玉屏風顆粒通過調控TLR9/AP-1信號通路對過敏性鼻炎大鼠鼻黏膜重塑、白三烯水平及免疫調節的作用

劉順利 粱萌萌 劉大英 劉夏輝 何偉

(1河北省滄州中西醫結合醫院,河北 滄州 061000;2滄州師范學院生命科學系)

過敏性鼻炎(AR)作為醫院耳鼻喉科較常見病癥之一,由于環境影響發病率呈逐年上升趨勢〔1〕。AR的發生機制復雜多樣且關聯因素較多,與多種呼吸系統疾病的發生發展密切相關,若不及時進行有效的診療,可對鼻黏膜組織造成一定的影響,并可能演變為支氣管哮喘、鼻息肉及鼻竇炎等多種疾病〔2〕。AR的產生還往往伴有明顯的白三烯水平異常、氣道收縮及黏液分泌失衡等。半胱氨酰白三烯(CysLTs)作為一種具有關鍵性的炎癥介質,可經CysLT1、CysLT2等受體亞型而發揮作用,可參與支氣管哮喘、AR等多種炎癥疾病發生發展〔3〕。Toll樣受體(TLRs)家族在機體免疫反應中具有關鍵性作用,在與相對應的配體聯合后通過集合通路干預人體中相關免疫炎性反應。激活蛋白(AP)-1是由原癌基因蛋白(C-Jun)及細胞癌基因fox蛋白(C-Fos)核蛋白基因相互構成,存在于TLR9信號通路的下游部分,在參與AR相關炎癥反應及促進炎癥發生等方面具有重要作用〔4〕。近年來,對于中醫藥在臨床疾治療中的應用越來越廣泛,而中藥方劑玉屏風顆粒是從元朱丹溪的《丹溪心法》之中而來,由黃芪、白術、防風等多種中藥材組成,具有增強免疫、抑汗抗菌、補氣中位、預防過敏等多中藥理學功效,且在臨床中也多有應用〔5〕。本研究探討玉屏風顆粒通過調控TLR9/AP-1信號通路對AR大鼠鼻黏膜重塑、白三烯水平及免疫調節的作用。

1 材料與方法

1.1實驗大鼠 選取健康大鼠60只,體質量120～230 g,由廣東省醫學實驗動物中心提供,實驗動物生產許可證號SCXK(粵)2020-0035,飼養室溫環境15～22 ℃,每日光照12 h,濕度35%～60%,喂養條件以自來水及標準飼料自由攝取在動物實驗室常規飼養,大鼠實驗中的所有操作步驟嚴格依據實驗動物倫理委員會與使用指南嚴格進行。

1.2藥物、試劑與儀器 玉屏風顆粒(廣東環球制藥有限公司,批號161315),氯雷他定(上海拜耳醫藥有限公司,批號SH00426),白細胞介素(IL)-4、組胺(HIS)、免疫球蛋白(Ig)E、腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒 (天津安諾康生物技術有限公司,批號384170692、337170718、348170718、366170714),戊巴比妥鈉(成都市科龍化工試劑廠,批號2016083062),C-Fos、C-Jun抗體(美國Santa Cruz公司),辣根過氧化物酶(HRP)標記親和純化山羊抗鼠IgG二抗(上海滬峰化工有限公司),卵清蛋白(美國Sigma-Aldrich公司),氫氧化鋁(美國International Laboratory公司,批號365724),聚合酶鏈反應(PCR)檢測試劑盒(上海美旋生物公司),電子分析天平(德國Sartorius公司),離心機、恒溫水浴鍋(美國BioRad公司),多功能酶標儀(美國Ther-mo公司)。

1.3模型建立 除10只為健康大鼠外,其余50只均依據文獻〔6〕使用卵清蛋白致敏法建立過敏性鼻炎模型。造模過程中將0.3 mg卵清蛋白、300 mg氫氧化鋁粉末及1 ml生理鹽水共同混合配制成懸液后,注入大鼠腹腔內,1次/d、2 g/L進行為期20 d的基礎致敏,另加上卵清蛋白生理鹽水向鼻腔中滴加1次/d,10 μm/次,共計1 w。在最后1次對大進行致敏后的1 h內使用量化疊加計分法進行計分,當大鼠少量接觸鼻部且噴嚏數低于3次為1分,當大鼠數次觸碰鼻部且噴嚏次數在9次內為2分,當大鼠接觸鼻部十分頻繁且噴嚏次數超過9次為3分,且分值超過5則為AR大鼠建模成功,本次參與建模實驗的大鼠均建模成功。

1.4分組給藥 將大鼠分為健康(A)組、模型(B)組、玉屏風顆粒低劑量(C低)組、玉屏風顆粒中劑量(C中)組、玉屏風顆粒高劑量(C高)組、氯雷他定(D)組,各10只。C高、中、低組采用5.40、2.70、1.35 g/kg灌胃,氯雷他定組以0.90 mg/kg灌胃,A組和B組給予等量生理鹽水灌胃,均連續干預30 d。

1.5ELISA檢測血清TNF-α、IL-4、IgE、HIS水平 采集大鼠尾靜脈血液樣本0.5 ml,置于1.0 ml經4%乙二胺四乙酸(EDTA)鈉鹽溶液處理的試管中,以3 000 r/min離心5 min,分離血漿,用ELISA法檢測血漿中IL-4、HIS、IgE、TNF-α水平,操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6蘇木素-伊紅(HE)染色 將大鼠經10%戊巴比妥鈉3 ml/kg腹腔麻醉后采用脫臼法將其處死,剔除上頜骨部分的組織,并將其分離,把鼻背從中間進行切開,將鼻中隔機器兩側的鼻腔露在外部,鼻中隔及其鼻黏膜組織進行有序剝離,采集雙側鼻黏膜組織,放在10%的甲醛溶液中進行固定,常規石蠟包埋、切片、HE染色后于光學顯微鏡下觀察病理組織。

1.7鼻黏膜中嗜酸性粒細胞(EOS)檢測 行HE染色后,在顯微鏡下選擇5個視野(面積675.2 mm×498 mm)以細胞有分葉核及細胞質中有嗜酸性顆粒為標準,進行EOS計數,5個/張病理切片,1個EOS為1個計數。

1.8Western印跡檢測C-Fos、C-Jun蛋白 取大鼠鼻黏膜組織1 g進行勻漿裂解,TIP管吸打,冷存靜置30 min,轉移至離心管5 ℃,10 000 r/min離心30 min,取上清液凍存,測定蛋白含量,取總蛋白,高溫變性,電泳,C-Fos轉膜40 min,C-Jun轉膜15 min,5%脫脂奶粉封閉1 h,加一抗C-Fos(1∶1 000)、C-Jun(1∶500),β-actin(1∶2 000)5 ℃孵育過夜,TBST液洗膜,HRP標記的二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h,洗滌,曝光顯影,用ImageJ軟件分析圖像,以β-actin為內參,相應蛋白條帶灰度值/β-actin表示C-Fos、C-Jun相對表達量。

1.9反轉錄(RT)-PCR檢測白三烯受體(CysLT1-R)和CysLT2-R基因mRNA的表達 取大鼠鼻黏膜組織,用Trizol試劑提取總RNA,制成勻漿后加100 μl氯仿,搖勻后低速離心15 min,洗滌后提取總RNA,按照反轉錄試劑盒說明書,取1 μg總RNA逆轉錄后取得互補DNA,以β-actin為內參,用RT-PCR分別擴增CysLT1-R、CysLT2-R基因,設置反應體系,反應條件為80 ℃ 5 min,90 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,75 ℃ 延伸30 s,共40個循環。基因相對表達量=2-ΔΔCt,△Ct=Ct(目的基因)-Ct(β-actin)。CysLT1正向：5′-TCTCCGTTTGTGGGTTTCT-3′,反向：5′-TATAAGGC ATAGGTGGTG-3′;CysLT2正向：5′-AG CGTTAGGCATAAAGGGT-3′,反向：5′-CAAGTGTAGTAGGCTAG TA-3′;β-actin正向：5′-CCTACCATTGACGGTGATGC-3′,反向：5′-TACGGTCTTAATCTTCGAATC-3′。

1.10統計學方法 采用GraphPad Prism8.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組鼻黏膜病理組織HE染色 A組鼻黏膜結構及組織生長良好,無EOS血管浸潤、血腫等不良反應;B組與C低組鼻黏膜內部組織伴有明顯大量EOS浸潤產生及黏膜上皮損傷脫落,黏膜下腺體增生和血管擴張充血現象;C中組與D組鼻黏膜仍有部分腫脹及嗜酸性粒細胞,仍有炎性浸潤現象;C高組鼻腔黏膜中仍有少量水腫和輕度血管擴張現象,且EOS浸潤明顯降低,見圖1。

圖1 各組鼻黏膜病理組織(HE染色,×200)

2.2各組血清中IL-4、TNF-α、IgE、HIS水平 與A組相比,B組血清中IL-4、TNF-α、IgE、HIS水平明顯增高(P<0.05);與B組比較,C中組上述指標明顯降低(P<0.05);與C中組相比,C高組上述指標明顯降低(P<0.05)。與C高組比較,D組上述指標明顯增高(P<0.05);B組與C低組無明顯差異(P>0.05),C中組與D組比較無明顯差異(P>0.05),見表1。

表1 各組血清中IL-4、TNF-α、IgE、HIS水平及鼻黏膜組織中EOS細胞表達比較

2.3各組鼻黏膜組織中EOS細胞 與A組比較,B組鼻黏膜組織中EOS細胞明顯增多(P<0.05);與B組比較,C中組鼻黏膜組織中EOS細胞明顯減少(P<0.05);與C中組比較,C高組鼻黏膜組織中EOS細胞明顯減少(P<0.05);與C高組比較,D組鼻黏膜組織中EOS細胞明顯增多(P<0.05);B組與C低組無明顯差異(P>0.05),C中組與D組無明顯差異(P>0.05),見表1。

2.4各組鼻黏膜組織中CysLT1和CysLT2受體mRNA表達 與A組比較,B組鼻黏膜組織中CysLT1和CysLT2 mRNA表達明顯升高(P<0.05);與B組比較,C中組上述指標明顯降低(P<0.05);與C中組比較,C高組上述指標明顯降低(P<0.05);與C高組比較,D組上述指標明顯增高(P<0.05);B組與C低組無明顯差異(P>0.05),C中組與D組無明顯差異(P>0.05),見表2。

表2 各組鼻黏膜組織中C-Fos、C-Jun蛋白及CysLT1和CysLT2 mRNA表達比較

2.5各組鼻黏膜組織中C-Fos、C-Jun蛋白表達 與A組比較,B組鼻黏膜組織中C-Fos、C-Jun蛋白表達明顯升高(P<0.05);與B組比較,C中組上述指標明顯降低(P<0.05);與C中組比較,C高組上述指標表達明顯降低(P<0.05);與C高組比較,D組上述指標明顯升高(P<0.05);B組與C低組無明顯差異(P>0.05),C中組與D組無明顯差異(P>0.05),見表2、圖2。

圖2 各組鼻黏膜組織中C-Fos、C-Jun蛋白表達

3 討 論

AR的產生常表現為呼吸區的鼻黏膜組織結構發生改變,包括細胞外基質的不斷聚積、杯狀細胞生化、黏膜纖毛上皮細胞和血管新生被破壞及黏膜下腺體增生等〔7〕。中醫認為,AR是由臟腑虛虧、風寒入體、正邪互克、肺氣阻塞、津水停聚、犯及鼻竅阻塞所致〔8〕。中藥玉屏風顆粒具有固表養氣,祛邪祛風等功效,臨床治療中常用于流感、免疫調節及反復性過敏病癥等〔9〕。

研究發現,炎癥遞質引發的免疫細胞合成、釋放及分解均參與了AR的發生發展〔10〕。本研究提示,玉屏風顆粒對AR大鼠血清中IL-4、TNF-α、IgE、HIS等具有一定抑制作用。目前認為,AR的產生是由致敏原接觸機體導致的,且由IgE所引發的HIS及纖維蛋白溶酶等相關介質大量釋放而引起的Ⅰ型變態反應,在過程中通過與多種免疫因子相結合而引發噴嚏、流涕等鼻炎反應〔11〕。相關研究發現,西藥氯雷他定作為長效三環類抗HIS藥物,具有起效快、療效較持久等特點,但停藥后疾病的復發率較高〔12〕。玉屏風顆粒可通過發揮中藥黃芪、白術等成分對免疫的雙向調節作用,在AR的治療中通過抑制炎癥釋放,改善由于炎性遞質傳遞所導致的毛細血管擴張、血管通透性增加等引起的多種過敏反應,從而改善機體的致敏狀態,在免疫調節中發揮疾病調節作用〔13〕。

EOS是AR中的炎癥細胞,也是重要的炎癥指標,在變態反應中EOS會產生脫顆粒現象,并通過釋放大量趨化因子和炎性細胞進而加重疾病反應。本研究提示,玉屏風顆粒對抑制AR大鼠鼻黏膜組織中EOS細胞活化具有積極作用。以往研究發現,在AR的發生過程中,EOS趨化因子使得血液中的炎性因子大量聚合,致使鼻腔中產生較多的分泌物及EOS細胞,并在炎性因子活化、細胞黏附、移行及趨化的同時擴張鼻黏膜血管,使機體處于致敏狀態并增加局部組織水腫〔14〕。中醫將AR歸為“鼻衄”范疇,其病理反應為肺部虛薄、氣虛不受、鼻損入竅,進而使得肺腑失固、竅內酸塞。因此,對于AR的治療應以補正固衛、益氣祛邪為主〔15〕。玉屏風顆粒中的防風、白芍、辛夷等可通過發揮抑制組胺和抗過敏介質、收縮鼻腔內血管黏膜及抑制肥大細胞脫顆粒等作用,繼而發揮AR的治療作用。續艷等〔16〕在研究中發現,防風、白芍可顯著降低AR大鼠鼻分泌物EOS數量。可見在AR治療中,玉屏風顆粒相關中藥成分抑制B細胞合成過敏原特異性免疫球蛋白,緩解副交感神經興奮導致的腺體分泌、黏膜充血的同時,阻斷免疫活性細胞和細胞因子所致的EOS惡性增長和鼻黏膜炎性反應。

以往研究發現,CysLTl、CysLT2受體對增加血管通透性,增強心肌缺血再灌注損傷等具有關鍵作用,并可參與包括鼻咽炎等呼吸系統炎癥疾病的發生發展過程之中。本研究提示,玉屏風顆粒對抑制AR大鼠鼻黏膜組織中CysLT1和CysLT2 mRNA增長具有積極作用。相關研究表示,當機體與變應原接觸時可誘導鼻腔區域的EOS及肥大細胞脫顆粒活化,并通過釋放白三烯等炎性介質對鼻黏膜的感覺神經末梢及興奮副交感神經等產生刺激,引起鼻癢、流涕及噴嚏頻繁等過敏反應〔17〕。李泳文等〔18〕研究發現,玉屏風顆粒在抑制過敏原特異性IgE合成的同時也阻斷了白三烯、前列腺素及Th2 細胞因子等多種炎性介質的進入從而降低鼻塞、流涕等過敏反應。氯雷他定雖也能在一定程度上降低HIS H1受體和肥大細胞等釋放白三烯,但其作用效果仍低于玉屏風顆粒。

C-Fos、C-Jun為早期的即刻反應基因,能夠參與有關基因的調控和疾病的表達,且C-Fos蛋白并不能直接與DNA相結合,而是與C-Jun聯合構成異二聚體發揮效用。本研究提示,玉屏風顆粒可能對降低AR大鼠鼻黏膜組織中C-Fos、C-Jun蛋白表達具有一定影響。Gui等〔19〕研究表示,藥物抗AR作用機制可能與AP-1、TNF-α等因素有關。在AR中TLR可能在受到病原體的刺激后,通過激活多個信號傳導通路及免疫活性細胞誘導相關基因的表達,參與體內炎癥及免疫反應的發生發展〔20〕。黃芪可雙向調節機體的免疫、改善毛細血管通透性等功效發揮抗病毒和抑菌效用〔21〕。李承德〔22〕在相關研究中表示,黃芪能夠使大鼠海馬磷酸化的c-Fos和c-Jun水平顯著下降,并有改善炎癥因子的作用。推測玉屏風顆粒治療AR可能是通過調節炎癥途徑的關鍵轉錄因子、生長因子等的分泌,增加血清中Ig含量,進而在機體免疫調節中發揮抑制AP-1及其下游因子的釋放和分泌IgE、IL-4、TNF-α等,起到解表祛風、共利鼻竅等抑制疾病的作用。

綜上,玉屏風顆粒對改善AR大鼠鼻黏膜組織重塑,調節其免疫應答反應,降低促炎因子及白三烯水平的作用機制可能是通過TLR9/AP-1等來實現的。但對于C-Fos、C-Jun在組織重塑的具體效果仍有待進一步研究。且在考慮藥物成本及有效性、安全性的同時,為達到臨床癥狀控制和改善病情反復的目的可以考慮使用玉屏風顆粒。