基于Wnt/β-catenin信號通路探討黃精-當歸配伍對阿爾茨海默病小鼠海馬神經干細胞增殖的影響

董琦 錢紅月 廖可欣 熊浩仲 侯吉華 肖移生

(江西中醫藥大學中醫學院,江西 南昌 330004)

隨著世界人口老齡化不斷加劇,阿爾茨海默病(AD)的患病率持續升高;到2050年,全球AD患病率將是目前的2倍,而根據AD的生物學定義,這一估計將高出3倍,這已嚴重地威脅著人類健康〔1〕。AD是一種多因素、復雜的中樞神經退行性病變,目前已有的治療藥物雖能緩解其癥狀,但大都無法補充大腦內過多丟失的神經元;針對此病,尚無有效和穩定的治療策略〔2〕。因此,尋找有效藥物促進大腦內神經干細胞(NSCs)增殖以補充、替代丟失的神經元,是目前AD研究的重點方向之一〔3,4〕。

前期筆者對黃精-當歸配伍(CPA)之黃精丸抗AD進行了較深入的研究,臨床應用表明該丸治療輕中度AD療效較好,可改善患者癡呆癥狀〔5〕;動物實驗證明CPA具有治療大、小鼠AD作用,能激活AD動物腦內Wnt/β-catenin信號通路〔6～8〕。但CPA激活該信號通路與其抗AD確切機制之間的內在聯系有待深入闡明。研究表明,體內Wnt/β-catenin信號通路對中樞神經影響亦顯著,如激活AD動物腦內Wnt/β-catenin信號則可促進海馬齒狀回(DG)區內NSCs增殖〔9,10〕。提示CPA可促進AD動物海馬NSCs增殖以發揮抗AD作用。基于此,本文從該信號通路角度觀察CPA對AD小鼠海馬DG區NSCs增殖的影響。

1 材料與方法

1.1動物與分組 SPF級、2月齡、雄性、KM小鼠64只,購自江西中醫藥大學實驗動物科技中心〔SYXK(贛)2017-0004〕,體質量(26±2)g。小鼠適應性飼養1 w后隨機分成正常對照組、AD模型組、CPA組、CPA+苯甲酰胺化合物(IWR-1-endo)組(簡稱IWR-1-endo組),每組16只。

1.2藥物與主要試劑 CPA由黃精與當歸按1∶1組成,2味中藥均購自江西中醫藥大學附屬中醫院中藥房,試驗藥液制備按課題組常用的中藥提取方法進行,每1 ml試驗藥液終濃度相當于含中藥1 g〔6～8,11〕。Wnt信號通路抑制劑IWR-1-endo及東莨菪堿均為Sigma公司產品,D-半乳糖為北京百靈威科技有限公司產品,5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)凍干粉為Med Chen Express公司產品,兔抗鼠β-catenin抗體、糖原合成激酶(GSK)-3β抗體、BrdU抗體、羊抗兔四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)及熒光封固劑(Fluoroshield Mounting)均為Abcam公司產品,二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑及免疫組化試劑盒均為北京中杉金橋公司產品,即用型DAPI染液為北京Solarbio公司產品,trizol試劑、逆轉錄試劑盒及實時熒光定量-聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)試劑盒均為美國Invitrogen公司產品,化學發光試劑盒為美國Millipore公司產品,蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒均為上海碧云天生物技術有限公司產品。

1.3主要儀器 EX-TE-03小型中藥提取罐為上海順儀實驗設備公司產品,STRIKE 300型旋轉蒸發儀為德國ChemTron公司產品,DT-200型小鼠跳臺儀為上海康為醫療公司產品,EEP102型多功能電泳儀為碧云天生物技術公司產品,ABI7500型熒光定量PCR儀為美國ABI公司產品,BX-41型顯微數碼凝膠成像系統為日本Olympus公司產品,Motic Image Advanced3.2圖像數據分析軟件為德國Motic公司產品。

1.4AD模型建立與試驗藥物干預 AD模型組、CPA組、IWR-1-endo組小鼠頸背部皮下注射無菌生理鹽水配制而成的1% D-半乳糖液〔140 mg/(kg·d)〕,連續注射3 w以造成小鼠亞急性衰老;第4周開始改用東莨菪堿〔2 mg/(kg·d)〕腹腔注射,連續注射2 w以造成小鼠學習記憶障礙,模擬AD病變〔7,12,13〕。AD造模1 w后,同時以2.5 g/(kg·d)劑量給CPA組及IWR-1-endo組小鼠灌胃CPA,同時點給AD模型組灌胃0.5 ml/d無菌生理鹽水,共持續4 w。正常對照組僅日常飼養,不做灌胃處理。參考文獻報道的小鼠IWR-1-endo給藥方法〔14,15〕,在灌胃給藥的同時給予IWR-1-endo組小鼠腹腔注射0.5 mg/ml的IWR-1-endo溶液(按0.1 ml/10 g劑量進行注射,1次/2 d),共持續4 w。第5周開始,對所有小鼠再增加腹腔注射BrdU標記處理〔50 mg/(kg·d)〕,連續5 d〔16〕。

1.5跳臺檢測 檢測裝置內有6個不透光的回避反射間,每間中央有一個高、直徑均為3.5 cm的圓形絕緣平臺,底面鋪有可通36 V交流電的銅柵;實驗時先將小鼠置于底面,接電后小鼠受電擊的正常反應是跳上絕緣平臺,多數小鼠有可能再次或多次跳下平臺而受電擊又會迅速跳回平臺;按此法訓練各小鼠5 min,并分別記錄小鼠受到電擊的反應時間及錯誤次數以此作為其學習成績;24 h后重復檢測,先將小鼠放在平臺上,記錄其第1次跳離平臺的潛伏時間及5 min內反復跳下平臺的錯誤次數以此檢測小鼠的記憶成績,若5 min內小鼠不離開平臺,則潛伏期計為300 s〔7,11〕。

1.6取材 跳臺實驗后次日,每組隨機取8只小鼠行快速脫頸處死,快速取出大腦海馬,漂洗后勻漿于液氮凍存待檢;每組其余小鼠作灌注固定后取腦、再固定、制作切片用于各形態學檢測。

1.7RT-qPCR檢測 參照trizol試劑說明書,提取各組小鼠海馬勻漿的總RNA,按課題組方法進行RT-qPCR〔7,8,11～13〕。待測基因擴增引物序列由Invitrogen公司設計合成,β-catenin上游引物5′-AAGGTAGAGTGATGAAAGTTGTT-3′,下游5′-CACCATGTCCTCTGTCTATTC-3′,產物長度126 bp;GSK-3β上游引物5′-CCGCCCGGCTAACACCACTG-3′,下游5′-GTGCTGGTCTTTCCCGCGCA-3′,產物長度326 bp;GAPDH內參引物上游5′-ACGGATTTGGTCGTATTGGGCG-3′,下游5′-CTCCTGGAAGATGGTGATGG-3′,產物長度138 bp。應用ABI7500 PCR儀檢測各實驗組和對照組模板Ct值,陰性對照以RNA酶水(RNAse-free H2O)為模板,反應條件為95 ℃預變性30 s,95 ℃變性10 s,55～60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,40個循環;對所獲得的Ct值進行相對定量分析,以倍比(Folds)=2-ΔΔCt表示實驗組和對照組目的基因表達的倍比關系,其中ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct GAPDH)實驗組-(Ct目的基因-Ct GAPDH)對照組。實驗重復3次,計算平均值。

1.8Western印跡檢測 用蛋白提取試劑盒提取各小鼠海馬勻漿的總蛋白,以BCA法定量蛋白。取總蛋白進行SDS-PAGE,然后轉到聚偏氟乙烯(PVDF)膜,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,分別加β-catenin、GSK-3β一抗(1∶500),以GAPDH為內參,4 ℃孵育過夜,二抗(1∶5 000)室溫1 h,用化學發光液在暗室內顯影、曝光成像,在化學發光儀上分析結果并進行圖像采集。

1.9BrdU免疫組化 操作步驟按試劑盒推薦的鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法(SP)法步驟進行,BrdU以1∶500稀釋。每張切片的左右對稱海馬同步檢測,計數海馬DG區陽性神經元數量。陽性神經細胞計數方法：于400倍光鏡下,隨機取相鄰3個視野,運用Motic數據分析軟件計數陽性細胞,結果取平均值。

1.10BrdU免疫熒光 切片經磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗后滴加5%山羊血清封閉,然后滴加兔抗小鼠BrdU(1∶500)抗體,再滴加山羊抗兔TRITC二抗,漂洗后封片。同BrdU免疫組化的觀察、計數方法,熒光顯微鏡下觀察并計數海馬DG區的陽性熒光細胞并采集圖片。

1.11統計學處理 采用SPSS25.0統計軟件進行單因素方差分析(One way ANOVA)。

2 結 果

2.1各組學習、記憶成績差異比較 與正常對照組比較,AD模型組跳臺學習成績的反應時間顯著延長,學習與記憶測試的錯誤次數顯著增多,記憶成績的潛伏時間顯著縮短(P<0.01);與AD模型組比較,CPA組跳臺學習反應時間及錯誤次數、記憶錯誤次數均顯著減少,跳臺記憶的潛伏時間明顯增加(P<0.01),表明其學習及記憶成績明顯提高、癡呆癥狀顯著改善;與CPA組比較,IWR-1-endo組跳臺學習成績的反應時間顯著延長,學習與記憶測試的錯誤次數顯著增多,記憶成績的潛伏時間顯著縮短(P<0.01)。見表1。

表1 各組學習、記憶成績、海馬神經β-catenin、GSK-3β蛋白表達水平、海馬DG區BrdU免疫陽性細胞數量比較

2.2各組海馬DG區BrdU免疫陽性細胞數量比較 與正常對照組比較,AD模型組海馬DG區BrdU免疫組化及免疫熒光陽性細胞數量均明顯減少(P<0.01);與AD模型組比較,CPA組海馬DG區BrdU免疫組化及免疫熒光陽性細胞數量均明顯增多(P<0.01);與CPA組比較,IWR-1-endo組海馬DG區BrdU免疫組化及免疫熒光陽性細胞數量均明顯減少(P<0.01)。見表1、圖1。

圖1 各組海馬DG區BrdU(×400,箭頭指示陽性細胞)

2.3各組海馬神經β-catenin、GSK-3β mRNA及蛋白表達水平比較 與正常對照組比較,AD模型組海馬β-catenin、GSK-3β mRNA及蛋白的表達水平分別顯著降低和升高(P<0.01);與AD模型組比較,CPA組β-catenin、GSK-3β mRNA及蛋白的表達水平分別顯著升高和降低(P<0.01);與CPA組比較,IWR-1-endo組β-catenin、GSK-3β mRNA及蛋白的表達水平分別顯著降低和升高(P<0.01)。見表1、表2、圖2。

1～4：正常對照組、AD模型組、CPA組、IWR-1-endo組圖2 各組海馬神經β-catenin、GSK-3β蛋白表達

表2 各組海馬神經β-catenin、GSK-3β mRNA表達水平比較

3 討 論

AD為中醫“呆病”范疇的一種常見類型,其實質為本虛標實之病癥,本虛為腎虛精虧、氣虛髓衰兼有陰虛血虛,標實為血瘀絡滯、痰濁互結則腦脈痹阻。該病可因虛致實,也可由實致虛,虛實夾雜,最終導致髓海不足,發為癡呆。因此,腎精虧虛和血瘀絡滯是AD的核心病機,貫穿其發病的全過程。針對此核心病機,中醫防治癡呆主要采取補腎填精、活血通絡等標本同治措施以生髓養腦、充盈髓海〔17,18〕。黃精丸又稱九轉黃精丸,為古代皇家常用藥品之一,由黃精、當歸以1∶1配伍后經蜜制成丸,具有補腎填精、益氣養血、活血通絡、化痰清濁等功效,供宮廷防癡抗衰、保健養生使用,為補益之佳品〔19〕。黃精丸在防治AD等老年性疾病中顯示出神經保護功能,具有臨床應用價值。

AD與Wnt相關信號通路,尤其是與Wnt/β-catenin信號有著密切的聯系,該通路中相關蛋白可通過自分泌或旁分泌的方式作用于神經細胞膜,從而激活細胞內信號轉導,調節下游靶基因表達,發揮神經保護作用,可顯著改善AD動物的癡呆癥狀〔20,21〕。課題組前期研究發現CPA能升高AD小鼠海馬神經Wnt、蓬松蛋白(DVL)2、細胞周期蛋白(Cyclin)D1等關鍵因子的mRNA及蛋白表達水平,這表明其可激活AD小鼠海馬神經Wnt/β-catenin信號通路發揮抗AD作用〔7,8〕。本實驗得出相似的結果,且采用IWR-1-endo抑制AD小鼠海馬神經Wnt/β-catenin信號通路后,CPA治療效果明顯降低,這進一步證實了前期的研究結果。

研究表明,AD動物腦內Wnt/β-catenin信號水平明顯降低,激活此信號則可以調控腦內神經元發育與存活,促進海馬NSCs增殖、補充神經元數量,進而恢復海馬記憶認知調節功能〔9,10〕。本研究結果提示,CPA可通過該信號通路促進AD動物海馬NSCs增殖;CPA能調控Wnt/β-catenin信號促進AD動物海馬NSCs增殖,從而恢復海馬功能、發揮抗AD作用的設想。

綜上所述,黃精丸具有防治AD的作用,并能促進海馬NSCs增殖,其機制可能與其調控海馬神經Wnt/β-catenin信號通路有關。