基于SATB2/nox4信號通路探討miR-182-5p對結腸癌細胞增殖和遷移的調控作用

楊振 賈陌楊 魏傳奎 劉建剛

(山東第一醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 1普外科,山東 泰安 271000;2消化科)

結腸癌是胃腸道惡性腫瘤之一,是全球第三大常見癌癥〔1〕。近年來,人們的飲食結構發(fā)生了一定的變化,結腸癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢,且發(fā)病率與死亡率均位列惡性腫瘤中的前五〔2〕。結腸癌的發(fā)病機制目前尚未明確,遺傳、吸煙、飲酒、年齡、肥胖等均為引發(fā)結腸癌的危險因素〔3〕。結腸癌臨床癥狀較為隱匿,確診時多已發(fā)展至晚期,轉移率與復發(fā)率較早期明顯升高,對患者預后和遠期生存皆不利〔4〕。因此,探索結腸癌發(fā)病機制中的關鍵調控分子、揭示其遷移的具體機制,對結腸癌的防治具有重要的理論價值。miRNA具有對腫瘤細胞增殖、凋亡等過程的調控作用,多項研究表明,miR-182-5p在結直腸癌、乳腺癌、肝癌等癌癥中呈高表達,對癌細胞的惡性生物學行為起促進作用〔5～7〕。特定富含AT堿基DNA序列結合蛋白(SATB)2是一種核基質結合蛋白,在結腸癌組織中呈低表達,Chen等〔8〕研究表明,低水平SATB2與結腸癌的發(fā)生發(fā)展及轉移關系密切,Kinget等〔9〕發(fā)現(xiàn),miR-182-5p對SATB2具有靶向調控作用。本研究通過檢測miR-182-5p、SATB2與SATB2/還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nox)4通路相關蛋白在結腸癌組織與細胞中表達,觀察細胞增殖、遷移能力的變化,并分析miR-182-5p與SATB2/nox4間的調節(jié)關系。

1 材料和方法

1.1組織樣本 收集山東第一醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院2019年3～8月手術切除的43例結腸癌與癌旁正常結腸組織,組織均接受術后病理診斷鑒定〔10〕。其中男26例,女17例,年齡54～71〔平均(61.76±6.44)〕歲。TNM分期：Ⅰ期17例,Ⅱ期12例,Ⅲ期14例;分化程度：低分化12例,中分化24例,高分化7例;左半結腸癌23例,右半結腸癌20例。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會批準,患者均知情同意并自愿提供組織樣本。

1.2研究材料 人結腸癌細胞株SW480(貨號CL-0223)購自武漢普諾賽生命科技有限公司;DMEM高糖培養(yǎng)基(貨號11965092)、胎牛血清(貨號16140063)、Trizol試劑(貨號15596018)、mirVana miRNA分離試劑盒(貨號AM1561)購自美國Thermo Fisher公司;SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(貨號RR820A)購自大連寶生生物科技有限公司;All-in-One miRNA實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒(貨號QP016/AOMD-Q060)購自亞太恒信生物科技(北京)有限公司;慢病毒表達載體的構建、鑒定、包裝與滴度測定由廣州輝駿生物科技股份有限公司完成;PCR引物與內參購自鏡像綺點(上海)細胞技術有限公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)裂解液(貨號P0013G)、噻唑藍(MTT)細胞檢測試劑盒(貨號C0009S)、二喹啉甲酸(BCA)檢測試劑盒(貨號P0012)購自上海碧云天生物技術有限公司;兔IgG抗體(貨號ab172730)、兔SATB2(貨號ab92446)、兔nox4(貨號ab133303)、兔E-鈣黏蛋白(E-cadherin,貨號ab40772)、兔波形蛋白(Vimentin,貨號ab137321)購自美國Abcam公司;SP法免疫組化試劑盒(貨號PH1698)購自福州飛凈生物科技有限公司。

1.3細胞培養(yǎng)與分組 使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。SW480分為對照組(不進行處理)、NC-mimics組(轉染NC-mimics)、miR-182-5p-mimics組(轉染miR-182-5p-mimics)、miR-182-5p-mimics+pcDNA-NC組(轉染miR-182-5p-mimics+pcDNA-NC)、miR-182-5p-mimics+pcDNA-SATB2組(轉染miR-182-5p-mimics+pcDNA-SATB2)、NC-inhibitor組(轉染NC-inhibitor)、miR-182-5p-inhibitor組(轉染miR-182-5p-inhibitor)。按照分組進行慢病毒轉染,48 h后收集細胞用于后續(xù)相應實驗。

1.4雙熒光素酶報告基因檢測 使用生物信息學數(shù)據(jù)庫TargetScanHuman預測分析miR-182-5p和SATB2的結合位點,構建野生型(WT)和突變型(MUT)熒光質粒：psiCheck2-SATB2-Luc、psiCheck2-SATB2-MUT-Luc,并與miR-182-5p模擬物共轉染至SW480細胞中,檢測熒光素酶活性。

1.5qRT-PCR檢測組織miR-182-5p、SATB2與細胞miR-182-5p、SATB2、nox4、E-cadherin、Vimentin水平 組織、細胞使用Trizol試劑、mirVana miRNA分離試劑盒提取組織、細胞總RNA、miRNAs。總RNA反轉錄成cDNA,使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒配制20 μl PCR體系。miRNAs用All-in-One miRNA qRT-PCR試劑盒進行檢測。引物序列(5′-3′)為：miR-182-5p正向：ACGTGATGCTGATGCTGCG,反向：TAGCGTAGCTGTACTGTGC;U6正向：CTCGCTTCGGCAGCACATATACT,反向：ACGCTTCA CGAATTTGCGTGTC;SATB2正向：TGTAGCTGTAG CTGTAGTGCAC,反向：GTAGCTGATCGTAGTGCTGTAT;nox4正向：TAGCTGATCGTGATGCTGTAGC,反向：CGGTATCGTTACTGTAGTCGTA;E-cadherin正向：TAGCTGTAGTCGTGATCGTAGT,反向：GTCATGCTGTAGTGCTGATGCG;Vimentin正向：CTAGCTGTAGCTGTAGTGCTGTC,反向：GCTGATGCTGTAGCTGTAGCTC;β-actin正向：ATGCATCTGCTGATGCGTACTG,反向：GCTGATGCTGTAGCTGTAGCTC。應用2-ΔΔCt法計算miR-182-5p、SATB2、nox4、E-cadherin、Vimentin的相對表達水平。

1.6染色質免疫共沉淀 對照組細胞培養(yǎng)覆蓋率達到90%后,加入37%多聚甲醛,室溫交聯(lián)10 min后加入濃度為0.125 mol/L的甘氨酸終止交聯(lián)。吸出細胞培養(yǎng)基,加入預冷1×磷酸鹽緩沖液(PBS)洗兩遍,刮下細胞并于4 ℃、2 000 r/min條件下離心2 min。收集細胞沉淀,加入SDS裂解液后超聲破碎,收集上清液并分為IgG陰性對照組和SATB2組,加入protein A磁珠與相應抗體后置于4 ℃過夜。洗滌沉淀復合物,設計miR-182-5p的ChIP引物為正向：5′-GAGTGTCCAGGGTTCGTCTG-3′,反向：5′-GGTACACTTCTTTGCCCCCA-3′,qRT-PCR分析洗滌后的DNA片段,用2-ΔΔCt法計算相對值。

1.7MTT法檢測細胞增殖能力 對照組、NC-mimics組、miR-182-5p-mimics組、NC-inhibitor組、miR-182-5p-inhibitor組細胞接種于96孔板上,接種密度5×103個/孔,每孔100 μl,培養(yǎng)24、48、72、96 h后每孔加入濃度為5 mg/ml的MTT試劑10 μl,37 ℃孵育4 h后除去上清液,每孔加入100 μl二甲基亞砜,酶標儀570 nm測定吸光度(OD)值。重復3次。

1.8劃痕實驗檢測細胞遷移能力 對照組、NC-mimics組、miR-182-5p-mimics組、NC-inhibitor組、miR-182-5p-inhibitor組細胞接種于6孔板中,接種密度1×106個/孔。待細胞鋪滿90%,用200 μl移液器槍頭作劃痕,清除脫落的細胞,加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。于劃痕后(0 h)、培養(yǎng)24 h后拍照,測量劃痕寬度,計算細胞遷移率。

1.9Western印跡檢測SATB2、nox4、E-cadherin、Vimentin表達 收集對照組、NC-mimics組、miR-182-5p-mimics組、NC-inhibitor組、miR-182-5p-inhibitor組細胞沉淀,經裂解液充分裂解后于4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min,保留上清液,BCA定量后制樣。經電泳、轉膜,截取目的條帶浸于封閉液中,室溫封閉1 h。加入稀釋比例為1∶500的一抗孵育液,4 ℃環(huán)境下過夜。加入稀釋比例為1∶5 000的對應二抗孵育液,室溫孵育2 h,洗膜后加入電化學發(fā)光(ECL),避光反應5 min,收集熒光圖像結果。

1.10體內異種移植實驗 對照組、NC-mimics組、miR-182-5p-mimics組、miR-182-5p-mimics+pcDNA-NC組、miR-182-5p-mimics+pcDNA-SATB2組細胞制成5×107個/ml的單細胞懸液。裸鼠按照各組細胞名稱隨機分組,每組6只。原位接種細胞懸液,3 w后處死裸鼠,完整取出腫瘤,拍照稱重后置于10%甲醛溶液中固定,常規(guī)石蠟包埋制成切片。

1.11免疫組化檢測腫瘤組織SATB2、nox4表達情況 采用免疫組化SP法檢測裸鼠腫瘤組織SATB2、nox4表達。按照試劑盒要求處理石蠟切片并進行染色操作,光鏡下拍攝實驗結果,用ImageJ軟件分析圖像,計算SATB2、nox4相對表達量。

1.12統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1miR-182-5p和SATB2在結腸癌中表達 結腸癌組織miR-182-5p相對表達量(1.47±0.08)明顯高于癌旁組織(1.00±0.05;t=32.716,P=0.000),結腸癌組織中SATB2相對表達量(0.20±0.04)明顯低于癌旁組織(0.49±0.07;t=24.608,P=0.000)。miR-182-5p與SATB2水平呈負相關(r=-0.655 2,P<0.000 1)。見圖1。

圖1 miR-182-5p與SATB2相關性

2.2miR-182-5p靶向調控SATB2表達 miR-182-5p與SATB2存在結合位點(圖2)。miR-182-5p能夠明顯降低野生型3′UTR的SATB2熒光素酶活性(P<0.05),對突變型3′UTR的SATB2熒光素酶活性沒有影響(P>0.05),說明miR-182-5p能夠直接靶向作用于SATB2。染色質免疫共沉淀結果顯示,過表達SATB2導致miR-182-5p與SATB2的結合能力明顯下降(P<0.05)。見表1、表2。

表1 雙熒光素酶報告基因檢測結果

表2 染色質免疫共沉淀檢測

圖2 miR-182-5p靶向調控SATB2表達

2.3miR-182-5p增強結腸癌細胞增殖、遷移能力 MTT檢測結果顯示,對照組、NC-mimics組、NC-inhibitor組細胞增殖能力差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與對照組、NC-mimics組、NC-inhibitor組相比,miR-182-5p-mimics組細胞增殖能力明顯增強(P<0.05),miR-182-5p-inhibitor組細胞增殖能力明顯降低(P<0.05)。劃痕實驗結果顯示,對照組、NC-mimics組、NC-inhibitor組細胞遷移率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與對照組、NC-mimics組、NC-inhibitor組相比,miR-182-5p-mimics組細胞遷移率明顯升高(P<0.05),miR-182-5p-inhibitor組細胞遷移率明顯降低(P<0.05)。見圖3、表3。

表3 各組細胞增殖能力、遷移率比較比較

圖3 miR-182-5p增強結腸癌細胞遷移能力(×200)

2.4miR-182-5p影響SATB2/nox4信號通路 對照組、NC-mimics組、NC-inhibitor組SATB2、nox4、E-cadherin、Vimentin mRNA與蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與對照組、NC-mimics組、NC-inhibitor組相比,miR-182-5p-mimics組SATB2、E-cadherin mRNA與蛋白表達量明顯下降,nox4、Vimentin mRNA與蛋白表達量明顯升高,miR-182-5p-inhibitor組SATB2、E-cadherin mRNA與蛋白表達量明顯升高,nox4、Vimentin mRNA與蛋白表達量明顯下降(P<0.05)。見表4、圖4。

1～5：對照組、NC-mimics組、miR-182-5p-mimics組、NC-inhibitor組、miR-182-5p-inhibitor組 圖4 各組SATB2/nox4信號通路相關蛋白表達

表4 各組SATB2/nox4信號通路相關蛋白與mRNA表達比較

2.5SATB2逆轉miR-182-5p對結腸癌細胞惡性生物學行為的增強作用 對照組、NC-mimics組腫瘤體積、質量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),miR-182-5p-mimics組、miR-182-5p-mimics+pcDNA-NC組腫瘤體積、質量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與對照組、NC-mimics組相比,miR-182-5p-mimics組、miR-182-5p-mimics+pcDNA-NC組腫瘤體積、質量明顯更大(P<0.05),miR-182-5p-mimics+pcDNA-SATB2組體積、質量明顯更小(P<0.05)。免疫組化結果顯示,對照組、NC-mimics組SATB2、nox4表達無明顯差異(P>0.05),miR-182-5p-mimics組、miR-182-5p-mimics+pcDNA-NC組SATB2、nox4表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與對照組、NC-mimics組相比,miR-182-5p-mimics組、miR-182-5p-mimics+pcDNA-NC組SATB2表達量明顯降低,nox4表達量明顯升高(P<0.05);miR-182-5p-mimics+pcDNA-SATB2組SATB2表達量明顯上升,nox4表達量明顯下降(P<0.05)。見圖5、圖6、表5。

表5 各組腫瘤質量、SATB2、nox4相對表達比較

圖5 各組體內異種移植

圖6 各組SATB2、nox4表達(免疫組化,×400)

3 討 論

結腸癌的預后水平與患者接受診斷時的分期、淋巴結轉移及遠處轉移關系密切,早期結腸癌患者的生存率相對較高,而出現(xiàn)轉移患者的生存率明顯降低〔11〕。結腸癌細胞通過遷移和增殖完成轉移和擴散,是導致患者接受治療后局部復發(fā)、病情惡化及死亡的病理基礎〔12〕。miR-182-5p已被多項研究報道其在多種癌癥中表達異常。王銳等〔13〕對比分析了70例結直腸癌患者與60例健康體檢者的血清miRNA-182-5p表達水平,發(fā)現(xiàn)結直腸癌患者miRNA-182-5p表達水平上升,且miRNA-182-5p水平與疾病臨床病理特征存在相關性。Yang等〔14〕研究指出,miR-182-5p在結直腸癌組織中上調,并與結直腸癌對5-氟尿嘧啶的抗性有關。本研究結果提示,高表達miR-182-5p對SW480的增殖與遷移能力有促進作用。

SATB2是一種組織特異性表達的核基質附著區(qū)結合蛋白,通過錨定核基質附著區(qū)參與轉錄調控和染色質重塑等過程,還能通過甲基化水平和蛋白乙酰化等途徑調控基因的表達,在腫瘤轉移、凋亡及免疫調節(jié)等方面均發(fā)揮著重要作用〔15〕。SATB2在結腸癌中呈低表達,其表達量下降可能與腫瘤的遠處轉移及患者預后情況相關〔16〕。Mezheyeuski等〔17〕對798例轉移性結直腸癌患者進行了人群隊列分析,發(fā)現(xiàn)SATB2高表達患者的預后和對化療的反應效果較SATB2低表達患者更好。研究發(fā)現(xiàn),SATB2在結腸癌中表達率較高,但表達量較正常腸黏膜組織更低,提示SATB2是一種抑癌基因〔18〕。本研究結果提示,SATB2逆轉了miR-182-5p對結腸癌細胞增殖、遷移的增強作用。nox4能夠促進細胞內活性氧產生,活性氧可作為第2信使促進細胞內信號通路轉導,進而參與調控細胞增殖、遷移等過程〔19〕。Mroueh等〔20〕提到nox4介導產生的活性氧可防止胰腺癌細胞和結腸癌細胞中的細胞凋亡并促進腫瘤細胞生長。上皮-間充質轉化是以上皮細胞極性消失及獲得間質特性為主要特征,在形態(tài)學上發(fā)生成纖維細胞或間充質細胞的轉化,并獲得遷移轉移的能力,在胚胎發(fā)育、慢性炎癥、多種纖維化疾病、腫瘤侵襲轉移等過程中發(fā)揮了重要作用〔21〕。E-cadherin、Vimentin可通過改變細胞間黏附作用調控癌細胞遷移、侵襲能力〔22〕,Wang等〔23〕研究表明,SATB2蛋白表達與上皮-間充質轉化過程存在相關性,與E-cadherin表達呈正相關,而與Vimentin表達呈負相關。本研究結果與徐紀中等〔24〕的研究結果一致。

綜上,miR-182-5p對結腸癌細胞的增殖和遷移能力具有促進作用,能夠降低SATB2表達并影響SATB2/nox4信號通路及其相關蛋白,SATB2能夠反向調控miR-182-5p表達。