DNA-PKcs在DNA損傷修復中的作用及機制

李煒娟 梁斌 黃雄峰 李亮榮

(南昌大學撫州醫學院公共衛生教研室,江西 撫州 344000)

機體在體內因素如DNA堿基錯配、自身不穩定性、機體代謝產生活性氧自由基(ROS)等,體外因素如輻射、化學毒物、藥物、病毒和霉菌等作用下,可以造成DNA損傷。DNA損傷有堿基損傷、錯配、DNA單鏈或雙鏈斷裂、嘧啶二聚體形成等多種類型。其中,DNA雙鏈斷裂(DSB)是一種非常嚴重的損傷類型。DSB的修復方式主要有兩種,分別是同源重組(HR)、非同源末端連接(NHEJ)〔1〕。HR修復過程中需要使用與受損DNA同源的一條完整姐妹染色體作為模板,因此更為準確,修復主要在細胞周期的S期和G2期〔2〕。NHEJ可以發生在細胞周期的各個時期,不需要模板,直接連接DNA斷裂的末端,修復過程中很容易出現錯配。哺乳動物發生DSB的主要修復方式是NHEJ。DNA依賴性蛋白激酶亞單位(DNA-PKcs)在NHEJ中發揮了重要作用。DNA-PKcs通過與Ku70/80蛋白結合形成DNA-PK復合物,并激活NHEJ下游因子,進行DSB斷端的修復與連接。隨著人們對DNA-PKcs在DNA損傷修復方面的深入研究,發現其在癌癥發展中的潛在影響作用,開始在癌癥治療中使用DNA-PKcs抑制劑。本研究對DNA-PKcs在DNA損傷修復中的作用及機制進行綜述。

1 DNA-PKcs的結構與功能

DNA-PKcs是一種Ser/Thr激酶,是磷脂酰肌醇3-激酶相關激酶(PIKK)家族的成員之一。DNA-PKcs是由4 128個氨基酸構成的,分子量約為469 kD,編碼合成該蛋白的PRKDC基因(也稱為XRCC7基因)位于染色體8q11.12上。DNA-PKcs可被細分為三大結構單位：一個大的 N 端螺旋結構域,其次是環形搖籃,含有多個HEAT,延長因子3,蛋白磷酸酶2(PP2A),雷帕霉素靶蛋白(TOR)1重復序列和一些保守的磷酸化簇,還有一個C末端,含有高度保守的催化激酶結構。激酶結構域的兩側是FAT(FRAP-ATM-TRRAP)和FAT-C(C端的FAT)結構域〔3〕。人們在不斷地研究過程中,發現了DNA-PKcs具有多種生物學功能,如參與DNA損傷修復、細胞自噬、代謝調節、維持端粒穩定等。本文主要討論DNA-PKcs在DNA損傷修復過程中發揮的作用。DNA-PKcs主要通過NHEJ方式參與DNA雙鏈斷裂的修復。NHEJ的主要過程包括：①Ku70/80二聚體識別和結合DSB末端,通過招募DNA-PKcs與 XRCC4、DNA 連接酶Ⅳ、XLF等因子將雙鏈斷裂末端連接在一起,此過程可以防止他們被核酸內切酶水解;②去除不可連接的末端;③最后連接DSB末端〔4〕。Ku70 和 Ku80 包含3個結構域：N末端vWA結構域、DNA結合/二聚體核心和C末端螺旋結構域。 DNA-PKcs可以與vWA 結構域的結合參與 DNA損傷位點的修復〔5〕。不同于Ku70 (C末端結構域包含增加 DNA 親和力的 SAP 結構域),Ku80 C末端結構域(CTD)包含關鍵的 DNA-PKcs 結合區域。Caspase-2 介導的 Ku80可與 DNA-PKcs 結合并形成 DNA-PK 復合物,通過FAT和FATC結構域的構象變化導致Ku異構體的內向轉移和DNA-PKcs的激活。DNA-PKcs被激活后,使參與 NHEJ機制中的其他蛋白發生磷酸化,例如XRCC4、XLF、DNA連接酶Ⅳ、Artemis〔3〕,將受損的DNA末端相互連接。DNA-PKcs自磷酸化以及磷酸化其他關鍵蛋白,促進斷端修復與連接,在DSB修復過程中發揮了重要作用。

2 DNA-PKcs對于DSB修復途徑的選擇

NHEJ和HR是DSB的兩種主要修復途徑,但是細胞如何在這兩種修復途徑中選擇,其機制未完全明了。DNA末端的切除啟動是選擇HR和防止NHEJ發生的明確因素〔6〕,DNA-PKcs磷酸化是影響末端切除的因素之一。許多研究表明,DNA-PKcs調節DSB途徑的選擇跟細胞周期有關。在G2期,DNA-PKcs自動磷酸化可以促進其與DSB結合位點解離并且促進末端切除酶的招募〔7〕。MRN(Mre11-Rad50-Nbs1)復合物能夠招募EXO1和增強DNA-PKcs自磷酸化,起到進一步刺激切除的作用。MRN復合物還能抑制XRCC4/DNA連接酶Ⅳ介導的DNA末端重新連接。在S期,BRCA1 與 DNA-PKcs 相互作用,直接阻斷 DNA-PKcs 自磷酸化,從而啟動 DNA 末端切除,進行HR途徑。有研究發現,由PISA4 E3連接酶介導的TIP60 K430的SUMO2修飾增加,阻礙了其與DNA-PKcs的相互作用,從而導致DNA-PKcs S2056自磷酸化受阻,在S期優先通過HR途徑進行DSB的修復。在G1期時,HR途徑受到抑制。DNA-PKcs可直接磷酸化 ATM,在 DNA 損傷時抑制 ATM 活性和 ATM 信號傳導,為 G1 期抑制HR途徑提供了機會。此外,促進DSB末端切除的酶EXO1在G1 期被嚴格抑制。RBX1 蛋白表達的增加促進了Skp1-Cullin1-F-box (SCF) 泛素 3 連接酶在 G1 期介導 EXO1的泛素化降解,抑制EXO1促進末端切除的功能。DNA-PKcs活性的增加是RBX1蛋白表達增加的原因,其活性增加亦限制EXO1參與DSB末端ssDNA的形成,抑制了G1細胞的HR修復途徑〔8〕。

3 DNA-PKcs與PP1的相互作用

DNA-PKcs在多個Ser/Thr殘基上發生自磷酸化并介導NHEJ。N末端Ser-56、 Ser-72和 Thr-3950是DNA-PKcs的3個自磷酸化位點,可導致激酶失活。PP1可使DNA-PK脫磷酸化達到激活DNA-PKcs激酶的活性。PP1是一種主要的Ser/Thr磷酸酶,由催化亞基和多種調節元件構成,通過靶向亞基實現某些特定功能〔9〕。PP1可使DNA-PK脫磷酸化達到激活DNA-PKcs激酶的活性。有研究表明,PP1調節DNA-PKcs的磷酸化及活化,在DNA損傷修復方面發揮了一定作用。在實驗中,研究者發現隨著PP1被耗盡,DNA-PKcs在Ser-2056的自磷酸化消失。相比之下,主要由ATM介導的DNA-PKcs在Thr-2609處的磷酸化反而增加。通過使用XRCC4作為底物的體外激酶試驗,證實了PP1的耗盡阻斷了DNA損傷后DNA-PKcs激酶的激活。為了闡明PP1對DNA-PKcs的依賴性調控,研究者做了進一步研究,發現PP1與DNA-PKcs的ABCDE和PQR簇及遠端N端區域結合。PP1的耗盡導致Thr-2609磷酸化的積累,表明PP1在Thr-2609和ABCDE簇的其他位點發揮了去磷酸化作用。相反,PP1的耗盡降低了Ser-2056自磷酸化的水平。Ser-2056 是DNA-PKcs的一個自磷酸化位點,其磷酸化情況可影響DNA-PKcs激活。以上結果提示,PP1是DNA-PKcs激活所必需〔10〕。

4 DNA-PKcs與scaRNA2的作用

關于DNA修復方面,RNA亦發揮了一定作用,如受損DNA轉錄的RNA可通過與互補DNA雜交來促進修復,或者是RNA被DICER和DROSHA轉化為小的雙鏈RNA后,刺激關鍵修復因子募集促進修復等〔11〕。snoRNA是一組執行多種生物學功能的非編碼 RNA,根據其結構相似性和生化功能,snoRNA家族可分為box C/D和box H/ACA snoRNA。scaRNA是 snoRNA 家族的一個子集,聚集在 Cajal 體中,在成熟前對剪接體 RNA 進行生化修飾〔12〕。研究表明,scaRNA在DNA修復過程中控制DNA-PK催化活性及雙鏈斷裂時修復途徑選擇的調節。有研究〔13〕采用交聯和免疫沉淀,證明scaRNA2直接結合DNA-PKcs,間接結合Ku70/80。scaRNA2和Ku70之間的關聯性在去除DNA-PKcs的細胞中增強,表明在與scaRNA2的結合過程中,DNA-PKcs和Ku70存在競爭關系。此外,實驗〔13〕發現,scaRNA2可抑制線性化質粒激活DNA-PK,但增加Ku70/80的濃度并不能防止這種抑制,進一步支持DNA-PKcs是scaRNA2靶標的結論。DNA-PKcs的S 2056是自磷酸化的,而T2609主要是通過ATM和ATR磷酸化的,因此S2056的磷酸化被用作DNA-PKcs活化的指標。在去除scaRNA2的細胞中,DNA-PKcs的自磷酸化升高,可得出其可抑制DNA-PKcs自磷酸化。為了明確scaRNA2抑制DNA-PKcs具體機制,研究人員做了進一步實驗〔13〕,在scaRNA2耗盡的細胞中對Ku80進行免疫沉淀,顯示其與DNA-PKcs的結合增強,與和Ku70之間的結合保持不變。Ku80與DNA-PKcs相互作用的增強在缺乏scaRNA2的細胞進行免疫沉淀時更加明顯。Ku80與DNA-PKcs的PQR自磷酸化簇(包括S2056位點)附近的區域結合,對于DNA-PKcs活化有重要意義。scaRNA2與DNA-PKcs的結合阻止了DNA-PKcs與Ku80的相互作用,從而抑制DNA-PKcs的活化〔13〕。

5 DNA-PKcs與TIP60的作用

TIP60最初被認為是一種60 kD的蛋白質,也稱為 KAT5,是與 HIV Tat 相關的組蛋白乙酰轉移酶(HAT)MYST 家族的成員〔14〕。TIP60可參與基因表達、轉錄、細胞凋亡、維持基因組穩定性 和DNA修復等多個細胞過程。當DSB發生,TIP60 將定位其受損位點并乙酰化 H3、H4 和 γH2AX,導致染色質松弛和重塑。為了探索TIP60和DNA-PKcs相互作用的機制及其在決策過程中的作用,Gao等〔15〕使用了免疫共沉淀 (Co-IP) 方法。他們首先使用來自 HeLa 細胞的無染色質細胞提取物使用針對 TIP60 的抗體進行 Co-IP 測定,發現TIP60 與 DNA-PKcs 的相互作用在 S 期細胞中顯著降低。其次,在HEK-293T 細胞中表達一系列 DNA-PKcs 截短突變體來確定 DNA-PKcs與 TIP60 相互作用的位點。結果表明,DNA-PKcs C 末端 H 結構域(AA3540-4128)負責其與 TIP60 的結合。接著通過在 HEK-293T 細胞中表達TIP60野生型(WT)或其截短或缺失的突變體來測試 TIP60 的哪個區域負責其與 DNA-PKcs 的相互作用,發現了TIP60 的 AA404-471 片段與 DNA-PKcs 存在直接相互作用。TIP60 的 AA404-471區域有兩個潛在的SUMO化位點：K430和K451。通過在 HEK-293T 細胞中表達TIP60和其突變體,發現在K430突變體中,S期TIP60和DNA-PKcs相互作用減弱的情況得到恢復。這一結果表明,K430 位點 可減弱TIP60 和 DNA-PKcs相互作用,尤其是在 S 期細胞中。有研究〔16〕探討了SENP3 介導的 TIP60 去泛素化調控TIP60與 DNA-PKcs 相互作用,表明TIP60 被 SENP3 快速去SUMO化,并在照射后促進其與 DNA-PKcs 相互作用,從而促進 NHEJ 修復。為了研究 SENP3 對 DNA-PKcs 活化的影響,他們進行了免疫熒光測定,以檢測 TIP60、DNA-PKcs 和 DNA-PKcs pS2056 在 DNA 損傷位點的定位。通過敲除 SENP3,發現DNA-PKcs pS2056 顯著降低,說明SENP3敲除降低了DNA損傷后的DNA-PKcs活性。

6 DNA-PKcs 抑制劑在癌癥治療的應用

PRKDC 突變和 DNA-PKcs 表達缺陷可導致 DSB 修復功能障礙,使基因組不穩定和突變積累,從而增加患癌癥的風險。許多研究分析了各種類型腫瘤臨床樣本中DNA-PKcs的表達水平,已發現多種癌癥的腫瘤發生與DNA-PKcs缺陷有關。Teneng等〔17〕通過體外研究表明,DNA-PKcs 的敲除顯著增加了博來霉素治療后檢測到的 DNA 損傷的數量,并導致支氣管上皮細胞的惡性轉化和腫瘤發生。DNA-PKcs的高表達與許多腫瘤類型的不良結果有關。Wang等〔18〕對不同時期的胃癌黏膜采用LC-MS/MS 分析測定表達蛋白的差異,發現DNA-PKcs表達隨著胃癌起始的不同階段成倍數增加,說明了異常的 DNA-PKcs可能與胃癌的發生有關。DNA-PKcs蛋白還可通過改變腫瘤微環境參與腫瘤進展。Kotula等〔19〕將DNA-PKcs缺陷的人黑色素瘤細胞接種到裸鼠體內以產生皮下腫瘤。 他們發現這些腫瘤的血管明顯少于非 DNA-PKcs 缺陷的腫瘤,增殖指數很低。 小鼠生存分析表明,DNA-PKcs缺陷小鼠的無遠處轉移生存率(MFS)明顯高于非DNA-PKcs缺陷小鼠,在癌癥治療中,放療和化療非常重要,其抗癌機制與誘導腫瘤細胞中致死性 DSBs 相關。DNA-PKcs 水平的增加增強了細胞中 DSB 修復,從而削弱了放療和細胞毒性藥物的致死作用。研究表明,DNA-PKcs 表達與乳腺癌患者對化療的反應之間存在顯著相關性,化療耐藥患者腫瘤細胞中DNA-PKcs的表達水平顯著高于對化療不耐藥的患者腫瘤細胞中的表達水平。此外,在接受化療的患者中,DNA-PKcs 表達水平高的患者與 DNA-PKcs 表達水平低的患者相比總生存期顯著降低。DNA-PKcs的上調導致放療和化療的抗性,由此,抑制DNA-PKcs可以誘導腫瘤的程序性細胞死亡,并通過抑制DSBs的修復來增強化療和放療的細胞殺傷作用〔20〕。

DNA-PKcs 抑制劑已用于放化療或與其他抗腫瘤劑結合治療腫瘤。多效調節劑 CC-122、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/哺乳動物雷帕酶素靶蛋白(mTOR)/DNA-PK 抑制劑 LY3023414 和 mTOR/DNA-PK 抑制劑 CC-115等多種非特異性 DNA-PKcs 抑制劑已進入臨床試驗。盡管這些抑制劑并不專門針對 DNA-PKcs,但每種抑制劑都會抑制與癌癥相關的激酶。進一步研究發現,靶向 DNA-PKcs 發揮了更有效的抗腫瘤作用。因此,研究者開發出了具有高特異性的 DNA-PKcs 抑制劑,如VX-984、M3814、AZD7648 和 AsiDNA等〔21〕。特異性靶向DNA-PKcs抑制劑為治療癌癥疾病提供了新思路,隨著對DNA-PKcs抑制劑的不斷研究,未來將出現更多新型的抗腫瘤藥物。

綜上,DNA-PKcs在DNA損傷修復過程中有重要作用。DNA-PKcs抑制劑在腫瘤放療和化療方面,除了DNA-PKcs在DNA損傷修復方面的作用,發現其在其他方面的功能可能會是腫瘤治療的新方向。此外,DNA-PKcs上存在很多位點,對于位點的未知功能研究,可能會發現新的DNA-PKcs抑制劑,為腫瘤患者提供更為有效的治療藥物。