miR-137通過靶向MCL1和谷氨酰胺轉運SLC1A5調節肺癌細胞的鐵死亡機制

曹西迎 謝春發 吳志誠 章祖雄 鐘煒祥 黃明登

(贛南醫學院第一附屬醫院心胸外科,江西 贛州 341000)

非小細胞肺癌(NSCLC)是人類常見的惡性腫瘤,占所有肺癌病例的80%～85%〔1〕。由于其復雜的發病機制和不清楚的分子機制,目前對NSCLC的治療受到很大限制。解決此問題的方法是闡明NSCLC進展的潛在機制。鐵死亡是一種新發現的非凋亡性細胞死亡方式,涉及代謝功能異常,導致細胞內代謝過程谷氨酰胺分解及產生鐵依賴性活性氧(ROS)、鐵載體蛋白轉鐵蛋白和線粒體超氧化物(MitoSOX)及膜電位減少并形成其他相關的調控因子,鐵和鐵衍生物在ROS酶的產生過程中發揮重要作用,表明鐵可能充當細胞死亡信號的觸發或介體,特別是在鐵死亡中,含鐵酶對于鐵死亡必不可少〔2～4〕。據報道,miR-137在多種癌癥的發展中起抑癌作用,包括胰腺癌、大腸癌和NSCLC〔5〕。值得注意的是,miR-137通過靶向類固醇受體共激活子(SRC)3減慢人類NSCLC的細胞增殖,并通過下調骨形態發生蛋白7抑制NSCLC細胞遷移〔6〕。谷氨酰胺轉運蛋白溶質載體家族A1成員(SLC1A)5對于L-谷氨酰胺的轉運和代謝至關重要,L-谷氨酰胺對癌細胞的生長至關重要,研究人員證實SLC1A5通過促進谷氨酰胺代謝來促進癌癥的發展〔7〕。SLC1A5參與了NSCLC進程的調控,而SLC1A5的失活則通過減少L-谷氨酰胺的消耗而抑制了NSCLC細胞的活力〔8〕。此外,SLC1A5的上調促進了甲狀腺乳頭狀癌的細胞遷移和侵襲〔9〕,且SLC1A5可以被多種miRNA抑制。具體而言,SLC1A5被證明是miR-137的下游靶標,并參與黑色素瘤中腫瘤細胞死亡的調控〔10〕。髓系白血病1蛋白(MCL1)是主要的抗凋亡B細胞淋巴瘤(Bcl)-2蛋白,半衰期非常短,其在各種人類癌癥中的過表達表明,MCL1表達的增加有助于癌變,并導致細胞凋亡的抑制〔11〕。有研究證明MCL1是miRNA作用的直接靶標,并在癌癥的發展中有促進作用〔12〕。上述文獻顯示,miR-137可能通過依賴性的方式調節NSCLC細胞中SLC1A5和MCL1的水平,參與細胞鐵死亡,但是其詳細機制未知。本研究探討miR-137通過靶向MCL1和谷氨酰胺轉運體SLC1A5調節肺癌細胞的鐵死亡機制。

1 材料和方法

1.1細胞培養 NSCLC細胞系A549從美國典型培養物保藏中心(ATCC,USA)獲得。在RPMI1640培養基(HyClone,UT)中培養以上細胞,并在標準培養條件(5%CO2,37 ℃)下孵育。所有培養基補充10%胎牛血清(FBS)。

1.2siRNA、miRNA模擬物和質粒轉染 培養細胞以進行載體轉染,直至細胞融合度達到70%～80%。由Sangon Biotech(中國上海)設計和合成miR-NC,miR-137模擬物(5′-GGATCAAGATTGCAT-3′;5′-UUACAUGCGAUUACGUACAAUUGA-3′)和miR-137的小干擾RNA(siRNA),以敲除miR-137,用于構建載體的siRNA序列如下：正義(5′-GGATCAAGATTGAAGCAT-3′)和反義(5′-UUACAUGCGAUUACG UACAAUUGA-3′)。使用LipofectamineTM2000轉染試劑(10 nmol/L)遞送至A549細胞。轉染后48 h,準備細胞用于分析。

1.3實驗分組 根據實驗要求,將細胞分為對照組(肺癌細胞系A549規培條件下培養,用于對照實驗)、miR-137轉染組(構建miR-137轉染的A549細胞)、miR-137沉默組(構建miR-137小干擾RNA質粒轉染A549)。

1.4實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR) 將質粒轉染的和未處理的對照細胞(1×104細胞/樣品)接種到96孔板中。為了研究MCL1和SLC1A5、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)4 mRNA表達水平的變化,根據生產商的規程,使用TaqMan?基因表達細胞-CTTM試劑盒進行RT-qPCR。條件：37 ℃孵育60 min,95 ℃孵育5 min。RT-qPCR使用Applied Biosystems7500快速實時PCR系統進行。使用TaqMan基因表達預混液和以下TaqMan基因表達測定法(探針和引物)擴增靶mRNA。RT-qPCR熱循環條件如下：在50 ℃下初始變性2 min,在95 ℃下變性10 min,在95 ℃下進行40次循環變性15 s,在60 ℃下進行1 min變性。使用2-ΔΔCt方法計算靶mRNA表達水平。

1.5雙熒光素酶報告基因系統 使用在線StarBase軟件預測SLC1A5 mRNA的miR-137,MCL1和3′非翻譯區(UTR)區域的結合位點。分別對MCL1和SLC1A5 mRNA的一種特異性結合序列進行突變。Sangon Biotech(中國上海)將野生型(Wt)和突變體(Mut)MCL1和SLC1A5 mRNA克隆到pmiRGLO表達載體中。使用LipofectamineTM2000轉染試劑,按照制造商的規程,將上述miR-NC(5 nmol/L)和miR-137模擬物(5 nmol/L)與上述載體(5 nmol/L)共轉染到A549細胞中。24 h后,通過雙重熒光素酶報道基因系統確定細胞中的相對熒光素酶活性。

1.6鐵測定 使用鐵測定試劑盒測量每個細胞系中的Fe2+。首先,將2×106的細胞在4～10體積的鐵測定緩沖液中快速勻漿。將樣品在4 ℃于5 000 r/min離心10 min,以除去不溶物。為了測量二價鐵,向每個孔中加入5 μl鐵測定緩沖液。在一組孔中將5 μl的測定緩沖液添加到樣品中,在另一組孔中添加5 μl的鐵還原劑。使用水平搖床或通過移液器將樣品充分混合,并將反應在室溫黑暗條件下孵育30 min。將100 μl鐵探針添加到每個裝有標準品或測試樣品的孔中。使用臥式搖床或移液器將樣品充分混合,將反應在室溫黑暗條件下孵育60 min。最后在593 nm(A593)處測量吸光度。

1.7線粒體膜電位測量 為了使用線粒體膜電位試劑盒MAK-159測量線粒體膜電位,將5×104細胞接種在90 μl的黑色96孔板中,該板在無酚紅的培養基中具有清晰的堿基,并在第二天進行處理加入二甲基亞砜(DMSO)或10 μmol/L的蛋白。孵育48 min后,將50 μl緩沖液A(1/100)中的JC-10染料添加到細胞中,并孵育60 min,添加50 μl緩沖液B。在微板讀取器上讀取板。監測熒光強度水平(λex= 490/λem= 525 nm)和(λex=540/λem=590 nm)以進行比率分析。紅色/綠色熒光強度的比率用于確定線粒體膜電位。

1.8MitoSOX的測量 使用用于活細胞成像的MitoSOXTMRed指示劑(專門設計用于MitoSOX的熒光探針)測量了細胞中MitoSOX的產生。將50 μg的MitoSOX指示劑溶解在13 μl的DMSO中,形成5 μmol/L的MitoSOX試劑儲備液。在Hank的鹽緩沖液/鈣(Ca)/鎂(Mg)緩沖液中稀釋5 μmol/L MitoSOX試劑原液,制成5 μm MitoSOX試劑工作液。應用2.0 μml的5 μmol/L MitoSOX試劑工作溶液,以覆蓋黏附在蓋玻片上的細胞。將細胞在黑暗條件下于37 ℃孵育30 min。將細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕漂洗3次。細胞熒光在倒置熒光顯微鏡下以510/580 nm的激發/發射值進行檢查。用ImageJ軟件定量熒光強度。結果表示為相對于對照標準化的相對熒光強度水平。

1.9脂質過氧化評估 根據熒光定量酶標儀,使用熒光讀板儀和6-羧基-2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯染料檢測細胞內ROS水平。根據制造商的規程,使用丙二醛(MDA)檢測試劑盒(南京建城生物工程研究所,南京)來檢測脂質過氧化水平。使用氧化型谷胱甘肽(GSSG)/還原型谷胱甘肽(GSH)定量試劑盒確定SFN(20 μmol/L)處理96 h和未處理的細胞(5×106細胞/樣品)中的總GSH水平。使用Multiskan GO微板分光光度計在405 nm處測量每個樣品的吸光度。使用GraphPad Prism軟件從校準曲線獲得GSH濃度。總共進行3個獨立的重復。

1.10流式細胞儀分析細胞凋亡 將細胞以1×105細胞/孔的密度在37 ℃下接種到24孔板中96 h。根據制造商的說明,使用用于哺乳動物細胞分析的LIVE/DEADTM活力/細胞毒性試劑盒測量細胞毒性。鈣黃綠素-AM保留在活細胞中,產生綠色熒光,而乙二胺均二聚體(EthD)-1進入具有受損膜的死細胞并與核酸結合,產生紅色熒光。根據初步實驗,使用濃度為50 μmol/L鈣黃綠素-AM和4 μmol/L EthD-1溶液(數據未顯示)。使用流式細胞儀和Kaluza軟件進行分析。

1.11Transwell測定NSCLC細胞侵襲能力 為了進行遷移測定,將5×105細胞接種到Transwell培養板(Corning,中國上海)的上腔室中。將添加了15%FBS的培養基放入下腔室。為了進行侵襲測定,用基質膠(目錄號356234,康寧)溶液包被Transwell室。將約5×105細胞(200 μl)接種到板的上腔室中,并將含15%FBS(600 μl)的培養基放入下腔室中。分別孵育24或48 h以進行遷移或侵襲試驗后,將滲透到膜下表面的細胞用4%多聚甲醛固定60 min,用結晶紫染色80 min并計數。

1.12TUNEL測定相關載體轉染的NSCLC凋亡細胞 用試劑盒提供的二氨基聯苯胺(DAB)反應混合物對細胞進行染色。核DNA用4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。用光學顯微鏡觀察TUNEL陽性細胞以評估細胞凋亡。通過使用ImageJ軟件定量NSCLC細胞的凋亡率。

1.13統計學分析 采用GraphPad Prism軟件進行配對或不配對的學生t檢驗或Mann-WhitneyU檢驗及單向或雙向方差分析,采用Tukey的事后多重比較法。

2 結 果

2.1miR-137調控MCL1、SLC1A5和GPX4的mRNA表達 RT-qPCR結果顯示,miR-137沉默組較miR-137轉染組和對照組MCL1、GPX4和SLC1A5 mRNA表達顯著升高(P<0.05),miR-137轉染組較對照組上述指標表達顯著降低(P<0.05),表明MCL1、SLC1A5和GPX4表達受到miR-137調控。見圖1、表1。

表1 各組MCL1、SLC1A5和GPX4的mRNA表達

圖1 各組MCL1、SLC1A5和GPX4 mRNA表達

2.2雙重熒光素酶測定 雙重熒光素酶報告結果顯示,與對照組相比,miR-137轉染組顯著降低了Wt-SLC1A5和Wt-MCL1載體共轉染的NSCLC細胞中的熒光素酶活性(P<0.05),而Mut-SLC1A5和Mut-MCL1模擬共轉染熒光素酶活性酶未發生顯著變化(P>0.05),說明miR-137靶向調控MCL1和SLC1A。見表2。

表2 熒光素酶測定miR-137與MCL1和SLC1A的靶向作用

2.3miR-137過表達促進細胞鐵死亡 miR-137沉默組較miR-137轉染組和對照組Fe2+濃度、MitoSOX濃度顯著降低,線粒體相對膜電位顯著升高(P<0.05);miR-137轉染組較對照組Fe2+濃度、MitoSOX濃度顯著升高,線粒體相對膜電位顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組細胞鐵吸收、線粒體功能評估及脂質氧化反應水平檢測

2.4miR-137對細胞鐵下垂的調控 miR-137沉默組較miR-137轉染組和對照組ROS和MDA濃度顯著降低,GSH濃度顯著升高(P<0.05);miR-137轉染組較對照組ROS和MDA濃度顯著升高,GSH濃度顯著降低(P<0.05)。說明miR-137參與細胞的鐵誘導死亡程序。見表3。

2.5細胞遷移、侵襲能力檢測 Transwell結果顯示,miR-137沉默組較miR-137轉染組和對照組細胞遷移、侵襲數量顯著增多(P<0.05),miR-137轉染組較對照組細胞遷移、侵襲數量顯著減少(P<0.05)。見圖2、表4。

表4 各組細胞凋亡率、遷移及侵襲數量比較

圖2 各組細胞遷移、侵襲(結晶紫染色,×200)

2.6細胞凋亡分析 流式細胞儀檢測細胞凋亡,24、48和72 h檢測發現miR-137轉染組較miR-137沉默組和對照組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05),72 h時miR-137沉默組較對照組細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表4、圖3。

圖3 TUNEL分析各組細胞凋亡水平(DAPI染色,×200)

3 討 論

近年來,科學家們意識到除凋亡外的細胞死亡可用于消除癌細胞。進一步研究確定了其中的一些死亡,例如燒傷、程序性壞死和鐵死亡。科學家們揭示了鐵減少癥的參與消除了對抗癌藥物具有抗性的癌細胞,盡管其具體機制尚不清楚。其他研究發現,某些傳統藥物可能以自噬依賴性方式觸發膠質母細胞瘤的細胞死亡,這表明鐵死亡可以作為一種有效的方法治療癌癥〔13〕。由于鐵死亡的功能主要取決于ROS,而ROS受多種因素調節,例如鐵水平、還原型GSH水平和脂質過氧化水平〔14〕。鐵死亡是一種最近定義的調節型細胞死亡類型,在形態學、遺傳學和生物化學方面不同于其他類型的細胞死亡。在正常細胞和癌細胞之間的各種差異中,癌細胞的一個顯著特征是即使在存在氧氣的情況下也切換到厭氧代謝,這被稱為Warburg效應〔15〕。在各種癌癥中的觀察表明,隨著三羧酸循環(新陳代謝中的關鍵氧化循環)的顯著變化,細胞的新陳代謝也發生了變化。鐵是一種至關重要的金屬元素,對于細胞復制、新陳代謝和生長是必不可少的。其中脂質過氧化作用是由游離細胞內鐵引發的以碳和氧為中心的自由基介導的〔16〕。亞鐵在與過氧化氫的反應中提供電子,產生羥基自由基,一種ROS。這種反應不僅會損害脂質和蛋白質,還會對DNA造成氧化損害。線粒體是重要的細胞器,參與能量代謝、細胞信號傳導和細胞死亡途徑調控,包括鐵死亡。此外,線粒體的凝縮、線粒體內質網的減少和線粒體尺寸的減少在形態學上被描繪成鐵死亡。導致肥大細胞死亡的兩個主要因素是游離鐵增加和脂質過氧化物積累〔17〕。雌鐵蛋白誘導的鐵蓄積可通過鐵螯合、抗氧化劑或細胞鐵攝取的遺傳抑制來避免,其可促進ROS的產生,從而導致脂質過氧化和隨后的死亡。本研究結果說明,線粒體參與了miR-137/SLC1A5/MCL1軸對細胞鐵死亡的調控。

miR-137可以作為抑制NSCLC發生的腫瘤抑制因子〔18〕,這一點在本研究中也得到了證實。在細胞系A549中觀察到低表達的miR-137,而miR-137過表達抑制了NSCLC細胞的活力和遷移,并促進細胞凋亡,而miR-137的下調促進了NSCLC細胞的活力和遷移,這暗示miR-137的上調會阻礙NSCLC在體外的發育〔18〕。一致地,這項研究證實了miR-137負調控MCL1和SLC1A5,本研究證明了miR-137通過下調MCL1和SLC1A5來調節NSCLC細胞功能。從機制上講,上調miR-137對促進NSCLC細胞鐵死亡和侵襲的抑制作用均可以通過敲低miR-137而逆轉,表明miR-137通過下調MCL1和SLC1A5抑制了NSCLC中的惡性表型。鐵死亡是由細胞GSH依賴的抗氧化劑防御系統失活觸發的,導致鐵依賴的有毒脂質ROS的積累。鐵死亡是鐵依賴性的非凋亡調控形式的細胞死亡,可被鐵螯合劑DFO抑制。但是,肥大癥在SCLC細胞中的作用尚不清楚。本研究結果表明,MCL1和SLC1A5參與了SCLC細胞的鐵死亡。

SLC1A5和MCL1參與了癌癥進展的調控,其調控癌細胞的生長和遷移率〔19〕。值得注意的是,先前的數據表明SLC1A5可以促進NSCLC細胞增殖和轉移,這在本研究中得到了驗證〔20〕。具體而言,通過分析臨床標本中SLC1A5的表達模式,本文發現SLC1A5參與了細胞鐵死亡的機制。作為人類癌癥中最常見的擴增基因之一,MCL1過表達已被確定與高腫瘤分級和患者生存率降低相關〔21〕。研究表明,MCL1可能參與腫瘤細胞鐵死亡的凋亡機制,在抗腫瘤中起關鍵作用,這對于發展抗癌性很重要〔22〕。本研究證明了SLC1A5和MCL1是miR-137的下游靶標,而miR-137沉默則上調SLC1A5以增強腫瘤谷氨酰胺代謝。正如預期結果,證明miR-137可以作為轉錄后調節劑,通過靶向其3′非翻譯區(UTR)使SLC1A5和MCL-1沉默,并通過miR-137海綿化。作為鐵死亡的重要成員,GPX4可以消除ROS。在許多研究中,科學家將調節GSH水平的藥物定義為Ⅰ類促鐵死亡誘導劑,將影響GPX4活性的藥物定義為Ⅱ類育肥性誘導劑。本研究發現,miR-137可以影響肺癌細胞中GPX4的表達水平,并揭示了GPX4在鐵死亡中的作用。在先前的研究中,發現GPX4促進神經膠質瘤細胞的生長。本研究發現,在肺癌細胞中降低GPX4可誘導的鐵死亡并不新鮮,因為已確認GPX4是鐵死亡的抑制劑。

綜上所述,上調miR-137可以沉默SLC1A5和MCL1,誘導肺癌細胞鐵死亡引起的細胞凋亡而表現出抗癌作用。