外泌體在老年骨科疾病中治療應用的研究進展

侯德淼 唐梓晉 李卓 熊禮順 晏怡果

(南華大學衡陽醫學院附屬第一醫院脊柱外科,湖南 衡陽 421001)

干細胞外泌體(Exo)的應用和臨床治療潛力已成為再生醫學研究的新主流。干細胞Exo富含細胞因子、生長因子、信號脂質和調控小分子RNA(miRNA),在骨科系統、心血管系統、免疫系統、中樞神經等系統疾病的診斷和治療中發揮著越來越重要的作用。間充質干細胞(MSCs)是目前研究中最常用的細胞類型之一,是治療人類疾病的一種基于細胞的實驗療法。干細胞衍生的細胞外囊泡(EV),包括Exo和微囊泡(MV)。它們參與細胞間的通訊,對靶細胞的作用主要包括自分泌、旁分泌和遠距分泌。蛋白質、代謝產物和核酸從Exo轉運到受體細胞,并有效地改變細胞或組織的代謝和生物反應。此外,Exo還可以重新編程免疫細胞,并激活內源性修復途徑,影響組織對損傷、感染和疾病的反應。

在骨關節炎(OA)、骨質疏松(OP)、椎間盤退變(IVDD)等多種老年骨科疾病的發病機制、診斷和治療中干細胞Exo發揮著重要作用。Exo在調節復雜的細胞內途徑方面的固有特性已使其在許多疾病的治療控制中發揮了潛在的作用。Exo可以被設計成輸送不同治療的有效載體,包括短干擾RNA、反義寡核苷酸、化療藥物和免疫調節劑,并且具有將其輸送到所需靶點的能力。本文就干細胞Exo的在骨科疾病中的發病機制,及其作為治療載體在老年骨科疾病中的應用研究進展進行系統闡述。

1 OA

1.1骨髓MSCs(BMSCs)Exo BMSCs的Exo(BMSCs-Exo)可以影響細胞命運,包括增殖、遷移、侵襲和凋亡。Chen等〔1〕發現,BMSC-Exos可以挽救退行性軟骨細胞的線粒體功能障礙,還可以通過抑制受體活化因子(RANK)L-RANK-腫瘤壞死因子(TNF)受體相關因子(TRAF)6信號通路抑制軟骨下骨中破骨細胞的活性。還有一些研究發現〔2～4〕BMSC-Exo顯著促進軟骨和軟骨下骨的再生和修復,還可以通過顯著增加骨關節炎軟骨細胞中合成代謝標記物的表達,并降低了分解代謝標記基因的水平,以防止OA軟骨細胞凋亡〔5〕。

1.2滑膜MSCs(SMSCs)Exo SMSCs在體外表現出良好的軟骨分化能力,關節內注射SMSCs可明顯促進軟骨修復,在實驗動物模型中可用于治療OA〔6〕。Tao等〔7〕發現轉染miR-140-5p的SMSCs衍生的Exo(SMSC-140-Exos)不僅能促進軟骨細胞的增殖和遷移,還能防止體外細胞外基質(ECM)損傷。此外,在大鼠OA模型中,SMSC-140-Exos治療可顯著減輕關節磨損,降低國際關節炎研究學會(OARSI)評分并延遲OA進展。此外,Zhu等〔8〕發現,SMSC-Exos不僅能促進體外軟骨細胞的遷移和增殖,而且在膠原酶誘導的小鼠OA模型中,SMSC-Exos提高了國際軟骨修復協會(ICRS)評分,低了OARSI評分,并維持了軟骨內Ⅱ型膠原含量〔8〕。Guo等〔9〕使用Micro-CT分析顯示SMSC-Exos顯著改善了大鼠股骨頭壞死的骨小梁的微觀結構和礦物質密度。骨重塑(包括軟骨下骨改變和骨贅形成)是OA過程中常見的現象,且與OA進展密切相關〔9〕,因此,SMSCs或其他細胞來源的Exo在OA發病過程中的骨重塑作用值得研究。

1.3脂肪MSCs(AMSCs)Exo AMSCs在軟骨再生中有很強的潛力,被認為是治療OA的良好細胞源。Tofio-Vian等〔10〕發現脂肪源性Exo介導對OA成骨細胞的旁分泌效應,顯著降低與衰老相關β-半乳糖苷酶和γH2AX的活性。此外AMSC-Exos可以抑制TNF-α、白細胞介素(IL)-6、前列腺素(PG)E2和一氧化氮(NO)等促炎介質的產生,同時抑制基質金屬蛋白酶(MMP)活性和MMP-13水平升高,同時提高抗炎細胞因子白細胞介素(IL)-10和軟骨細胞特異性Ⅱ型膠原分子的水平〔11〕。Zhao等〔12〕通過人脂肪分離出的AMSC-Exos發現,Exo能上調miR145和miR221并下調促炎基因的表達促進軟骨形成并抑制炎癥。在一項活體實驗中,Woo等〔13〕發現,AMSC-Exos可以增強人OA軟骨細胞的增殖和遷移,并維持軟骨ECM。

1.4胚胎MSC(EMSCs)Exo EMSCs的Exo能調節軟骨細胞的生物學表型,能在OA模型中延緩OA進展〔14,15〕。Zhang等〔16〕在大鼠骨軟骨損傷處注射人胚胎干細胞來源的Exo后,他們觀察到軟骨和軟骨下骨的損傷在6 w時基本逆轉,在12 w時幾乎完全恢復,此外,這些Exo就能顯著促進新組織形成和ECM質沉積,增加M2巨噬細胞浸潤,減少M1巨噬細胞和促炎細胞因子的產生。與MSC相比,MSC-Exos在治療OA時更為保險、便捷和高效。相信隨著研究的更近一步,Exo將在OA的臨床診治中發揮更大的作用。

2 OP

OP是臨床常見的老年慢性疾病,以骨量減少、骨脆性增加及骨微結構破壞為主要特征〔17〕。大量研究證據表明,Exo可以直接影響破骨細胞、成骨細胞和骨基質干細胞,以調節骨的形成和吸收〔18～20〕,也可以誘導MSC向骨細胞分化〔21〕。

2.1骨髓基質源性Exo Luo等〔22〕研究發現,骨髓基質細胞(ST)衍生的Exo(ST-Exos)在體外顯著增強BMSCs的成骨分化。將ST-Exo傳遞到BMSCs中,讓ST-Exo表面與BMSCs特異性適配子結合,形成ST-Exos復合物,再將ST-Exos復合物靜脈注射到卵巢切除術(OVX)引起的OP小鼠模型中,結果證明了BMSCs特異性適配體功能化ST-Exos靶向增強OVX小鼠的骨量,加速小鼠股骨骨折模型的骨愈合〔22〕。Qiu等〔23〕及其團隊利用BMSC-Exos進行了體內外實驗,發現BMSC-Exos可減弱OP,闡明了Exo中miR-1503p上調可促進成骨細胞增殖分化。

2.2破骨細胞衍生Exo Zhu等〔24〕通過使用磁羥基磷灰石(MHA)支架改變破骨細胞來源的Exo,降低成骨細胞攝取Exo效率,促進了OP模型中的成骨細胞增殖,值得注意的是,在MHA刺激下,破骨細胞來源的Exo中,包括泛素、ATP和活性氧在內的某些蛋白質減少。

2.3內皮細胞源性Exo Song等〔25〕發現血管內皮細胞(EC)分泌的Exo(EC-Exos) 的骨靶向作用比成骨細胞來源的Exo或BMSC-Exo更強,EC-exos可以抑制破骨細胞活性,而且還發現EC-Exos內源性物質miR-155有治療OP的潛力。

2.4Exos作為潛在的生物標志物在老年人OP早期診斷、臨床干預和預后評估方面同樣具有良好的應用前景〔26,27〕。不同細胞來源Exo對OP的作用機制主要涉及激活各種信號轉導通路和調節基因的表達,從而影響骨重建過程中成骨細胞、破骨細胞和血管內皮細胞的生物學功能。但哪種細胞來源的ECM更適合作為治療的新型生物制劑,仍需從Exo的產量、成骨能力等多因素綜合分析。

3 椎間盤退行性病變(IVDD)

IVDD是與年齡有關的生物學改變,退變是衰老的過程。在IVDD過程中,髓核細胞的凋亡可能是髓核區域內細胞數量減少的重要原因〔28〕。MSC-Exos對IVDD的保護作用,有助于抑制髓核細胞(NPCs)的凋亡〔29〕。NPC吸收純化的MSC-Exos,MSC-Exos中miR-21富集,而凋亡NPCs中miR-21水平下調。Exo中的miR-21通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-AKT途徑靶向磷酸酶和緊張素同源物(PTEN)〔31〕,轉移到髓核細胞中,緩解TNF-α誘導的NPC凋亡〔29,30〕。此外,有研究〔31〕發現MSC-Exos可以調節內質網應激,抑制椎間盤退變期間髓核細胞過度凋亡,MSC-Exos通過激活AKT和ERK信號通路減弱內質網應激誘導的細胞凋亡。因此,MSC-Exos可以通過減少髓核細胞的死亡從而延緩IVDD的進展。

IVDD往往伴隨著髓核ECM的丟失,椎間盤中炎性因子和基質降解酶的大量積聚是造成這種現象的重要原因〔28〕。有研究〔32〕利用兔IVDD模型驗證了Exo降低核苷酸結合寡聚結構域(NLRP)3炎癥小體表達用于IVDD治療,結果證實NLRP3炎癥小體是IVDD治療的有效靶點。研究證明Exo對髓核細胞線粒體具有保護作用,因為Exo可以對抗H2O2對線粒體的作用,H2O2可以破壞線粒體結構,上調活性氧(ROS),從而激活硫氧還蛋白互作蛋白(TXNIP)/NLRP3炎癥小體和下游炎癥介質IL-1β,進而誘導ECM變性,而Exo可下調NP細胞中ROS水平,減少炎癥介質的釋放,降低NP細胞凋亡。因此,MSC-Exos還可以通過減少ECM降解,進而延緩IVDD的進展。

不僅如此,軟骨終板細胞的退變與IVDD也密切相關,有研究表明MSC-Exos能延緩軟骨終板細胞的凋亡和鈣化,從而延緩IVDD,有研究〔28〕通過叔丁基過氧化氫(TBHP)誘導的氧化應激細胞模型和IVDD大鼠模型得出這一結論,作者發現MSC-Exos下調凋亡相關蛋白的表達,使EPCs不受氧化應激導致凋亡和鈣化,而且MSC-Exo還通過表達miR-31-5抑制內質網相關應激從而抑制EPCs凋亡和鈣化〔33〕。此外,Luo等〔34〕發現,正常軟骨終板干細胞來源的Exo(N-Exos)比退化的軟骨終板干細胞來源的Exo(D-Exos)在體外和體內更能誘導自噬激活,并通過激活PI3K/AKT/自噬通路抑制髓核細胞凋亡和減緩IVDD的進展,Luo及其團隊還發現軟骨終板細胞在其自分泌Exo自分泌機制誘導下激活低氧誘導因子(HIF)-1α/Wnt信號通路,增加GATA結合蛋白4和TGF-β1的表達,從而促進軟骨終板細胞向髓核遷移并向NPCs的轉化,從而抑制IVDD〔35〕。

綜上,干細胞來源的Exo能夠促進髓核細胞的增殖,能夠抑制凋亡;并且,通過抑制基質蛋白酶的積累,增加細胞外矩陣的合成,抑制分解,從而維持ECM穩定狀態,抑制炎癥因子的出現,減少細胞微環境對髓核細胞的干涉。Exo還可以作用于軟骨終板,抑制軟骨終板細胞的凋亡和鈣化,促進終板軟骨細胞分化為髓核細胞,抑制IVDD。隨著研究的不斷深入,相信干細胞Exo在治療老年人IVDD方面能夠起到更大作用。

4 肌腱損傷

肌腱損傷分急性損傷和慢性損傷。老年人常見的是慢性損傷,慢性損傷是肌腱長期反復經受輕微外傷,或肌腱本身有慢性磨損,導致腱纖維變性、變細、日后輕微扭傷即可造成肌腱斷裂。肌腱干細胞(TSCs)是肌腱組織中發現的前體細胞,具有自我更新和分化的潛能,已廣泛應用于組織工程和肌腱損傷修復中〔36〕。許多研究表明,TSCs的應用可以有效地促進損傷肌腱的修復和再生〔37～40〕。在一項研究中,Zhang等〔36〕發現,TSC-Exos能促進肌腱細胞的增殖和遷移,并呈劑量依賴關系。Ⅰ型膠原是正常肌腱膠原蛋白的主要成分,參與肌腱結構的形成及其力學性能〔41〕。然而,相對于Ⅰ型膠原,Ⅲ型膠原表達增加會抑制膠原纖維的生長,導致瘢痕形成〔42,43〕。研究表明,Ⅰ/Ⅲ型膠原的最佳比例可能是促進肌腱損傷高質量愈合的主要因素〔44〕。肌腱組織的生物力學性能與肌腱膠原纖維的直徑密切相關,修復后膠原纖維直徑較大的肌腱組織比正常膠原纖維修復的肌腱組織具有更強的力學強度〔45,46〕。在同一項研究中,研究人員發現TSC-Exos在抑制瘢痕形成、增強肌腱損傷愈合的生物力學性能方面發揮了重要作用。另外,TSC-Exos在體內早期炎癥反應的過程中,發現通過調節與巨噬細胞相關的細胞因子來促進消炎和肌腱損傷的結合。這些發現證明了Exo在肌腱損傷修復中的潛在價值,也為TSC-Exos在肌腱損傷修復的臨床應用中提供了有力的證據。

最后,Exo在細胞凋亡、免疫調節和組織再生也發揮著重要作用〔47〕。許多研究已經報道了BMSCs和AMSCs在體外對巨噬細胞極化的影響〔48～54〕。一些研究證實,AMSC-Exos能夠在體外將巨噬細胞從M1表型調節為M2表型〔55～59〕。一項研究表明,將BMSC-Exos移植到肌腱損傷部位會促使巨噬細胞向M2表型分化,并降低M1/M2巨噬細胞比率〔60〕。同樣,局部應用BMSC-Exos到髕腱窗傷口也促進了巨噬細胞從M1表型到M2表型的極化〔60〕。Shen等〔55〕研究發現,AMSC-Exos在肌腱愈合的最早階段可以促進肌腱基質的再生,從而促進肌腱損傷修復。這些發現為肌腱損傷的生物治療提供了新的契機。研究發現,miR-29家族具有抗纖維化活性〔61～64〕。Yao等〔65〕研究發現,miR-29a-3p可能是臍帶間充質干細胞的Exos(UMSC-Exos)在肌腱愈合中發揮有利作用的關鍵miRNA。研究結果提示,PTEN/mTOR/TGF-β1信號通路可能是UMSC-Exos傳遞miR-29a-3p促進肌腱愈合的潛在途徑,并為通過工程化干細胞來源的Exo進行肌腱再生提供了一種新的治療策略。

5 肌肉損傷

骨骼肌挫傷是創傷和運動醫學中最常見的損傷之一〔66〕,老年人雨雪天氣受傷較為常見。由于挫傷后局部纖維化的形成,受傷的肌肉很容易再次損傷〔67〕。已經證明骨骼肌纖維化與損傷早期的過度炎癥反應有關〔68,69〕。巨噬細胞與炎癥浸潤密切相關,在骨骼肌愈合過程中起關鍵作用〔66,70,71〕。據報道,挫傷后中性粒細胞大量滲入損傷區,導致早期局部炎性血腫和濕重增加〔72,73〕。研究證明,BMSC-Exos在其他組織中也有抗炎作用〔74～76〕。Luo等〔77〕發現,小鼠肌肉挫傷后肌肉注射BMSC-Exos可減輕炎癥水平,BMSC-Exos在體內和體外均促進M2巨噬細胞極化,同時,BMSC-Exos減少炎癥微環境下炎性細胞因子的產生,上調抗炎因子的表達從而減輕小鼠肌肉挫傷,促進肌肉愈合。為肌肉損傷后的生物治療提供一種新的治療策略。通常認為α-平滑肌肌動蛋白(SMA)是活化的纖維化細胞亞群的生物標志物,其表達水平可以反映纖維化的過程〔78〕,在同一項研究中研究人員發現BMSC-外源性治療可能通過下調α-SMA蛋白的表達來降低纖維化水平。但BMSC-Exos在巨噬細胞耗竭后對肌肉纖維化和功能恢復的作用受到抑制,這也表明BMSC-Exo在肌肉愈合中的作用是通過調節巨噬細胞來實現的。此外,BMSC-Exos注射后的相對生物力學指標(快速收縮和強直強度)明顯改善,挫傷后的肌力提高,肌肉愈合的生物力學性能增強。這些研究結果為BMSC-Exos在臨床上用于肌肉愈合提供了有力的證據。

由于Exo在骨骼肌損傷和修復過程中選擇性地裝載內容物,因此可以在骨骼肌損傷修復過程中探究外泌體的不同內容物,對疾病發生的不同時間段進行優化治療,大大改善老年患者的骨骼肌損傷狀況。

綜上,Exo是當前一個熱門的研究領域。干細胞Exo富含細胞因子、生長因子、信號脂質和調控miRNAs,在OA、OP、IVDD等老年骨科疾病的診斷和治療中發揮著廣泛的作用,對修復肌腱損傷、肌肉損傷起到很大的作用。除了這些治療潛力之外,Exo還有幫助診斷疾病的潛力。目前,Exo可以用于無細胞再生,為降低風險的無細胞干細胞治療提供新的治療模式。但是,再生醫學在很大程度上取決于其生產的質量、可重復性和效力,這些參數同樣決定了Exo療法的發展。隨著今后開發更多標準化的純化和分析程序來研究Exo,這可能會揭示其功能異質性,為其在各種老年疾病中的作用提供了新的見解與方法。