REST/TUBB3軸對(duì)卵巢癌紫杉醇化療耐藥性的影響及作用機(jī)制

余婷玉 方珊珊 朱言亮 劉波 李泉

(襄陽市中心醫(yī)院(湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院) 1中心實(shí)驗(yàn)室,湖北 襄陽 441021;2腫瘤科)

卵巢癌作為婦科惡性腫瘤之一,發(fā)病率及致死率高,通常被發(fā)現(xiàn)時(shí)已為晚期。近年來藥物發(fā)展使70%～80%晚期卵巢癌患者的病情得到有效緩解,然而仍有大部分患者復(fù)發(fā)〔1～3〕。化療耐藥是限制眾多癌癥治療的一大關(guān)鍵。因此,研究卵巢癌化療耐藥對(duì)進(jìn)一步的治療至關(guān)重要。

微管蛋白作為紫杉醇靶向的主要蛋白與卵巢癌紫杉醇化療耐藥有著緊密聯(lián)系〔4,5〕。目前研究發(fā)現(xiàn),微管蛋白β(TUBB)3在肺癌、結(jié)腸癌等腫瘤組織中的表達(dá)量異常升高與紫杉醇耐藥及較差的預(yù)后相關(guān)〔6,7〕,可能是高表達(dá)的微管蛋白增加微管的動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定性,也可能是不同亞型微管蛋白對(duì)紫杉醇的敏感差異性所致〔8〕。許多研究目前停留在闡述TUBB3表達(dá)與紫杉醇耐藥的表觀現(xiàn)象,然而對(duì)于TUBB3在腫瘤異常高表達(dá)的原因沒有進(jìn)一步的探索,有研究分析可能與DNA甲基化及組蛋白乙酰化修飾有聯(lián)系。RE1沉默轉(zhuǎn)錄因子(REST)作為去乙酰化修飾酶通過對(duì)神經(jīng)性基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控在各種惡性腫瘤進(jìn)程中發(fā)揮作用〔9～11〕。REST與某些基因的神經(jīng)元限制性沉默元件結(jié)合去乙酰化組蛋白,隨后基因啟動(dòng)子區(qū)域不能和轉(zhuǎn)錄因子或RNA聚合酶結(jié)合。目前已知有100多種含RE-1序列,并且受REST調(diào)控,其中包括TUBB3。本研究探探REST/TUBB3軸對(duì)卵巢癌紫杉醇化療耐藥性的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系及試劑 人卵巢腺癌細(xì)胞SKOV3及SKOV3/tax(中國科學(xué)院腫瘤研究所);OVCAR3和OVCAR3/tax(中科院上海細(xì)胞庫)。胰酶購自生工生物工程(上海)股份有限公司,胎牛血清購自Hyclone公司,總RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑、定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)試劑均購自湖南艾科瑞生物工程有限公司,qPCR引物由金唯智公司合成。4-苯基丁酸(PBA)、紫杉醇購自Medchemexpress公司,CCK8試劑盒購自Biosharp公司,細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自BD公司,染色質(zhì)免疫沉淀試劑盒購自Millipore公司,si-scramble-5FAM、si-REST-5FAM由吉?jiǎng)P生物科技有限公司負(fù)責(zé)合成,pd1-EGFP-N1-Control、pd1-EGFP-N1-REST由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建,Lipofectamine2000購自日本TaKaRa 公司,GAPDH、TUBB3、REST抗體均購自Abcam公司。羊抗鼠IgG二抗和羊抗兔IgG二抗均購自CST公司,acetyl-histone-H3、acetyl-histone-H4、組蛋白去乙酰化酶(HDAC)1購自Biotech公司,電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購自美國Millipore公司。

1.2腫瘤組織來源 收集2019年6月至2021年6月于襄陽市中心醫(yī)院(湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院)接受手術(shù)治療的 40 例卵巢癌患者(紫杉醇敏感及耐藥各20例),手術(shù)中切除腫瘤組織后立即冷凍保存于液氮中。臨床標(biāo)本經(jīng)襄陽市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過,患者均知情同意。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞傳代生長24 h后,胰酶消化、計(jì)數(shù),貼壁培養(yǎng)24 h。使用Lipofectamine2000試劑分別轉(zhuǎn)染pd1-EGFP-N1-Control、pd1-EGFP-N1-REST、si-scramble-5FAM、si-REST-5FAM等至靶細(xì)胞。

1.4目的基因表達(dá)檢測(cè) Trizol法提取各組RNA,Nanodrop3000測(cè)定RNA的濃度,選取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,構(gòu)建 qPCR體系(20 μl)：2 μl稀釋后的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10 μl SYBR Green Mix、上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μl、7.2 μl ddH2O。預(yù)變性95 ℃、5 min,94℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸 1 min,40個(gè)循環(huán)。通過2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因表達(dá)量。選取GAPDH為內(nèi)參對(duì)照基因,基因引物序列為：REST：正向TGATTACCTGGTCGGCAA,反向GACAATCATTGTCAACAGAAG;TUBB3：正向AATCCCATCACCATCTTCCAG,反向CCAGCATCGCCCCA CTTGA;GAPDH ：正向ACATCGCTCAGACACCATG,反向：TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.5Western印跡 收集目標(biāo)組別細(xì)胞,預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次,胰酶消化2 min,800 r/min離心4 min,棄上清,PBS洗滌2次。加入全細(xì)胞裂解液于冰上裂解10 min。4 ℃,12 000 r/min離心10 min收集上清即為總蛋白。每組樣品取30 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行目的蛋白轉(zhuǎn)印,脫脂奶粉室溫封閉2 h,對(duì)應(yīng)一抗過夜孵育;次日,PBST洗滌3次,二抗室溫孵育2 h;3次洗滌后進(jìn)行顯影成像。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和周期 將對(duì)數(shù)生長期的各組細(xì)胞以10 000個(gè)/孔接種于24孔板,培養(yǎng)24 h后,分別以0.0、0.1、1.0、10.0、100.0 μg/L濃度的紫杉醇到各組細(xì)胞。紫杉醇處理24 h,收集并 800 r/min離心5 min,200 μl 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,加入4 μl膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)孵育15 min,加入4 μl碘化丙啶(PI)混勻避光孵育5 min,立即上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。單染管PI和Annexin Ⅴ-FITC調(diào)節(jié)補(bǔ)償。細(xì)胞周期檢測(cè)需預(yù)冷的70%乙醇固定過夜,次日PBS洗滌2次,加入4 μl PI混勻避光孵育10 min,隨后上機(jī)檢測(cè)。

1.7CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè) 嚴(yán)格參照CCK-8實(shí)驗(yàn)手冊(cè)將適量細(xì)胞接種于96孔板中。分別以0.0、0.1、1.0、10.0、100.0 μg/L濃度的紫杉醇到各組細(xì)胞,設(shè)置6個(gè)平行孔作為重復(fù)。在細(xì)胞分別培養(yǎng)24 h時(shí),每孔加入CCK-8溶液10 μl,置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2 h,讀取450 nm波長處吸光度。

1.8ChIP-qPCR分析 嚴(yán)格參照實(shí)驗(yàn)手冊(cè)進(jìn)行操作。隨后將染色質(zhì)免疫沉淀得到的樣品進(jìn)行qPCR分析,引物序列(5′-3′)如下：TUBB3正向GCACCAAGGACAGCGCC,反向GCAACAAGAGCCAAACT CCATC;GAPDH正向CTAGTGTCCTGCTGCCCAC,反向AGGTCTTGAGGCCTGAGCTAC,采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量ChIP DNAs。

1.9免疫組化檢測(cè)TUBB3和RSET表達(dá) 紫杉醇化療敏感和化療耐藥卵巢癌患者腫瘤組織用固定劑(甲醇∶丙醇=1∶1)固定,切片和復(fù)水后用0.3%Triton X-100孵育。用anti-TUBB3和anti-REST抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件行非配對(duì)t檢驗(yàn)、方差分析,使用GraphPad8.0軟件繪制圖表。

2 結(jié) 果

2.1REST及TUBB3在紫杉醇化療敏感/耐藥卵巢癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá) 與紫杉醇化療敏感卵巢癌組織中REST、TUBB3表達(dá)(1.06±0.098、1.21±0.16)相比,紫杉醇化療耐藥卵巢癌組織中REST表達(dá)顯著降低(0.32±0.095;t=9.320,P=0.001),TUBB3表達(dá)顯著升高(2.13±0.190;t=-6.500,P=0.003)。Western印跡結(jié)果顯示,相較于SKOV3和OVCAR3細(xì)胞,REST蛋白在其紫杉醇耐藥細(xì)胞系SKOV3/tax、OVCAR3/tax中明顯低表達(dá),而SKOV3/tax、OVCAR3/tax中TUBB3蛋白表達(dá)明顯高于SKOV3和OVCAR3細(xì)胞(P<0.05)。qPCR結(jié)果顯示,在卵巢癌組織中,REST和TUBB3 mRNA表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.394 2,P=0.0061)。見表1、圖1、圖2、圖3。

圖1 REST及TUBB3在紫杉醇化療敏感及耐藥卵巢癌組織中的表達(dá)(免疫組化染色,×200)

圖2 Western印跡檢測(cè)紫杉醇化療敏感及耐藥卵巢癌細(xì)胞系中REST、TUBB3蛋白表達(dá)

圖3 REST及TUBB3 mRNA表達(dá)相關(guān)性

表1 不同細(xì)胞和細(xì)胞系TUBB3、REST蛋白表達(dá)及不同濃度紫杉醇對(duì)卵巢癌耐藥細(xì)胞凋亡的影響

2.2不同濃度紫杉醇對(duì)卵巢癌耐藥細(xì)胞周期及REST、TUBB3蛋白表達(dá)的影響 細(xì)胞周期結(jié)果顯示,隨著紫杉醇濃度增加,SKOV3細(xì)胞及耐藥細(xì)胞系SKOV3/tax周期阻滯在G2期的比例逐漸明顯增高,且耐藥細(xì)胞系SKOV3/tax從0.1 μg/L后,G2期比例顯著低于SKOV3細(xì)胞(P<0.05)。同時(shí)OVCAR3、耐藥細(xì)胞系OVCAR3/tax細(xì)胞G2期比例也逐漸明顯增高,且耐藥細(xì)胞系OVCAR3/tax從0.1 μg/L紫杉醇后,G2期比例顯著低于OVCAR3細(xì)胞(P<0.05)。Western印跡結(jié)果顯示,隨著紫杉醇濃度遞增,SKOV3和OVCAR3中REST蛋白表達(dá)逐漸明顯減少,TUBB3表達(dá)逐漸明顯增加,且呈明顯劑量依賴性(均P<0.05)。見圖4、表2、表3。

表2 不同濃度紫杉醇對(duì)卵巢癌耐藥細(xì)胞G2期阻滯影響

表3 不同濃度紫杉醇對(duì)卵巢癌耐藥細(xì)胞REST、TUBB3蛋白表達(dá)的影響

2.3不同濃度紫杉醇對(duì)卵巢癌耐藥細(xì)胞凋亡的影響 隨著紫杉醇濃度升高,SKOV3細(xì)胞SKOV3/tax細(xì)胞系凋亡率逐漸明顯增高,而耐藥細(xì)胞系SKOV3/tax從0.1 μg/L起,凋亡率顯著低于SKOV3細(xì)胞(P<0.05);OVCAR3細(xì)胞及耐藥細(xì)胞系OVCAR3/tax凋亡率也逐漸明顯升高,且耐藥細(xì)胞系OVCAR3/tax從0.1 μg/L起,凋亡率顯著低于OVCAR3細(xì)胞(P<0.05)。見表1、圖5。

2.4過表達(dá)REST增加卵巢癌耐藥細(xì)胞化療敏感性 CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同濃度紫杉醇作用于卵巢癌耐藥細(xì)胞系SKOV3/tax時(shí),從0.1 μg/L起,相較于REST過表達(dá)對(duì)照(OE-NC)組,REST過表達(dá)(OE-REST)組細(xì)胞活力水平顯著降低(P<0.05)。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,OE-REST組SKOV3/tax細(xì)胞凋亡率顯著高于OE-NC組(P<0.05)。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示,在SKOV3/tax細(xì)胞中過表達(dá)REST,G2期細(xì)胞比例顯著提高(P<0.05)。見表4。

表4 過表達(dá)REST對(duì)SKOV3/tax細(xì)胞增殖、凋亡和周期影響

2.5REST通過組蛋白乙酰化修飾調(diào)控TUBB3的表達(dá) 相較于REST敲低對(duì)照(Si-NC)組,REST敲低(si-REST)組SKOV3和OVCAR3細(xì)胞中TUBB3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05),而OE-REST組SKOV3和OVCAR3細(xì)胞中TUBB3蛋白表達(dá)顯著低于OE-NC組(P<0.05)。見圖6、表5。當(dāng)使用3 μmol/L PBA(PBA組)處理SKOV3和OVCAR3細(xì)胞24 h后,TUBB3基因及蛋白水平與未處理(NC)組比較均顯著升高(P<0.05)。見表6、圖7。ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相較于si-NC組,si-REST組SKOV3細(xì)胞中TUBB3基因第2個(gè)甲基化位點(diǎn)富集到的H3-ac、H4-ac顯著增多,而HADC1顯著減少(P<0.05)。見表7。表明敲低REST或用PBA處理,可增強(qiáng)SKOV3和OVCAR3細(xì)胞中TUBB3 mRNA及蛋白表達(dá);過表達(dá)REST可抑制SKOV3和OVCAR3細(xì)胞中TUBB3 mRNA及蛋白表達(dá),敲低REST可使TUBB3基因上游調(diào)控序列結(jié)合更多的H3-ac、H4-ac從而促進(jìn)TUBB3基因轉(zhuǎn)錄。

1～4：si-NC組、si-REST組、OE-NC組、OE-REST組圖6 Western印跡檢測(cè)各組SKOV3和OVCAR3中REST及TUBB3蛋白表達(dá)

圖7 Western印跡檢測(cè)兩組SKOV3和OVCAR3細(xì)胞中TUBB3蛋白表達(dá)

表5 各組SKOV3和OVCAR3細(xì)胞中REST及TUBB3蛋白表達(dá)

表6 PBA處理SKOV3、OVCAR3細(xì)胞后對(duì)TUBB3 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)的影響

表7 SKOV3細(xì)胞中TUBB3甲基化位點(diǎn)富集指數(shù)

3 討 論

TUBB3 在成熟神經(jīng)元中高度表達(dá),通常用作神經(jīng)元分化的可靠標(biāo)志物〔7〕,在非神經(jīng)細(xì)胞很少表達(dá),但在幾種非神經(jīng)元腫瘤,如乳腺癌和肺癌中TUBB3異常高表達(dá)〔6,9,12〕。Dumontet等〔13〕發(fā)現(xiàn),僅有22%的高表達(dá)TUBB3非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)化療敏感,然而低水平表達(dá)組患者敏感率高達(dá)60%。此外,在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌中TUBB3表達(dá)升高與紫杉醇耐藥亦有緊密聯(lián)系〔7,12,13〕。本研究結(jié)果表明,TUBB3高表達(dá)在促進(jìn)卵巢癌紫杉醇化療耐藥過程中發(fā)揮重要作用。但這些非神經(jīng)細(xì)胞中TUBB3異常高表達(dá)的原因卻不清楚,這一始動(dòng)因素是解決紫杉醇耐藥性的關(guān)鍵所在。越來越多研究表明〔14～16〕,表觀遺傳修飾的改變是腫瘤組織中基因失調(diào)的重要因素,其中DNA去甲基化、組蛋白乙酰化等修飾參與多種基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。TUBB3基因含有RE-1序列、受REST作用,提示在TUBB3異常升高介導(dǎo)的卵巢癌紫杉醇化療耐藥可能和REST有關(guān)聯(lián)。組蛋白去乙酰化修飾蛋白R(shí)EST通過神經(jīng)性基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控在成神經(jīng)管細(xì)胞瘤中發(fā)揮促癌作用,在結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌中作為腫瘤抑制因子〔17〕。本研究結(jié)果表明,REST在卵巢癌中可能作為腫瘤抑制因子調(diào)控紫杉醇化療敏感性。進(jìn)一步研究表明,在不濃度紫杉醇作用下,SKOV3/tax耐藥細(xì)胞系顯示出比SKOV3和OVCAR3細(xì)胞更強(qiáng)的細(xì)胞凋亡抗性,G2期細(xì)胞比例顯著降低,提示REST在紫杉醇耐藥中的作用。

腫瘤化療耐藥性產(chǎn)生的原因多種多樣,包括腫瘤補(bǔ)償性信號(hào)通路的建立、靶蛋白的變化、腫瘤微環(huán)境的變化、腫瘤異質(zhì)性和腫瘤對(duì)靶向藥物的適應(yīng),多種耐藥機(jī)制的共同作用促進(jìn)了靶向耐藥性的發(fā)展〔18〕。越來越多的研究將表觀遺傳修飾變化與化療耐藥聯(lián)系起來,如有研究〔19〕揭示組蛋白去乙酰化酶 SIRT6在BRAFV600 突變體黑色素瘤對(duì)靶向絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)抑制劑(MAPKi) 耐藥中的作用;有研究〔20〕發(fā)現(xiàn),Zip介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞他莫昔芬耐藥的功能與其調(diào)控STAT3磷酸化的水平有關(guān)。本研究提示,REST通過組蛋白乙酰化修飾調(diào)控TUBB3表達(dá)。

綜上,REST在卵巢癌紫杉醇耐藥組織及細(xì)胞系中異常低表達(dá),TUBB3在卵巢癌紫杉醇耐藥組織及細(xì)胞系中異常高表達(dá),兩者mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性,REST通過組蛋白乙酰化修飾調(diào)控TUBB3的異常高表達(dá)進(jìn)而參與卵巢癌紫杉醇化療耐藥過程。