LncRNA LINC00665通過miR-9-5p調(diào)節(jié)ATF1表達促進甲狀腺乳頭狀癌進展

趙愛兵 馬麗華 竇國章 吳長明 吳雙紅 李子安 張東偉

(唐山工人醫(yī)院 1胃腸外二科,河北 唐山 063000;2乳腺外科;3創(chuàng)傷科;4胃腸外一科;5燒傷整形一科)

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤,組織病理學(xué)分為乳頭狀癌、濾泡癌、髓樣癌和未分化癌〔1,2〕。其中甲狀腺乳頭狀癌(PTC)的發(fā)生率已達甲狀腺癌總體發(fā)生率的80%以上〔3〕,因此研究PTC的發(fā)展機制對治療甲狀腺癌意義重大。多數(shù)患者經(jīng)手術(shù)和放射性碘治療后長期總體預(yù)后情況較好〔4〕,但仍有一部分患者出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等情況,仍需再次接受手術(shù)治療。已有多項研究〔5～7〕對PTC的分子機制進行了探索,其中遺傳方面的研究成果為PTC的靶向治療提供了新的見解。LncRNA LINC00665是一種新發(fā)現(xiàn)的與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)的LncRNA,在卵巢癌、乳腺癌、肝癌等癌癥的發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用〔8～10〕。miR-9-5p能夠調(diào)控PTC細胞凋亡,抑制PTC細胞活力〔11〕。轉(zhuǎn)錄激活因子(ATF)1能夠增強甲狀腺癌的侵襲能力,與其他腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移及免疫逃逸能力密切相關(guān)〔12〕。初步RNA測序分析發(fā)現(xiàn)LncRNA LINC00665與miR-9-5p、miR-9-5p與ATF1之間存在能夠靶向結(jié)合的互補序列,推測LncRNA LINC00665、miR-9-5p、ATF1三者之間存在聯(lián)系,但目前相關(guān)報道較少。本研究分析LncRNA LINC00665、miR-9-5p、ATF1之間的調(diào)節(jié)關(guān)系,對PTC發(fā)展的影響。

1 材料與方法

1.1組織標本 收集2019年7月至2020年7月住院進行手術(shù)切除的PTC樣本80例,術(shù)后常規(guī)病理診斷結(jié)果為PTC。所有患者臨床病理資料完整,術(shù)前未接受放療、化療及生物學(xué)治療。80例PTC患者中男23例,女57例,年齡(45.82±14.27)歲。甲狀腺癌TNM分期參照2010年第七版美國癌癥聯(lián)合委員會/國際抗癌聯(lián)合會制定的分期標準：Ⅰ～Ⅱ期45例,Ⅲ～Ⅳ期35例。收集PTC組織與癌旁組織樣本(距離腫瘤≥2 cm),癌旁組織經(jīng)病理診斷為正常甲狀腺組織,于液氮中凍存。

1.2細胞及試劑 TPC-1、KTC-1、B-CPAP細胞株,購自武漢普諾賽生命科技有限公司;HTori-3細胞株,購自上海弘順生物科技有限公司;Nthy-ori3-1細胞株,購自南京科佰生物科技有限公司;RPMI1640培養(yǎng)基(批號0134802)、胎牛血清(FBS,批號0112417)、鏈霉素/青霉素(批號0103512)、TRIzol試劑(批號0106471)、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(批號10-205141)、mirVana miRNA分離試劑盒(批號10-064131)、SuperSignal West Pico PLUS化學(xué)發(fā)光底物(批號08-513010)、Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(批號096201),購自美國Thermo Fisher公司;SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(批號100532104),購自大連寶生生物科技有限公司;All-in-One miRNA qRT-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒(批號YT20190614),購自亞太恒信生物科技(北京)有限公司;PCR引物與內(nèi)參購自上海生工生物工程股份有限公司;雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(批號20190905)、CCK-8試劑盒(批號20190917)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(批號20190824),購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;基質(zhì)膠(批號YH190811),購自上海研卉生物科技有限公司;膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(AnnexinⅤ-FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡雙染試劑盒(批號0013021504),購自美國BD公司;RIPA試劑(批號010322-500),購自美國Sigma公司;兔ATF1抗體(批號0210036)、兔凝血酶敏感蛋白(TSP)-1抗體(批號0308042)、兔B細胞淋巴瘤基因(Bcl)-2抗體(批號0110327)、兔Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體(批號0110345),購自美國Abcam公司;SP法兔抗體免疫組化試劑盒(批號20191013),購自福州飛凈生物科技有限公司。其他試劑均為市售分析純。

1.3細胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇TPC-1、KTC-1、B-CPAP、HTori-3和Nthy-ori3-1,使用含10% FBS和100 mg/ml鏈霉素/青霉素的RPMI1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng),細胞均放置于設(shè)置為37 ℃、5% CO2、飽和濕度的電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將生長至對數(shù)期的B-CPAP細胞分為對照組(不做轉(zhuǎn)染)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體和inhibitor-NC)、shLINC00665組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-shLINC00665)和shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-shLINC00665和miR-9-5p-inhibitor)。將pcDNA3.1-shLINC00665(2 μg)、pcDNA3.1空載體(2 μg)、miR-9-5p-inhibitor(50 nmol/L)和inhibitor-NC(50 nmol/L)用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑按照上述分組進行轉(zhuǎn)染,48 h后收集細胞進行qRT-PCR檢測并用于后續(xù)實驗。

1.4qRT-PCR檢測LncRNA LINC00665與miR-9-5p的相對表達 LINC00665檢測：TRIzol試劑提取癌、癌旁組織與各組細胞總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用1 μg cDNA模板、上下游引物各0.5 μg和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒配制20 μl PCR體系。反應(yīng)條件：95 ℃單循環(huán)30 s,95 ℃ 40 s,58.5 ℃ 30 s,循環(huán)40次。引物序列：LINC00665上游引物：5′-AGCACCCCTAGTGTCAGTCA-3′,下游：5′-TGGTCTCTAGGGAGGCAGAA-3′。內(nèi)參為GAPDH mRNA;甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)上游引物：5′-CTCACCGGATGCACCAATGTT-3′,下游：5′-CGCGTTGCTCACAATGTTCAT-3′。miR-9-5p檢測：使用mirVana miRNA分離試劑盒提取癌、癌旁組織與各組細胞miRNAs,采用All-in-One miRNA qRT-PCR試劑盒進行檢測。反應(yīng)條件：95 ℃單循環(huán)30 s,95 ℃ 40 s,60 ℃ 30 s,循環(huán)35次。引物序列：miR-9-5p上游引物：5′-GAGGCAGACAGCCAGACA-3′,下游：5′-CAAGGGTCCGAGGTGG GT-3′。內(nèi)參為小分子U6 mRNA,U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游：5′-AACGCTTCAC GAATTTGCGT-3′。

1.5雙熒光素酶報告基因檢測 使用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫TargetScanHuman預(yù)測分析了LINC00665、ATF1和miR-9-5p的結(jié)合位點,分別構(gòu)建了野生型和突變型熒光質(zhì)粒：psiCheck2-LINC00665-Luc、psiCheck2-LINC00665-MUT-Luc;psiCheck2-ATF1-Luc、psiCheck2-ATF1-MUT-Luc,并與miR-9-5p模擬物共轉(zhuǎn)染至B-CPAP細胞中,熒光素酶報告實驗檢測熒光素酶活性。

1.6CCK-8法檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期的對照組與轉(zhuǎn)染的各組B-CPAP細胞,用胰蛋白酶消化后接種于96孔板上,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24、48、72、96 h后,每孔加入10 μl CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)2 h后用酶標儀檢測各孔吸光度。

1.7Transwell檢測細胞遷移和侵襲能力 細胞遷移：收集1.4中細胞覆蓋率達到80%的對照組與轉(zhuǎn)染的各組B-CPAP細胞,胰酶消化后制成4×105個/ml的單細胞懸液。每組細胞取200 μl懸液均勻接種于Transwell小室上室膜表面,取600 μl含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基加入下室內(nèi)。于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,清除未穿透上室膜表面的細胞,1×磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,將穿過濾膜的細胞用4%多聚甲醛固定30 min,結(jié)晶紫染色。于200倍光學(xué)顯微鏡下觀察,每組隨機挑選5個視野,計算穿過濾膜的細胞數(shù)平均值。細胞侵襲：無血清RPMI1640培養(yǎng)基與基質(zhì)膠按1∶3的比例稀釋,混勻后均勻涂抹于小室上室膜底部,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜,次日置于紫外線燈下照射30 min。收集1.4中細胞覆蓋率達到80%的對照組與轉(zhuǎn)染的各組B-CPAP細胞,胰酶消化后制成5×105個/ml的單細胞懸液。后續(xù)操作同細胞遷移。

1.8流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集1.4中對照與轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)48 h的各組B-CPAP細胞,加入結(jié)合緩沖液調(diào)整細胞濃度為1×106個/ml,每組細胞加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC、5 μl PI,避光反應(yīng)30 min,在流式細胞儀上進行細胞凋亡檢測。

1.9Western印跡檢測ATF1、TSP-1、Bcl-2、Bax相對表達 PTC組織與癌旁組織樣本勻漿后加入適量預(yù)冷RIPA,充分混勻后冰上孵育1.5 h;收集1.4中對照與轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)48 h的各組B-CPAP細胞,加入適量預(yù)冷RIPA,充分混勻后冰上孵育30 min。組織與細胞均在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min,取上清液,BCA定量后制樣。凝膠電泳分離樣品蛋白,轉(zhuǎn)膜,截取目的條帶浸于5%脫脂奶粉制成的封閉液中,置于搖床上室溫封閉1 h。組織檢測ATF1,細胞檢測ATF1、TSP-1、Bcl-2和Bax,用封閉液稀釋一抗制成孵育液,稀釋比例為1∶500,充分搖勻后置于4 ℃環(huán)境下過夜。第二天取出膜,平衡至室溫后洗膜,加入稀釋比例為1∶5 000的對應(yīng)二抗孵育液,室溫孵育2 h,洗膜后加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)液,避光反應(yīng)5 min,用定量成像儀收集結(jié)果。

1.10體內(nèi)異種移植實驗 收集1.4中對照與轉(zhuǎn)染并生長至對數(shù)期的各組B-CPAP細胞并制成5×107個/ml的單細胞懸液。裸鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后隨機分為對照組、陰性對照組、shLINC00665組和shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor組,每組6只。原位接種細胞懸液于甲狀腺被膜下,10周后處死裸鼠,完整取出皮下腫瘤,稱重后置于10%甲醛溶液中固定,常規(guī)石蠟包埋并制成切片。

1.11免疫組化染色觀察癌組織ATF1表達 采用免疫組化SP法檢測裸鼠腫瘤組織ATF1表達。按照試劑盒要求處理石蠟切片并進行染色操作,光鏡下拍攝實驗結(jié)果,每張切片隨機選擇5個不同視野,用ImageJ軟件進行圖像分析,取平均值作為ATF1的相對表達量。

1.12統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進行獨立樣本t檢驗、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1LncRNA LINC00665與miR-9-5p在癌、癌旁組織中的表達水平與相關(guān)性 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,PTC組織中LncRNA LINC00665相對表達(1.47±0.20)顯著高于癌旁組織(0.85±0.09,P<0.05),miR-9-5p相對表達(0.53±0.12)顯著低于癌旁組織(0.99±0.09,P<0.05)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,LncRNA LINC00665與miR-9-5p水平呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。見圖1。

圖1 LncRNA LINC00665與miR-9-5p相關(guān)性

2.2LncRNA LINC00665與miR-9-5p在細胞中的相對表達 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,與Nthy-ori3-1相比,PTC細胞中TPC-1、KTC-1、B-CPAP、HTori-3的LINC00665相對表達量均升高,miR-9-5p相對表達量均降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。B-CPAP細胞中LINC00665相對表達量最高,因此選擇B-CPAP細胞進行后續(xù)實驗。與對照組相比,shLINC00665組LINC00665相對表達量顯著下降,miR-9-5p相對表達量顯著上升(P<0.05);與shLINC00665組相比,shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor組miR-9-5p表達量顯著下降(P<0.05);證明轉(zhuǎn)染成功。見表1、表2。

表1 LINC00665、miR-9-5p在PTC不同細胞系中表達

表2 各組不同時間B-CPAP轉(zhuǎn)染細胞增殖活性及LINC00665、miR-9-5p、ATF1表達比較

2.3ATF1在癌、癌旁組織和細胞中的表達 與癌旁組織(0.79±0.04)相比,PTC組織中ATF1相對表達量(1.53±0.11)顯著升高(P<0.05);與對照組相比,shLINC00665組、shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor組ATF1相對表達量顯著下降(P<0.05)。見表2、圖2。

1～6：癌旁組織、PTC組織、對照組、陰性對照組、shLINC00665組、shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor組圖2 ATF1在癌、癌旁組織和細胞中表達

2.4雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果 TargetScanHuman在線數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示,LncRNA LINC00665與miR-9-5p存在結(jié)合位點,ATF1與miR-9-5p存在結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果表明,miR-9-5p模擬物能夠明顯降低野生型3′非翻譯區(qū)(UTR)的LINC00665熒光素酶活性(P<0.05),對突變型3′UTR的LINC00665熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05),說明LncRNA LINC00665能夠直接靶向作用于miR-9-5p;能夠明顯降低野生型3′UTR的ATF1熒光素酶活性(P<0.05),對突變型3′UTR的ATF1熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05),說明miR-9-5p能夠直接靶向作用于ATF1。見圖3、表3。

表3 兩組LINC00665相對熒光素酶活性

圖3 LncRNA LINC00665靶向調(diào)控miR-9-5p及miR-9-5p靶向調(diào)控ATF1雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果

2.5LINC00665通過調(diào)控miR-9-5p促進PTC細胞增殖、遷移和侵襲并抑制凋亡 CCK-8檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,shLINC00665組72、96 h細胞增殖活性明顯降低(P<0.05);與shLINC00665組相比,shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor組72、96 h細胞增殖活性顯著上升(P<0.05)。見表2。Western印跡結(jié)果顯示,與對照組相比,shLINC00665組、shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor組TSP-1、Bax表達量顯著上升,Bcl-2表達量顯著下降(P<0.05);與shLINC00665組相比,shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor組TSP-1、Bax表達量顯著降低,Bcl-2表達量顯著升高(P<0.05)。見圖4、表4。Transwell細胞遷移與侵襲實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,shLINC00665組、shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor組細胞遷移與侵襲能力明顯下降(P<0.05);與shLINC00665組相比,shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor組細胞遷移與侵襲能力顯著增強(P<0.05)。見表4、圖5。凋亡結(jié)果顯示,與對照組相比,shLINC00665組、shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05);與shLINC00665組相比,shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor組細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表4、圖6。

表4 各組細胞凋亡率、遷移、侵襲細胞數(shù)及TSP-1、Bcl-2和Bax相對表達水平

1～4：對照組、陰性對照組、shLINC00665組、shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor組圖4 Western印跡檢測各組TSP-1、Bcl-2和Bax表達量

圖6 miR-9-5p對各組細胞凋亡的影響

2.6LncRNA LINC00665促進PTC發(fā)展 體內(nèi)異種移植實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,shLINC00665組腫瘤生長速度明顯下降(P<0.05);與shLINC00665組相比,shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor組腫瘤生長速度明顯提高(P<0.05)。免疫組化檢測結(jié)果顯示,與對照組(1.54±0.26)和陰性對照組(1.47±0.22)相比,shLINC00665組(0.54±0.13)、shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor組腫瘤ATF-1相對表達水平(0.62±0.10)明顯下降(P<0.05)。見圖7、圖8、表5。

表5 各組不同時間皮下腫瘤體積比較

圖7 各組皮下腫瘤大體形態(tài)

圖8 各組皮下腫瘤組織病理(免疫組化,×200)

3 討 論

LncRNA是長度超過200個核苷酸序列的非編碼RNA分子,具有調(diào)控蛋白質(zhì)功能、基因印記、轉(zhuǎn)錄等多種生物學(xué)功能〔13〕。研究〔14〕表明LncRNA的表達或功能異常與人類疾病的發(fā)生密切相關(guān),在許多癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中,lncRNA已成為新的治療目標及診斷和預(yù)后標志物。本研究結(jié)果提示,LncRNA LINC00665與PTC的發(fā)展相關(guān)且LINC00665參與調(diào)控了B-CPAP細胞的增殖、遷移與侵襲,并抑制了B-CPAP細胞凋亡。研究〔15〕發(fā)現(xiàn)某些腫瘤細胞與特定組織中,一些lncRNA能夠攜帶某些miRNA的“種子序列”,像海綿一樣結(jié)合miRNA,從而阻止miRNA與其靶mRNA結(jié)合。本研究通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫TargetScanHuman預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)LINC00665與miR-9-5p存在結(jié)合位點,雙熒光素酶報告基因檢測也證實了LINC00665與miR-9-5p之間能夠發(fā)生相互作用,且LINC00665能夠抑制miR-9-5p表達,促進PTC發(fā)展。

miRNA是一類內(nèi)源性小分子非編碼RNA,通過與靶基因3′UTR互補配對結(jié)合調(diào)節(jié)靶基因mRNA降解或抑制基因表達〔16〕。相關(guān)研究〔17,18〕發(fā)現(xiàn)miR-9-5p在胃癌、前列腺癌等癌癥中發(fā)揮抑制作用。本研究推測miR-9-5p在PTC中同樣發(fā)揮抑制作用。本研究結(jié)果說明,miR-9-5p能夠抑制B-CPAP細胞增殖、遷移與侵襲,促進B-CPAP細胞凋亡。ATF1是環(huán)磷酸腺苷(cAMP)應(yīng)答元件結(jié)合蛋白家族中的一員,其結(jié)構(gòu)與功能和部分腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔19〕。ATF1具有促進腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲與免疫逃逸,抑制腫瘤細胞凋亡的能力〔20〕。Peng等〔21〕研究發(fā)現(xiàn)ATF1能夠改變Bcl-2/Bax的比值,抑制胃黏膜上皮細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,促進胃癌發(fā)生。TSP-1能夠抑制與血管生成相關(guān)的蛋白質(zhì),通過調(diào)節(jié)血管生成等影響腫瘤侵襲〔22〕。ATF1與TSP-1啟動子中cAMP反應(yīng)元件結(jié)合位點相作用,可使肝細胞生長因子誘導(dǎo)的TSP-1表達下調(diào),進而導(dǎo)致甲狀腺癌細胞侵襲性增強。本研究中TSP-1、Bcl-2與Bax的Western印跡檢測結(jié)果與上述研究結(jié)論相近,說明ATF1對PTC發(fā)展具有促進作用。