糖尿病足嚴(yán)重程度連續(xù)分級(jí)創(chuàng)面菌群組成

蔡玉蘭 陽(yáng)琰 岳瑜 牟芝群 姚楊 胡皓銘 吳旻 鄧嘉杰

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病科,貴州 遵義 563003)

糖尿病足(DF)是糖尿病患者常見的嚴(yán)重并發(fā)癥之一,指由于患者下肢不同程度神經(jīng)和血管病變導(dǎo)致的足部潰瘍、感染和(或)深層組織破壞,DF發(fā)病率及相關(guān)死亡率逐年升高,我國(guó)DF發(fā)病率高達(dá)15%,年截肢率高達(dá)22%,年死亡率高達(dá)11%〔1,2〕。準(zhǔn)確識(shí)別DF創(chuàng)面中菌群組成,及時(shí)使用針對(duì)性的抗生素治療,是創(chuàng)面愈合過程中最重要、最關(guān)鍵的一步。目前經(jīng)驗(yàn)性抗生素的選用基于臨床醫(yī)生對(duì)DF創(chuàng)面嚴(yán)重程度的判斷和指南中對(duì)廣譜抗生素的推薦,結(jié)合患者對(duì)當(dāng)前抗生素的治療效果,綜合決定抗感染治療方案〔3〕。然而,DF中多重耐藥菌的高發(fā)生率與廣譜抗生素的不恰當(dāng)使用密切相關(guān)〔4〕。越來越多的證據(jù)表明,基于下一代測(cè)序的菌群分析具有全面、快速的優(yōu)勢(shì),可以為DF的診治提供可靠依據(jù)。目前尚未有研究基于下一代測(cè)序全面分析DF創(chuàng)面菌群組成,本文基于16S rRNA測(cè)序分析不同嚴(yán)重程度DF創(chuàng)面菌群的組成。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 納入2020年7月至2021年7月遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院治療的DF患者80例,根據(jù)患者創(chuàng)面感染嚴(yán)重程度、體征及檢驗(yàn)指標(biāo)將患者分為足部血流、受影響范圍、嚴(yán)重程度、感染、感覺能力(PEDIS)1、2、3、4級(jí)組,每組20例。各組性別組成、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、空腹血糖、血紅蛋白及白蛋白等資料無明顯差異(P>0.05)。隨著患者的DF病程增加,其PEDIS分級(jí)也逐漸增加。且PEDIS分級(jí)越高的DF患者,血糖控制不佳,糖化血紅蛋白逐漸增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。血白細(xì)胞、血中性粒細(xì)胞、降鈣素原、C-反應(yīng)蛋白、紅細(xì)胞沉降率及血肌酐均隨著PEDIS分級(jí)的增加而逐漸升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 各組人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和實(shí)驗(yàn)室資料(n=20)

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2019 國(guó)際糖尿病足工作組指南中對(duì)糖尿病足的診斷并符合PEDIS分級(jí)。PEDIS 1級(jí)(未感染)：創(chuàng)面無炎癥表現(xiàn)或膿性分泌物;2級(jí)(輕度感染)：局部感染,僅累及皮膚和皮下組織,未累及深層組織,潰瘍周圍皮膚炎癥范圍≤2 cm2;3級(jí)：具備輕度感染的表現(xiàn),同時(shí)感染累及皮膚和皮下深層組織(如：肌腱、肌肉、關(guān)節(jié)和骨),潰瘍周圍皮膚炎癥范圍>2 cm2,不存在感染的全身中毒表現(xiàn);4級(jí)(重度感染)：具備中度感染的表現(xiàn),并有全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)≥2項(xiàng)的以下表現(xiàn)：體溫>38 ℃或<36 ℃;心率>90次/min;呼吸頻率>20次/min或動(dòng)脈二氧化碳分壓<32 mmHg;白細(xì)胞計(jì)數(shù)>2×109/L或<4×109/L,或不成熟形式≥10%〔5,6〕;②未合并其他皮膚病變;③未合并其他可能影響創(chuàng)面愈合的疾?。喝缱陨砻庖咝约膊〉?④患者及其家屬同意參與本項(xiàng)研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重心、腦、腎疾病;②雖存在足部病變,但未明確診斷糖尿病;③既往有服用免疫抑制劑或激素等影響自身免疫及創(chuàng)面愈合的藥物。

1.3取樣 取適量生理鹽水沖洗創(chuàng)面,清除創(chuàng)面表面壞死組織后取深部組織標(biāo)本,立即保存于-80 ℃,用于后續(xù)樣本DNA的提取。標(biāo)本命名為DF01、DF02……DF80,其中,DF01～20為PEDIS 1級(jí)組,DF21～40為PEDIS 2級(jí)組,DF41～60為PEDIS 3級(jí)組,DF61～80為PEDIS 4級(jí)組。

1.416S rRNA測(cè)序 根據(jù)組織DNA提取試劑盒的操作步驟(EchoLUTION),在同一時(shí)間提取保存在-80 ℃創(chuàng)面組織的DNA,經(jīng)過質(zhì)控后PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3、V4區(qū)(引物序列：V3區(qū)：355F：5′-CCTACGGGRSGCAGCAG-3′和534R：5′-ATTACGGCGGCTGCTGG-3′;V4區(qū)：515F：5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′和806R：5′-GGACTACNVGGGTWTCTAA-3′)。擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)過質(zhì)量檢測(cè)及純化后構(gòu)建測(cè)序文庫(kù),上機(jī)測(cè)序(測(cè)序平臺(tái)為：Illumina;測(cè)序方案為：PE250)。

1.5下機(jī)數(shù)據(jù)處理 測(cè)序獲得的下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過拆分、組合、質(zhì)控、聚類后與Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行物種注釋。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料、獨(dú)立樣品t檢驗(yàn)、獨(dú)立樣品曼-惠特尼U檢驗(yàn)、Pearsonχ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1菌群α多樣性分析 反映菌群物種豐富度的Chao1(P=0.518)和ACE指數(shù)(P=0.621)在PEDIS 1～4級(jí)中無顯著差異,而反映物種多樣性的Shannon和Simpson指數(shù)在4組中有明顯差異,呈逐漸降低趨勢(shì)(均P<0.001),見圖1。

圖1 菌群的α多樣性分析

2.2優(yōu)勢(shì)菌門及優(yōu)勢(shì)菌屬分析 隨著DF患者PEDIS分級(jí)的增加,創(chuàng)面菌群中厚壁菌門及放線菌門的豐度逐漸降低,而擬桿菌門的豐度逐漸增加,在PEDIS 4級(jí)創(chuàng)面中豐度最高。隨著PEDIS分級(jí)的增加,創(chuàng)面中普氏菌屬、厭氧球菌屬、擬桿菌屬、戈?duì)柕戮鷮俚呢S度逐漸增加,鏈球菌屬、葡萄球菌屬的豐度逐漸降低(P<0.05),見圖2。

圖2 各組優(yōu)勢(shì)菌門、菌屬堆疊圖

2.3各組Marker菌群分析 基于LEfSe分析尋找各組Marker菌群,結(jié)果顯示,PEDIS 1～4級(jí)組的Marker菌門分別是厚壁菌門、厚壁菌門、變形菌門及擬桿菌門;PEDIS 1～4級(jí)組的Marker菌屬分別是鏈球菌屬、厭氧球菌屬/葡萄球菌屬、克雷伯菌屬及普氏菌屬(P<0.05),見圖3。

圖3 各組Marker菌門及菌屬分析

3 討 論

近年來,糖尿病患病率逐年升高,2015～2017年我國(guó)第8次全國(guó)性糖尿病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,我國(guó)糖尿病患病率已高達(dá)11.2%,中國(guó)內(nèi)地的糖尿病患者預(yù)計(jì)達(dá)1.298億(2020年中國(guó)2型糖尿病防治指南)〔7〕。糖尿病患病人數(shù)逐年升高,多種糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生率也隨之上升,其中,對(duì)患者生活質(zhì)量影響最大的DF的患病率顯著上升。2016年,糖尿病相關(guān)下肢并發(fā)癥的患者人數(shù)達(dá)到全球人口總數(shù)的1.8%(1.31億),DF不僅是常見需要住院治療的糖尿病并發(fā)癥,也是糖尿病患者下肢截肢的最常見誘因,高達(dá)28%的DF患者發(fā)生不同程度的下肢截肢,全世界約每20 s就有1例患者因?yàn)镈F失去下肢。據(jù)統(tǒng)計(jì),因DF進(jìn)行大截肢或小截肢的患者,術(shù)后5年死亡率接近40%〔8〕。DF發(fā)病率高、預(yù)后差,不僅降低了患者的生活質(zhì)量,還帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),對(duì)醫(yī)療保健體系挑戰(zhàn)巨大〔9〕。

感染是導(dǎo)致DF創(chuàng)面加重,影響其創(chuàng)面愈合的重要因素,目前的治療通?；谂R床醫(yī)生對(duì)患者創(chuàng)面嚴(yán)重程度的判斷而經(jīng)驗(yàn)性選用抗生素?；谂囵B(yǎng)法的研究結(jié)果提示,DF創(chuàng)面中最常見的革蘭陽(yáng)性(G+)球菌是金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、無乳鏈球菌;最常見的革蘭陰性(G-)桿菌是大腸埃希菌、變形桿菌、陰溝腸桿菌〔10〕?；赪agner分級(jí)的DF創(chuàng)面菌群培養(yǎng)結(jié)果顯示,Wagner 2級(jí)創(chuàng)面中金黃色葡萄球菌占52.63%,大腸埃希菌占25.00%。Wagner 3級(jí)創(chuàng)面中金黃色葡萄球菌占82.61%,大腸埃希菌占30.00%。Wagner 4級(jí)創(chuàng)面中金黃色葡萄球菌占66.67%,大腸埃希菌占25.00%〔11〕。隨著DF創(chuàng)面進(jìn)展,PEDIS分級(jí)增加,創(chuàng)面中G+菌的豐度逐漸降低,G-菌的豐度逐漸增加,且好氧菌逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閰捬蹙?。可以看?培養(yǎng)法雖然仍然是在臨床上占主導(dǎo)地位的微生物檢測(cè)方法,但受限于培養(yǎng)條件及取樣方法等,其在培養(yǎng)厭氧菌方面的有效性仍具有爭(zhēng)議〔12〕。且隨著DF進(jìn)展,創(chuàng)面越來越深,感染厭氧菌的可能性會(huì)大比例升高,淺層好氧菌消耗掉氧氣也給深層的厭氧菌生長(zhǎng)創(chuàng)造了條件〔13〕。與本研究獲得的結(jié)果相符,最常見的厭氧菌是普氏菌屬及厭氧球菌屬。

本研究利用16S rRNA測(cè)序全面分析了DF創(chuàng)面進(jìn)展過程中的創(chuàng)面菌群組成,更全面地闡述了不同PEDIS分級(jí)創(chuàng)面中的菌群差異。但目前高通量測(cè)序技術(shù)分析感染組織標(biāo)本中菌群組成的方法還未納入臨床常規(guī)操作流程,尚不能直接指導(dǎo)臨床治療。此外,涉及DF創(chuàng)面菌群毒力因子和抗生素抗性及創(chuàng)面菌群之間相互作用的研究還有待完善。隨著研究的深入,高通量測(cè)序技術(shù)將來在臨床上的應(yīng)用會(huì)越來越多,有望替代傳統(tǒng)培養(yǎng)法成為臨床一線檢測(cè)方法。