鹽酸氨溴索對脂多糖誘導急性肺損傷大鼠肺血管重塑的改善作用及機制

饒習敏 顧延會 劉曉麗 張蘭英 歐陽瑤

(遵義醫科大學附屬醫院呼吸與危重癥學科,貴州 遵義 563000)

急性肺損傷(ALI)是指肺部疾病進展至功能衰退的病理環節〔1〕。在病理性發展中,內毒素能夠促進機體生成大量炎性因子,炎性因子與效應細胞相互作用會導致彌漫性炎性肺泡浸潤及肺血管壁增厚〔2〕。若未及時得到有效治療,極易引發肺組織纖維化、肺衰竭危及生命,但臨床尚未明確ALI的具體發病機制〔3〕。鹽酸氨溴索是常見祛痰藥,在化痰、改善呼吸方面具有良好的臨床效果。據報道〔4〕,鹽酸氨溴索能夠抑制肺組織炎性應激反應,平衡細胞凋亡和增殖,從而減輕肺組織損傷。肺部是革蘭陰性細菌引發的膿毒癥極易損傷的器官,表現為ALI,是導致患者死亡的主要原因。臨床認為ALI病理反應過程中革蘭陰性細菌的脂多糖(LPS)發揮出關鍵作用〔5〕。研究發現〔6〕,LPS誘導ALI后,肺部因炎癥反應會釋放白細胞介素(IL)-4、IL-5、IL-13等多種細胞因子,影響肺動脈平滑肌細胞的增殖、凋亡等生理狀態,而肺動脈平滑肌細胞凋亡是誘發肺血管重塑的基礎。目前鹽酸氨溴索與ALI血管重塑的相關性未見文獻報道。本研究探討鹽酸氨溴索對LPS誘導的ALI大鼠肺血管重塑的改善作用及機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物、試劑和儀器 實驗動物：選取醫院動物實驗中心提供的80只8～10周齡SPF級成年SD大鼠,動物合格證號：SYXK(京)2019-0096,平均體質量(240±200)g,大鼠均于SPF級環境中飼養,飼養環境通風良好,溫度(25±2)℃,濕度40%～60%,大鼠飲食不設限制,熟悉環境1 w后,第2周開始展開實驗流程。大鼠相關操作流程均獲得醫院實驗動物管理倫理委員會批準(批準號：2019-032)。主要試劑：鹽酸氨溴索口服溶液購自上海勃林格殷格翰藥業有限公司,地塞米松(DXMS)購自湖北天藥藥業股份有限公司,LPS、α-平滑肌肌動蛋白(SMA)和血管內皮生長因子(VEGF)、胱天蛋白酶(Caspase)-3、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2相關X蛋白(Bax)和Bcl-2抗體、兔抗磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH) 抗體均購自美國Santa公司,Western印跡試劑盒(美國R&D公司),免疫組化試劑盒、彈力纖維(EVG)染色試劑盒購自江蘇綠葉生物科技有限公司,蛋白濃度測定試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)化學發光試劑盒均購自英國Abcam。主要儀器：冰箱購自海爾公司,臺式低溫高速離心機購自美國Thermo公司,化學發光凝膠成像儀購自北京君意東方電泳公司,LeicaRM2135組織切片機購自德國Leica公司。

1.2構建ALI大鼠模型及分組 大鼠常規喂養7 d后,采用隨機數字法分為正常組、模型組、鹽酸氨溴索處理ALI組(實驗組)、陽性對照藥地塞米松(DXMS)處理組(陽性組)各20只。除正常組外,其余各組尾部靜脈注射5 mg/kg的LPS構建ALI模型,注射劑量0.5 ml,正常組給予等體積的生理鹽水;大鼠模型完成后,每日分別在實驗組和陽性組大鼠皮下注射1 ml、規格為20 mg/kg的鹽酸氨溴索和DXMS,連續給藥28 d,正常組、模型組分別注射與實驗組和陽性組等量的生理鹽水。完成注射后,大鼠自由飲食,不加限制。

1.3檢測各組呼吸功能 給藥結束后次日分別在特定描記箱中的大鼠昏迷和清醒狀態時采用動物肺功能測定儀測定潮氣量、呼吸頻率及每分鐘通氣量,期間需運行IOX軟件。

1.4蘇木素-伊紅(HE)染色觀察各組肺組織病理學改變 全部大鼠測定肺功能結束后,通過頸椎脫臼處死大鼠,解剖取大鼠肺組織,在-80 ℃冰箱中放置90%肺組織待檢測。另外用10%多聚甲醛液固定剩余10%肺組織24 h,石蠟切片,攤、烤完成后展開HE染色,封片后采用光學顯微鏡觀察肺組織病理學變化。

1.5EVG染色檢測各組肺組織肺血管重塑 取出各組部分肺臟組織,固定,石蠟包埋,脫蠟,滅菌常規10 min清洗,EVG染色肺部組織15 min,熒光顯微鏡倒置并輔助Image Pro Plus8.0軟件觀察肺組織肺血管重塑情況。血管中膜厚度占比：每組選取10～15根肺小動脈,直徑均為25～100 μm,分別測定血管內徑和外徑厚度,計算相對中膜厚度(%)=〔(血管外徑-血管內徑)/血管外徑〕×100%〔7〕。

1.6TUNEL染色檢測各組肺動脈平滑肌細胞的凋亡 取部分肺組織,固定完成后,冰凍切片,二甲苯重復清洗2次,梯度酒精反復沖洗5 min,脫水后利用H2O2-甲醇進行10 min浸泡,磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗15 min,后在預冷酒精溶液中緩沖液預處理2 min,PBS沖洗15 min,加入TUNEL反應溶液,避光加封口膜1 h,PBS沖洗,脫水,透明,封片,顯微鏡觀察肺動脈平滑肌細胞凋亡情況,并拍照。正常平滑肌細胞遇TUNEL反應溶液細胞核呈藍色,反之呈棕黃色,用400倍鏡觀察并計算肺動脈凋亡平滑肌細胞百分數。

1.7免疫組化檢測肺組織中α-SMA、VEGF蛋白表達及血管肌化程度 PBS沖洗脫蠟及水化完成后的肺組織切片,利用PBS高壓修復脫蠟、水化完成后的切片組織,然后用3% H2O2室溫下浸泡以阻斷內源性過氧化物酶,封閉后分別加稀釋好的一抗4 ℃過夜孵育,第2天恢復室溫后PBS沖洗,加入稀釋完成的二抗,室溫下30 min孵育,PBS沖洗。加入DAB繼續孵育5 min,加入去離子水中斷孵育,加入蘇木素染色,無菌水充分清洗后,梯度酒精反復沖洗2 h,脫水完成后,去除組織表面液體,透明、封片,利用光學顯微鏡觀察其形態并攝片。依據參考文獻〔8〕方法評估陽性細胞程度,利用10個高倍鏡視野(×200)光學顯微鏡下觀察切片中陽性細胞數,每個視野取200個細胞觀察陽性占比,陽性細胞染色程度評分：未染色為0分,淡黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分。陽性細胞計分：無陽性細胞為0分,1%～10%陽性細胞為1分、11%～50%陽性細胞為2分,51%～75%陽性細胞為3分,>75%陽性細胞為4分。免疫組化染色結果為陽性細胞染色程度評分與陽性細胞計分的乘積。

血管肌化程度：觀察α-SMA免疫組化切片組織,用10個高倍視野觀察切片血管肌化程度,選擇15～50 μm直徑的肺小動脈,肌化判定標準：切片血管壁α-SMA 染色呈陽性,α-SMA染色陽性占比>75%定義為全部肌化,血管全部肌化占比=全部肌化血管數/觀察血管總數×100%〔9〕。

1.8線粒體膜電位變化情況檢測 取肺組織加入組織裂解液后,根據線粒體/胞質制備試劑盒說明書步驟,提取線粒體。根據試劑盒步驟說明加入500 μl線粒體膜電位試劑盒(JC-1)染色工作液,37 ℃下孵育20 min后再用JC-1染色工作液清洗2次,用共聚焦熒光顯微鏡觀察波長對細胞顯色水平的影響,膜電位變化可通過ImageJ軟件重疊紅、綠熒光,以紅、綠色熒光光密度比值得出。

1.9Western印跡檢測各組肺組織中Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達水平 取出各組肺組織,加入裂解液,離心取上清,電泳后,加入一抗(1∶1 500),二抗(1∶1 500)稀釋后,顯色30 min,完成曝光、顯影、定影后,參照GAPDH分析肺組織中Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達水平。應用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析蛋白條帶積分光密度(IOD)值,以靶蛋白與GAPDH 的IOD值比值表示靶蛋白的相對表達水平。

1.10統計學分析 采用SPSS16.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1各組呼吸功能比較 模型組呼吸頻率明顯高于正常組,通氣量和潮氣量明顯低于正常組(P<0.05);實驗組、陽性組呼吸頻率明顯低于模型組,通氣量和潮氣量明顯高于模型組(P<0.05),實驗組和陽性組以上指標差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組呼吸功能比較

2.2各組肺組織病理學觀察 正常組肺組織完整,肺泡腔結構清晰且完整,肺泡健康排列,無水腫、炎性因子分泌、滲出分泌物等現象。模型組氣道及毛細血管周圍存在大量炎性因子浸潤,肺泡壁排隊不規則,管腔狹窄,血管壁不合理增厚。實驗組及陽性組陽性因子浸潤較模型組好轉,肺組織病理癥狀減輕。見圖1。

圖1 各組肺組織病理學(HE染色,×200)

2.3EVG染色觀察各組肺組織血管重塑 正常組肺組織血管結構正常,無異常管壁增厚。模型組肺小動脈中膜厚度增加比例〔(54.92±5.73)%〕高于對照組〔(10.02±1.28)%〕,差異具有統計學意義(t=34.201,P<0.001)。而實驗組〔(23.45±4.85)%〕、陽性組肺小動脈中膜厚度增加比例〔(25.82±5.02)%〕小于模型組,差異具有統計學意義(t=18.748、17.083,均P<0.001)。實驗組和陽性組差異無統計學意義(t=1.518,P=0.137)。見圖2。

圖2 各組肺組織血管重塑(EVG染色,×400)

2.4免疫組化檢測各組肺組織中α-SMA和VEGF蛋白表達 模型組肺組織α-SMA和VEGF蛋白表達及血管肌化程度明顯高于正常組(P<0.05),實驗組、陽性組肺組織α-SMA和VEGF表達及血管肌化程度明顯低于模型組(P<0.05);實驗組和陽性組差異無統計學意義(P>0.05)。見表2、圖3。

表2 各組肺組織中α-SMA、VEGF陽性表達評分和血管肌化程度比較

2.5TUNEL染色檢測各組肺動脈平滑肌細胞的凋亡 模型組肺動脈平滑肌細胞凋亡率〔(48.32±6.79)%〕明顯高于正常組〔(9.85±2.42)%;t=23.867,P<0.001〕,實驗組〔(31.06±7.48)%〕、陽性組肺動脈平滑肌細胞的凋亡率〔(26.54±8.12)%〕明顯低于模型組(t=7.641、9.202,均P<0.001)。實驗組和陽性組差異無統計學意義(t=1.831,P=0.075)。見圖4。

圖4 各組肺動脈平滑肌細胞凋亡(TUNEL染色,×400)

2.6Western印跡檢測各組肺組織中Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達 模型組肺組織Caspase-3、Bax蛋白表達明顯高于正常組,Bcl-2蛋白表達明顯低于正常組(P<0.05);實驗組和陽性組肺組織中Caspase-3、Bax蛋白表達明顯低于模型組,Bcl-2蛋白表達明顯高于模型組(P<0.05);實驗組和陽性組差異無統計意義(P>0.05)。見圖5、表3。

圖5 各組肺組織中Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達

表3 各組肺組織中Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白相對表達量比較

2.7線粒體膜電位變化 正常組中細胞線粒體膜電位〔紅色熒光與綠色熒光比值(28.63±7.45)%〕處于低水平,模型組細胞線粒體膜電位〔(80.05±12.37)%〕較正常組明顯增加(t=15.925,P<0.001),實驗組〔(55.24±10.83)%〕、陽性組線粒體膜電位〔(56.79±15.28)%〕明顯低于模型組(t=6.749、5.291,均P<0.001),實驗組和陽性組差異無統計學意義(t=0.370,P=0.703)。見圖6。

圖6 各組細胞線粒體膜電位比較(JC-1染色,×400)

3 討 論

ALI是臨床常見疾病,其致病因素較多,包括感染、休克、肺挫傷等外界因素引發肺部毛細血管功能損傷,導致大鼠肺小動脈中膜厚度增加、呼吸受限〔10〕。ALI病情復雜,且進展迅速,臨床上救治的關鍵是及時緩解癥狀,若病情不加以控制極易進展為呼吸衰竭,甚至隨時危及患者生命安全,但目前針對ALI尚缺乏有效的救治手段,因此明確ALI的發病機制是臨床危重病學領域亟待解決的問題之一。本研究結果說明模型構建成功,可用于進一步實驗研究。

鹽酸氨溴索作為一種黏液調節劑在臨床上應用多年,已有不少研究證實〔11〕,鹽酸氨溴索可通過抗氧化、減輕炎癥介質促進肺表面活性中磷脂合成等作用發揮對ALI的保護作用。本研究結果與既往研究結果相符。然而與ALI過程有關的機制眾多,研究表明〔12〕,肺血管重塑在ALI的發生、發展中發揮重要作用。本研究結果說明,LPS誘導的ALI大鼠肺血管重塑病癥明顯。研究發現〔13〕,肺血管重塑是呼吸系統中復雜的生理過程,由眾多因素參與,α-SMA和VEGF在這一過程中發揮了重要作用。α-SMA作為肌動蛋白的一種,具有收縮能力并且富含大量微絲的胞內蛋白,可以調控肺血管平滑肌細胞的表型轉換〔14〕,α-SMA表達量可以有效反映ALI肺部纖維化程度〔15〕。據報道〔16〕,作為血管內皮細胞生長的促進因子,VEGF可表達于肺平滑肌細胞,并參與多條信號通路信號傳導,是平滑肌細胞增殖、遷移的重要參與者,也是ALI大鼠肺動脈發生重塑的關鍵。本研究結果說明,鹽酸氨溴索對ALI大鼠肺部的保護作用可能與改善肺部血管重塑狀態有關。

研究表明〔17〕,細胞凋亡與肺細胞血管重塑緊密相關,激活凋亡基因能夠促進平滑肌細胞凋亡進而排出體外,細胞增殖有利于修復受損的肺組織,實現細胞增殖和凋亡的平衡,從而保障血管壁細胞健康。而一旦細胞凋亡與增殖的平衡被破壞,肺血管細胞大量增殖且細胞凋亡速率減弱,會導致細胞大量累積,進而出現血管重塑。本研究結果說明,肺動脈平滑肌細胞與血管重塑相關。細胞凋亡的內源性途徑均由線粒體介導,也稱凋亡途徑是線粒體路徑。有研究指出〔18〕,ALI大鼠肺組織細胞線粒體膜電位異常改變。Bax作為的促凋亡程序的主要參與者,可通過競爭性抑制抗凋亡蛋白活性,從而破壞線粒體路徑〔19〕,基質長期處于高滲透狀態下會導致線粒體膜損傷進而破裂,此階段細胞質中會有大量的促凋亡蛋白,而Caspase蛋白酶家族會其發生酶解級聯反應,而隨著Caspase蛋白酶的激活會導致DNA受損,進而導致細胞凋亡。而作為抗凋亡蛋白的Bcl-2能夠與線粒體膜上的結合蛋白發生聯級反應,避免細胞膜受損。相關研究顯示,釋放調控Bcl-2/Bax信號,能夠限制細胞凋亡,緩解ALI大鼠模型的血管重塑〔20〕。本研究結果說明,調控線粒體途徑的相關蛋白表達水平可受鹽酸氨溴索調控,從而降低肺動脈平滑肌細胞凋亡,進而改善肺血管重塑狀態,發揮對ALI大鼠肺部的保護作用。

綜上,肺平滑肌細胞可通過鹽酸氨溴索降低凋亡率并對其血管重塑有改善作用,進而減少ALI肺組織損傷。但鹽酸氨溴索在臨床的實際應用效果,仍需深入研究。