阿霉素預處理聯合GNPs-siPD-L1通過激活抗腫瘤免疫反應抑制肺癌進展

姜偉華 高永山 王貴剛 楊燕君 董躍華 張振明

(河北北方學院附屬第一醫院胸外科,河北 張家口 075000)

最常見的肺癌類型是非小細胞肺癌,約占肺癌病例的 84%〔1～3〕。盡管多學科抗癌策略不斷發展,但肺癌仍是全球癌癥的首要死因,因此仍需探索新的治療方案〔4〕。免疫檢查點抑制劑在肺癌治療中表現出驚人的療效,程序性細胞死亡蛋白(PD)-1/PD配體(PD-L)1抗體已廣泛用于肺癌的二線治療中〔5,6〕。然而腫瘤抗原突變或表達下調往往會造成抗體治療失敗〔7〕,因此基于 siRNA 在基因層面敲低目標基因的含量在癌癥治療中具有巨大潛力〔8〕。此外,先前的一項研究發現,低劑量的阿霉素會增加小鼠腫瘤中內源性CD8+T細胞的浸潤,可能對局部抗腫瘤免疫反應產生幫助〔9〕。本研究設計針對PD-L1的小干擾RNA(siRNA),并且利用金納米粒(GNPs-siPD-L1)作為siRNA載體,探索這種包含PD-L1 siRNA的金納米粒是否可以激活抗腫瘤免疫反應,并采用低劑量阿霉素對荷瘤小鼠進行預處理,探討這種聯合治療策略是否可以進一步增強GNPs-siPD-L1對肺癌的抑制活性。

1 材料和方法

1.1細胞系 小鼠LLC細胞系購自武漢普諾賽生物科技有限公司,使用DMEM+10%胎牛血清的完全培養基對其進行培養。

1.2主要試劑 十六烷基三甲基氯化銨(CTAC)、左旋維生素C(AA)、聚4-苯乙烯磺酸鈉(PSS)、聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDADMAC)及膠原酶Ⅰ購自美國Sigma公司;放射免疫沉淀(RIPA)裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二氨基聯苯胺(DAB)顯色液及蘇木素染液購自上海碧云天生物科技有限公司;兔抗PD-L1抗體、兔抗CD4抗體及兔抗CD8抗體購自美國CST公司;膜聯蛋白(Annexin)Ⅴ/7-AAD 凋亡檢測試劑盒購自北京義翹神州生物科技有限公司;TUNEL染色試劑盒購自上海翌圣生物科技有限公司;山羊抗兔二抗購自杭州聯科生物科技有限公司;鹽酸阿霉素購自上海懋康生物;熒光標記的PD-L1 siRNA-羧基熒光素(FAM),由上海吉瑪生物進行合成。

1.3GNPs和GNPs-siPD-L1的合成 將1.6 ml CTAC(0.1 mol/L)溶液加入8 ml超純水中,然后加入 75 μl碘化鉀(KI,0.01 mol/L)和80 μl HAuCl4(25.4 mmol/L)。然后將 20.3 μl NaOH(0.1 mol/L)快速加入混合物中。之后,將 80 μl AA(64 mmol/L) 快速加入溶液中,同時適度搖動。最后,將 10 μl NaOH(0.1 mol/L) 快速加入混合物中,并快速搖動瓶子。反應結束后,10 000 r/min離心10 min收集GNP,并重懸在超純水中。將4 ml聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)溶液(10 mg/ml)和2 ml NaCl溶液(10 mmol/L) 添加到20 ml GNPs中,并在室溫下攪拌1 h。10 000 r/min離心10 min收集沉積,使用超純水重懸。同樣的,將4 ml聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDADMAC)溶液(10 mg/ml)和2 ml NaCl溶液(10 mmol/L) 添加到20 ml剛剛收集的沉淀中,并在室溫下攪拌1 h。10 000 r/min離心10 min收集沉積,使用超純水重懸。將制備的金納米粒與2 μg siRNA輕輕混合,室溫孵育30 min,通過靜電吸附獲得GNPs-siPD-L1。之后,將溶液以10 000 r/min離心10 min。收集顆粒并儲存于4 ℃備用。通過透射電子顯微鏡(JEM-2100F)觀測GNPs 和GNPs-siPD-L1樣品。

1.4Western印跡檢測PD-L1的表達 1×105個細胞分別與磷酸鹽緩沖液(PBS)、siPD-L1(5 nmol/L)及GNPs-siPD-L1(5 nmol/L siRNA)共孵育24 h,收集細胞提取總蛋白,經過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及轉膜后,聚偏氟乙烯(PVDF)膜在脫脂奶粉中室溫封閉1 h,使用兔抗PD-L1抗體(1∶1 500)4 ℃過夜孵育,次日使用山羊抗兔二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h,之后通過凝膠成像儀(Tanno-3500)進行曝光。

1.5流式細胞術檢測細胞對GNPs-siPD-L1攝取及腫瘤細胞的凋亡 3×105個細胞分別與熒光標記的siPD-L1-FAM(5 nmol/L)、GNPs-siPD-L1-FAM(5 nmol/L siRNA)及Lipo-siPD-L1-FAM(5 nmol/L siRNA)共孵育24 h,收集細胞,PBS清洗3次后使用流式細胞儀(BD FACSCanto Ⅱ)進行檢測。對于細胞凋亡,取20 mg新鮮的腫瘤,剪碎后使用膠原酶Ⅰ溶液37 ℃消化1 h,使用100 μm濾網過濾后形成單細胞懸液,按照Annexin Ⅴ/7-AAD 凋亡檢測試劑盒的說明對細胞進行處理,最后使用流式細胞儀(BD FACSCanto Ⅱ)進行檢測。

1.6小鼠移植瘤模型檢測GNPs-siPD-L1的腫瘤抑制能力 5周齡大小的C57BL小鼠購自河北省實驗動物中心,所有體內實驗均滿足醫院倫理委員會的要求。取1×105個LLC細胞重懸于100 μl PBS中,注射入小鼠背部皮下,7 d后待腫瘤大小為70 mm3左右時,隨機分為3組(GNPs、GNPs-siPD-L1、GNPs-siPD-L1+Dox組),對于阿霉素預處理組,通過腹腔注射1 mg/kg鹽酸阿霉素,在第8天和第10天,通過尾靜脈分別注射100 μl GNPs或GNPs-siPD-L1(1 mg/ml),之后在第30天時對小鼠進行安樂死,解剖腫瘤,拍照并稱量瘤重。瘤體積計算公式為：體積=長×寬2/2。

1.7免疫組化檢測腫瘤浸潤T細胞的數目及TUNEL染色檢測細胞凋亡情況 取新鮮的腫瘤組織,使用4%多聚甲醛固定48 h,經過脫水包埋切片后制成組織切片,使用檸檬酸鹽緩沖進行抗原修復,使用5%山羊血清室溫封閉1 h后,加入兔抗CD4抗體(1∶100)及兔抗CD8抗體(1∶100)4 ℃孵育過夜,次日使用山羊抗兔二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h,之后經過DAB溶液顯色、蘇木素溶液染色,封片后在倒置顯微鏡下進行觀察并拍照。對于TUNEL染色,將制成的石蠟切片按照TUNEL染色試劑盒的說明進行操作。陽性染色的細胞數目使用ImageJ軟件進行統計。

1.8統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行非配對t檢驗及方差分析。

2 結 果

2.1構建GNPs-siPD-L1并驗證其對PD-L1表達的影響 電鏡檢測結果顯示,GNPs-siPD-L1的粒徑大小在130 nm左右,形態均一,且GNPs-siPD-L1與空的金納米粒GNPs無顯著差異(圖1)。Western印跡結果表明,GNPs-siPD-L1與LLC細胞共孵育后PD-L1蛋白表達(0.800 0±0.100 0)較siPD-L1和PBS(1.380 0±0.393 6)、(1.463 0±0.209 8)表達顯著降低(P<0.05)。見圖2。

圖1 GNPs-siPD-L1(透射電鏡,×50 000)

圖2 GNPs-siPD-L1與LLC細胞共孵育后的PD-L1蛋白表達

2.2GNPs-siPD-L1增強腫瘤細胞對siRNA的攝取 與LLC細胞共孵育后的流式檢測結果顯示,裸露的PD-L1 siRNA幾乎不能穿透腫瘤細胞膜,siPD-1組熒光強度為〔(12.00±1.000)%〕,而GNPs-siPD-L1顯著增強了LLC細胞對PD-L1 siRNA的攝取,效率與Lipo-siRNA相當,即GNPs-siPD-L1組、Lipo-siPD-L1組熒光強度〔(75.670±2.517)%、(77.670±5.132)%〕較siPD-L1組顯著升高(P<0.05),Blank組為空白細胞,作為陰性對照。見圖3。

圖3 GNPs-siPD-L1的細胞攝取

2.3阿霉素預處理聯合GNPs-siPD-L1抑制肺癌細胞的體內生長 對荷瘤小鼠進行治療30 d后發現,GNPs-siPD-L1對腫瘤的生長產生輕微的抑制,相反,經過阿霉素預處理,GNPs-siPD-L1組的腫瘤生長被顯著抑制,腫瘤質量明顯降低(P<0.05)。見圖4、表1。

表1 各組腫瘤質量及腫瘤體積比較

圖4 各組第30天腫瘤大小

2.4阿霉素預處理聯合GNPs-siPD-L1增強T細胞的腫瘤浸潤 免疫組化結果顯示,GNPs-siPD-L1組與GNPs組相比,腫瘤組織中CD4+和CD8+T細胞數目明顯增多(P<0.05),而阿霉素預處理聯合GNPs-siPD-L1組相比于GNPs-siPD-L1組,腫瘤組織中CD4+細胞和CD8+T細胞的浸潤程度進一步提升(P<0.001,P<0.000 1)。見圖5、表2。

表2 各組T細胞浸潤

圖5 各組T細胞浸潤(免疫組化染色,×200)

2.5阿霉素預處理聯合GNPs-siPD-L1增加腫瘤細胞凋亡 流式檢測結果表明,阿霉素預處理聯合GNPs-siPD-L1組腫瘤組織中凋亡細胞比例較GNPs-siPD-L1組明顯增多,同時,TUNEL染色結果發現,阿霉素預處理聯合GNPs-siPD-L1組腫瘤組織中TUNEL陽性細胞數目顯著多于GNPs-siPD-L1組(P<0.000 1)。見圖6、圖7、表3。

表3 各組腫瘤組織中細胞凋亡

圖7 各組腫瘤組織細胞凋亡(TUNEL染色,×100)

3 討 論

近年來,siRNA已成為一種非常有前景的抗癌治療策略〔10〕。雙鏈 siRNA 可以通過特異性靶向相應的 mRNA,誘導形成沉默復合物,從而導致特定基因表達沉默〔11〕。然而,在正常生理條件下,siRNA通常會被相關酶降解,這仍然是目前siRNA技術面臨的最大障礙〔12,13〕。此外,siRNA固有的負電荷成為其穿過細胞膜的不利因素〔14〕。因此,使用經過適當修飾的生物相容性載體包裹 siRNA 來克服這些固有障礙,對于保證這種治療方式的成功應用至關重要。納米粒子是具有多種功能的強大載體,利用腫瘤的高滲透長滯留(EPR)效應,其具有天然的腫瘤靶向功能,是siRNA的理想載體〔15〕。金納米粒是一種常用的納米粒子,其具有易于制造、粒徑可調節、天然無毒和生物相容性好的特點〔16,17〕。同時,有研究表明,siRNAs與金納米粒結合后,可顯著促進細胞攝取,從而提高體外或體內基因敲除效率〔18〕。本研究構建了PD-L1 siRNA金納米粒復合物GNPs-siPD-L1,其可以有效促進PD-L1 siRNA的內化,降低腫瘤細胞PD-L1表達。但本研究尚未探討GNPs-siPD-L1的體內代謝情況,后續的研究中將對GNPs-siPD-L1在荷瘤小鼠的體內分布進行檢測。

PD-L1是一種與腫瘤進展相關的細胞膜蛋白。先前的研究結果表明,腫瘤細胞中PD-L1 表達使這些細胞對 T 細胞誘導靶細胞裂解功能喪失,從而加劇了腫瘤進展〔19〕。阻斷 PD-1/PD-L1 配受體相互作用可有效抑制 PD-1/PD-L1 信號通路的激活,逆轉 T 細胞耗竭,避免腫瘤微環境中的免疫抑制反應〔20〕。一些針對 PD-L1 的抗體藥物已被美國食品藥品監督管理局(FDA) 批準用于多種癌癥患者的治療〔21〕。除了先前聚焦的PD-1或PD-L1抗體誘發的抗腫瘤免疫反應外,一些報道也表明,PD-L1觸發的抗凋亡信號可以提高腫瘤細胞的生存。這些發現說明癌細胞的 PD-L1 內生信號對腫瘤發展也至關重要,因此,下調PD-L1表達可能對腫瘤的治療產生積極影響〔22〕。本研究發現,GNPs-siPD-L1可以成功誘導肺癌細胞PD-L1表達下調,同時增加腫瘤組織中T細胞的浸潤及組織中細胞的凋亡。

已有大量研究表明,免疫檢查點抑制劑治療的響應率與腫瘤組織中CD8+T 細胞的浸潤息息相關〔23〕。Hu等〔24〕發現,低劑量的阿霉素處理后誘發了小鼠纖維肉瘤中T 細胞依賴性的腫瘤消除,同時這種治療在腫瘤中產生了高比例的共刺激受體,并減少了 Treg 細胞的數量,創造了一個對T 細胞浸潤十分友好的腫瘤微環境。本研究發現,聯合方案顯著增加了腫瘤組織中CD4+和CD8+T細胞數量,同時增強了腫瘤細胞凋亡,有效抑制了肺癌細胞在體內的進展。

綜上,GNPs-siPD-L1 可以有效下調腫瘤細胞中PD-L1的表達,同時該系統聯合低劑量阿霉素預處理可以顯著增強T細胞的腫瘤浸潤,激發腫瘤部位的抗腫瘤免疫反應,增強腫瘤細胞凋亡,是一種非常有希望的肺癌治療策略。