之一。該方法的重點是構建藥效團模型和篩選候選物。構建藥效團主要內容包括生成數據集、構建藥效團、驗證藥效團。目前已知人類的苦味受體有25 種，不同苦味受體結構存在差異，任何一種苦味受體都無法識別所有的苦味分子。Meyerhof 等[39]驗證了人體內25 個苦味受體與苦味成分間并非“一對一”識別，如典型的苦味成分——咖啡因[40]，可以同時被TAS2R7、10、43、46 多個苦味受體識別，TAS2R39可以同時識別茶黃素和茶黃素-3,3′-O-雙沒食子酸酯[41]。為提高篩選苦味成分成功率的同時減少工作量，一般選擇具有苦味廣譜性的 TAS2R10、TAS2R14[42-43]、TAS2R46[39]受體來構建藥效團模型。Zhang 等[44]通過構建TAS2R14 藥效團模型，從柴胡主要活性成分柴胡皂苷的3 種亞型（柴胡皂苷a～c）中鑒定出柴胡皂苷b 為TAS2R14 的直接激動劑。Ke 等[45]建立了TAS2R10、14、46 受體的藥效團模型，分別從黃連解毒湯中篩選出二氫木脂素A、黃芩黃酮II、黃柏酮等15 或16 種苦味成分。分子對接、藥效團模型是應用最廣泛的虛擬篩選方法，2 種方法常在數據平臺和計算機軟件結合使用。此外，藥效團模型與化學計量方法聯用可用于推測苦味分子構象、計算配體與受體結合能量。

4.2 生物垂釣

4.2.1 親和超濾法 親和超濾法是一種基于生物受體親和作用篩選配體分子的方法[46]，與分析方法聯用可實現活性成分的快速篩選與識別。分離苦味受體細胞并培養，將其固定在超濾膜上來過濾篩選潛在的苦味物質（圖3）。篩選苦味成分主要有2 部分：（1）親和識別、濾過篩選苦味成分；（2）解析成分、驗證活性。在親和識別成分中，需對親和條件如苦味受體的用量進行考察。若苦味受體過多，無親和力或弱親和力的成分可能會通過物理作用與空白受體結合，造成假陽性結果；倘若苦味受體過少，活性成分可能會因無靶標受體可結合而流失，造成假陰性結果。在成分分析部分，親和超濾法常聯用質譜技術或液質技術用于中藥活性成分的篩選[46-47]。相較于傳統的提取、分離、鑒定再活性驗證的分析方法，親和超濾法在篩選苦味活性成分的同時，剔除了無苦味活性的成分，達到富集苦味成分的效果，有利于苦味成分的高效發現。

圖3 親和超濾法和細胞膜色譜法篩選苦味成分Fig.3 Affinity ultrafiltration method and cell membrane chromatography method screen bitter components

4.2.2 細胞膜色譜法 細胞膜色譜法是一種基于膜受體與配體分子親和作用識別、分離活性成分的生物色譜方法[48]。根據目標成分選用相關活性的細胞，可分離相應活性成分。在以苦味成分作為目標成分的細胞膜色譜法篩選實驗中，將苦味細胞膜嵌合到色譜柱中作為固定相，含有潛在苦味成分的中藥提取液流經色譜柱模擬服藥后中藥成分的體內過程，色譜柱可有效保留與苦味受體親和程度高的藥物分子，達到苦味受體親和識別苦味成分和色譜柱分離苦味成分的雙重作用。細胞膜存在活性周期，可能因為嵌合不穩固而脫落，影響篩選成分的效率。為提高細胞膜色譜柱的使用周期，通常會在傳統細胞膜色譜法的基礎上做出改進，如利用磁性納米顆粒輔助穩定細胞膜[49]。細胞膜色譜法利用苦味細胞膜的特異性識別苦味成分，利用高效率的色譜柱分離苦味成分，有望為分離中藥苦味成分提供一種生物垂釣結合化學分離的篩選方法。Tang 等[50]將小鼠胚胎成纖維3t3-l1 細胞與黃連粗提物共孵化，再結合高效液相色譜分析技術，應用此法成功篩選出黃連中的小檗堿成分。

4.3 理化檢測

4.3.1 等溫滴定量熱法 等溫滴定量熱法是基于化合物分子與生物蛋白相互作用產生的微量熱變化來識別成分，是一種通過物理檢測識別生物反應來篩選苦味物質的方法[51]。分子間發生作用會產生熱量信息，測定反應過程的焓、熵、自由能等熱力學參數、結合解離常數、結合常數等可推測反應物的化學計量比。此法還可直接測量反應速率[52]，一定程度上反映化合物的濃度和活性。采用此法篩選苦味成分，計算機監測苦味受體結合苦味成分時的熱量變化，以此表征是否存在苦味成分及其結合強弱（圖4）。Ogi 等[53]采用等溫滴定量熱法檢測苦味成分與脂肪酸發生作用時的熱量變化，發現熱量變化強度與脂肪酸的碳鏈長度有關，為脂肪酸掩蔽苦味機制研究提供重要參考。柚皮素是一種苦味的類黃酮，與蛋白質形成復合物可有效掩蓋苦味，Nunes 等[54]采用等溫滴定量熱法表征柚皮素與乳鐵蛋白1∶1復合物的熱力學結合，結果表明該復合物的形成主要由焓和熵驅動。相較于其他苦味成分篩選方法，該法無需固定或標記苦味受體，穩定性好、靈敏度高，可用于檢測苦味成分的初步篩選。

圖4 等溫滴定量熱法和鈣離子測定法檢測苦味成分Fig.4 Isothermal titration calorimetry method and calcium ion measurement method detect bitter components

4.3.2 鈣離子測定法 鈣離子是苦味受體上鈣敏感體的內源性配體，可作為反映苦味成分激活苦味受體的重要信號[55]。苦味信號傳導過程中會引起鈣離子內流、內質網釋放鈣離子，苦味細胞內外鈣離子濃度會發生顯著變化。鈣離子量化手段成熟，鈣離子測定、鈣離子成像[56]可以量化胞內鈣離子變化。Abbas 等[57]通過鈣成像反應，輔助啤酒花苦酸（matured hop bitter acids，MHBA）篩選能誘導MHBA刺激腸內分泌細胞產生膽囊收縮素（cholecystokinin，CCK）的苦味受體，結果表明，人TAS2R1、8、10和小鼠TAS2R119、130、105 有助于MHBA 誘導腸內分泌細胞產生CCK。鈣成像技術可以記錄胞內鈣離子的動態變化，鈣離子熒光探針[58]可將受體細胞內的鈣離子濃度變化通過信號轉化以熒光的形式展現出來（圖4）。雖然內質網上鈣離子的流動、細胞膜上鈣離子的進出并非僅由苦味沖動引發，但該法可用于潛在苦味成分的快速篩查。

5 結語與展望

譜-效關聯法利用數據分析方法將指紋圖譜與藥效學信息關聯，常應用于中藥活性與成分關系研究和中藥質量控制[59]，為苦味成分發現提供了新思路——譜-味關聯。譜-味關聯以中藥化學成分指紋圖譜和口感評價為研究內容，以數據分析方法為研究手段，構建譜-味數學模型，揭示成分-苦味的相關性。現代技術支撐下的中藥化學指紋圖譜、中藥生物指紋圖譜能全面反映苦味中藥的整體組分和藥效活性，灰色關聯度分析、多元線性回歸分析、主成分分析等單一分析方法使用或多種分析方法聯用等數據分析方法將為苦味成分的篩選提供有力支撐。課題組以譜-味關聯為研究思路，解析了12 批不同來源三七水提液化學指紋圖譜與苦味強度的相關性，發現了人參皂苷Rg1等3 種主要苦味成分[60]，為其他苦味成分的發現提供了方法參考。

本文根據中藥苦味特點結合當下研究手段綜述了中藥苦味成分的發現策略，為從中藥復雜體系中分離分析苦味成分提供了方法參考。本草學知識可通過文獻性效記載、植物親緣關系初步判斷藥物的整體苦味，減少苦味成分篩選的盲目性。傳統分離手段逐步分離富集苦味成分，定性定量分析手段可輔助實現苦味成分的精準辨識。利用苦味成分的結構相似性或特征性苦味基團，是發現苦味成分的重要途徑。基于苦味受體的識別作用，發展出分子對接等虛擬篩選方法、親和超濾等生物垂釣篩選方法、等溫滴定量熱等理化檢測方法。基于數據挖掘和機器算法的發展，譜-味分析法可為發現關鍵苦味成分提供參考方法。上述方法在挖掘苦味成分方面各有優勢，但也存在一定局限性，多法聯用可取長補短，提高苦味成分的發現幾率，將成為未來中藥苦味成分發現的重要思路。中藥苦味成分的精準發現，對于深入理解中藥的苦味呈味特征與機制具有理論價值，對開發針對性的掩苦抑味方法具有現實意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突