基于Caspase3探討余甘子葉提取物對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道高反應(yīng)、肺泡上皮細(xì)胞活性的影響及作用機(jī)制

張愛(ài)軍 劉淵勇 于麗君 馮平

(1唐山市第三醫(yī)院,河北 唐山 063000;2河北北方第一附屬醫(yī)院)

慢性阻塞性肺疾病(簡(jiǎn)稱慢阻肺)是一種以氣流受限為特征的進(jìn)行性肺部疾病,其起病緩慢,病程較長(zhǎng),早期通常沒(méi)有自覺(jué)癥狀,隨病程的發(fā)展可出現(xiàn)慢性咳嗽、咳痰、氣短、胸悶等癥,這對(duì)患者的日生活質(zhì)量造成了極大影響〔1〕。目前慢阻肺的確切病因尚不明確,但有研究表明,其與氣道炎癥密切相關(guān),而氣道炎癥通常會(huì)引起氣道高反應(yīng),從而使氣道阻力增大,進(jìn)而引發(fā)咳嗽、氣短、胸悶等癥狀,嚴(yán)重者可能會(huì)出現(xiàn)直接危及患者生命安全的寂靜肺,因此如何抑制氣道高反應(yīng)已經(jīng)成為目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)之一〔2〕。肺損傷在慢阻肺中極為常見(jiàn),嚴(yán)重者可導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征,甚至多器官衰竭,而有研究表明,慢阻肺肺損傷主要是由于炎性介質(zhì)等所引起的肺泡上皮細(xì)胞凋亡,其可導(dǎo)致肺屏障損傷,從而出現(xiàn)肺泡出血、肺間質(zhì)水腫及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)增加等現(xiàn)象,進(jìn)而導(dǎo)致肺部炎癥加重,最終促進(jìn)疾病發(fā)生、發(fā)展,故如何改善肺泡上皮細(xì)胞活性是目前臨床工作的重點(diǎn)之一〔3〕。而胱天蛋白酶(Caspase)3是凋亡過(guò)程重要的執(zhí)行者,是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路,其一旦被激活,蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)就會(huì)被啟動(dòng),從而放大凋亡信號(hào)通路,加速細(xì)胞凋亡,故其可能在慢阻肺的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色〔4〕。抗菌藥物是臨床慢阻肺最為常用的治療方式,但長(zhǎng)期使用可能導(dǎo)致免疫力下降,最終甚至可能導(dǎo)致肺部感染〔5〕。研究表明,中藥在治療慢阻肺方面療效顯著,因此受到愈來(lái)愈多的研究人員關(guān)注〔6〕。余甘子葉是我國(guó)傳統(tǒng)中藥,其具有廣泛的藥理作用,可健胃消食、化痰止咳、保肝解毒、清熱生津,此外其在抗菌方面也發(fā)揮著重要作用,因此被廣泛應(yīng)用于臨床治療中〔7〕。但其是否對(duì)慢阻肺具有治療作用尚不清楚,本文基于Caspase3探討余甘子葉提取物對(duì)慢阻肺大鼠氣道高反應(yīng)及肺泡上皮細(xì)胞活性。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物材料 本實(shí)驗(yàn)選取深圳華大基因股份有限公司提供的60只SPF級(jí)SD雄性大鼠,平均體質(zhì)量170～210 g,室溫生長(zhǎng),模仿晝夜交替,在常溫下進(jìn)行無(wú)菌飲食2 w,按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2實(shí)驗(yàn)材料 余甘子葉提取物(貨號(hào)：128,西安金綠有限公司);乙酰半胱氨酸顆粒(富露施,貨號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20030732,廣東百澳藥業(yè)有限公司);Caspase3抑制劑(Z-DEVD-FMK,貨號(hào)：HY-12466,MedChemExpress LLC);香煙發(fā)生器(型號(hào)：RC-200,上海玉研有限公司);脂多糖(貨號(hào)：FT031030,上海梵態(tài)有限公司);電子分析天平(型號(hào)：FA2004N,上海菁海有限公司);無(wú)創(chuàng)肺功能儀(型號(hào)：PLY,上海玉研有限公司)低溫冷凍離心機(jī)(型號(hào)：Medifriger-BL-S,北京金恒祥有限公司);蘇木素-伊紅(HE)染液(貨號(hào)：BIR615,北京博爾西有限公司);光學(xué)顯微鏡(型號(hào)：TS2009,河南云飛有限公司);TUNEL試劑盒(貨號(hào)：ATK00001,武漢益普有限公司);免疫組化試劑盒(貨號(hào)：YDDEF001,上海羽哚有限公司);Caspase3抗體(貨號(hào)：PL0403200,深圳豪地華拓有限公司)。

1.3建模 50只SPF級(jí)SD雄性大鼠,使用專門(mén)的煙霧暴露裝置,將大鼠放置在閉合的空間內(nèi),暴露于煙霧中30 d,然后腹腔注射脂多糖10 mg/kg,6 h后大鼠出現(xiàn)明顯咳嗽、胸悶氣短、呼吸困難等癥狀,視為建模成功,均造模成功。

1.4分組及給藥 50只建模成功的大鼠中隨機(jī)分為模型(B)組、富露施(C)組、余甘子葉提取物(D)組、Caspase3抑制劑(E)組、余甘子葉提取物+Caspase3抑制劑(F)組,每組10只,同時(shí)隨機(jī)選取10只正常大鼠作為正常對(duì)照(A)組,C組灌胃50 g/kg富露施,D組灌胃50 mg/kg余甘子葉提取物,E組灌胃10 μg/kg Z-DEVD-FMK,F組給予余甘子葉提取物聯(lián)合Z-DEVD-FMK,兩組均1次/d,持28 d,A、B組同期灌胃同體積生理鹽水。

1.5大鼠氣道高反應(yīng)檢測(cè) 建模完成后,對(duì)各組大鼠進(jìn)行氣道高反應(yīng)檢測(cè),首先連接好無(wú)創(chuàng)肺功能儀并定標(biāo),然后將大鼠放到體積描記箱中,用Buxco系統(tǒng)測(cè)定大鼠氣道阻力,嚴(yán)格按照程序操作步驟,最后通過(guò)信號(hào)采集器采集數(shù)據(jù)并記錄。

1.6標(biāo)本采集 氣道高反應(yīng)實(shí)驗(yàn)完成后,麻醉處死大鼠并稱重,然后取雙肺,電子天平稱重以計(jì)算肺體脂數(shù)(LBF),取大鼠右肺用干凈濾紙沾干右肺表面水分再次稱重,70 ℃烘箱烘干72 h稱重,用干濕重法測(cè)定肺含水量(LWC)。左肺組織固定48 h,常規(guī)石蠟包埋、切片,放入冰箱中密封保存。

1.7大鼠病理組織HE染色 取各組肺組織,流水沖洗,用無(wú)水乙醇浸泡5 min,95%的乙醇浸泡5 min,75%的乙醇浸泡5 min,蒸餾水洗滌2次,用蘇木素浸染15 min,蒸餾水沖洗30 min,用0.5%伊紅乙醇溶液染色3 min,蒸餾水洗滌后,脫水、透明、中性樹(shù)膠封片處理,光學(xué)顯微鏡觀察。

1.8TUNEL法檢測(cè)肺泡上皮細(xì)胞凋亡 取左肺組織切片浸入二甲苯中,脫去石蠟,將切片依次浸入絕對(duì)乙醇、95%乙醇、80%乙醇和去離子水中,每個(gè)液體中浸泡5 min,將切片放入蛋白酶K溶液中,浸泡10～20 min,用磷酸鹽緩沖液洗滌切片3次,每次約5 min,用TUNEL封閉液封閉切片,浸泡30 min,將切片轉(zhuǎn)移到TUNEL反應(yīng)液中,37 ℃浸泡1 h,將切片洗滌3次,每次5 min,用去離子水洗滌1次,每次5 min。將切片放入染色劑4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色20 min至半小時(shí),將切片放入去離子水中,輕輕晃動(dòng)幾次,然后放在紙巾上吸干余液,將切片置于顯微鏡載玻片上,在切片上方放置一個(gè)小滴無(wú)氧溶劑并覆蓋玻片,使用共聚焦顯微鏡觀察切片。

1.9免疫組化法檢測(cè)Caspase3蛋白表達(dá) 取各組肺組織,用二甲苯進(jìn)行兩次脫蠟,每次20 min,再用乙醇進(jìn)行梯度浸泡水化,沖凈并擦干后用過(guò)氧化氫溫室孵育10 min,PBS沖洗3次,用檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行微波熱修復(fù),2%BSA封閉30 min,加入稀釋的Caspase3一抗(1∶200),4 ℃過(guò)夜后洗膜;加入稀釋的生物素標(biāo)記的二抗(1∶200),37 ℃水浴30 min;洗膜后,用DAB進(jìn)行顯色,PBS洗滌3次,蘇木素復(fù)染后中性樹(shù)膠封片,光學(xué)顯微鏡觀察,計(jì)算機(jī)病理圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行半定量測(cè)定。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism8.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組氣道高反應(yīng) 與A組比較,B組氣道阻力明顯升高(P<0.05);與B組比較,C、D、E、F組氣道阻力明顯降低,且D組比C組降低顯著(P<0.05),E組與D組相比無(wú)明顯差異(P>0.05),F組比E組降低顯著(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 各組氣道阻力、LBF、LWC含量、凋亡率及肺組織caspase3蛋白表達(dá)比較

2.2各組LBF及LWC含量 與A組比較,B組LBF、LWC含量明顯升高(P<0.05);與B組比較,C、D、E、F組LBF、LWC含量明顯降低(P<0.05),且D組比C組降低明顯(P<0.05),E組與D組無(wú)明顯差異(P>0.05),F組比E組降低更顯著(P<0.05),見(jiàn)表1。

2.3各組肺泡上皮細(xì)胞凋亡結(jié)果 與A組相比,B組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05);與B組比較,C、D、E、F組細(xì)胞凋亡率明顯降低,且D組比C組降低顯著(P<0.05),E組與D組無(wú)明顯差異(P>0.05),F組比E組降低顯著(P<0.05),見(jiàn)表1、圖1。

圖1 各組細(xì)胞凋亡(TUNEL染色,×400)

2.4各組肺組織Caspase3蛋白表達(dá) 與A組相比,B組肺組織Caspase3蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05);與B組比較,C、D、E、F組肺組織Caspase3蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05),且D組比C組降低顯著(P<0.05),E組與D組無(wú)明顯差異(P>0.05),F組比E組降低顯著(P<0.05),見(jiàn)表1、圖2。

圖2 各組Caspase3蛋白表達(dá)(免疫組化,×200)

2.5各組肺組織HE染色 A組支氣管、肺泡正常完整,間質(zhì)均勻無(wú)充血,未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);B組支氣管上皮破壞程度減少,可見(jiàn)明顯水腫出血,肺間質(zhì)明顯增厚,且有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn);與B組比較,C、D、E、F組病理形態(tài)明顯改善,見(jiàn)圖3。

圖3 各組肺組織結(jié)構(gòu)(HE染色,×200)

3 討 論

慢阻肺是在全球范圍內(nèi)非常常見(jiàn),是導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因之一,根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù),全球有超過(guò)3億人患病,每年因其死亡人數(shù)約為300萬(wàn)人,故及早發(fā)現(xiàn)和治療至關(guān)重要〔8〕。而近年來(lái)隨著中醫(yī)治療不斷更新和發(fā)展,中醫(yī)治療慢阻肺在臨床上也取得了良好效果成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)〔9〕。

本研究說(shuō)明,余甘子葉提取物可顯著改善慢阻肺大鼠氣道高反應(yīng)。富露施是臨床上治療慢阻肺等由濃稠黏液分泌物過(guò)多導(dǎo)致的呼吸道疾病的常用藥物,其主要成分為N-乙酰半胱氨酸,其在化痰、抗氧化等方面發(fā)揮著重要作用,因此本文選其作為對(duì)照組〔10〕。余甘子葉是重要的傳統(tǒng)民族藥,已被載入多版《中國(guó)藥典》,其主治感冒發(fā)熱、咳嗽、咽喉痛、白喉、煩熱口干、消化不良等癥,且有研究表明,余甘子葉在體內(nèi)外具有廣泛的抗菌作用,故近年來(lái)廣受中醫(yī)藥學(xué)者所關(guān)注〔11〕。氣道高反應(yīng)是氣管、支氣管的一種異常敏感狀態(tài),通常是由進(jìn)入氣道的一些物質(zhì)或反應(yīng)原刺激所引起,其極易引發(fā)各種呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥,從而導(dǎo)致氣道阻塞 、肺功能急劇下降〔12〕。而包括慢阻肺在內(nèi)的很多臨床疾病都會(huì)表現(xiàn)出氣道反應(yīng)性增高,這使黏液不但大量產(chǎn)生和分泌,還較難被清除,從而導(dǎo)致氣道狹窄,氣流受限,進(jìn)而引發(fā)肺實(shí)質(zhì)破壞,加重期引起血管壁增厚,最終可能會(huì)引發(fā)肺心病、心力衰竭等疾病,因此有效改善氣道高反應(yīng)對(duì)提高患者生活質(zhì)量具有深遠(yuǎn)意義〔13〕。對(duì)于慢阻肺大鼠,余甘子葉提取物可能是通過(guò)抑制支氣管平滑肌收縮反應(yīng),來(lái)抑制支氣管痙攣、氣道分泌物增加,從而有效抑制炎癥細(xì)胞從血管內(nèi)釋放、聚集,抑制氣道重塑、抑制氧自由基的合成,進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)、抑制氧化應(yīng)激,達(dá)到改善氣道損傷的目的,最終有效治療疾病。陳安〔14〕研究顯示,余甘子合劑對(duì)慢阻肺急性加重期患者具有顯著療效,可明顯改善其臨床癥狀體征、肺功能及氧化應(yīng)激,這與本文結(jié)果類似。

本研究發(fā)現(xiàn),余甘子葉提取物可以有效改善慢阻肺大鼠的肺損傷狀況。研究發(fā)現(xiàn),慢阻肺與肺部損傷密切相關(guān),長(zhǎng)期吸入煙草煙霧和其他有害氣體和顆粒物會(huì)引起氣道和肺組織的損傷和炎癥反應(yīng),這些損傷和炎癥會(huì)導(dǎo)致氣道壁增厚、氣道黏液分泌增多、氣道平滑肌收縮、肺組織纖維化等,最終導(dǎo)致氣道狹窄和氣體交換障礙,因此如何抑制炎癥反應(yīng),改善肺損傷情況在治療慢阻肺方面尤為重要〔15〕。而當(dāng)肺受到損傷時(shí),肺部炎癥可以使肺組織中的毛細(xì)血管壁變得通透性增加,使液體從血液中滲出到肺泡和間質(zhì)空間,導(dǎo)致肺水含量的增加,肺水含量的增加會(huì)導(dǎo)致肺部功能的損害和呼吸困難,故及時(shí)識(shí)別和處理肺水積聚是重要的管理措施之一〔16〕。對(duì)于慢阻肺大鼠,余甘子葉提取物可能是通過(guò)抑制相關(guān)炎癥因子及信號(hào)通路,來(lái)抑制應(yīng)激的產(chǎn)生,從而抑制炎癥滲出、減少損傷、并降低微血管通透性,進(jìn)而使液體平衡恢復(fù)、減輕炎細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象,最終達(dá)到改善疾病的目的。王文迪等〔17〕研究顯示,對(duì)于煙霧吸入所致急性肺損傷大鼠,N-乙酰半胱氨酸具有顯著療效,可有效減輕其肺損傷,并減輕大鼠肺水腫及炎癥反應(yīng),這與本文結(jié)果類似。

本研究說(shuō)明,余甘子葉提取物可有效改善慢阻肺大鼠肺泡上皮細(xì)胞活性,抑制Caspase3表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),肺泡上皮細(xì)胞和肺損傷與之間存在著重要的關(guān)系,其活性的改變是肺損傷發(fā)生、發(fā)展的主要因素〔18〕。凋亡是一種正常的細(xì)胞死亡過(guò)程,通過(guò)這種方式細(xì)胞可以主動(dòng)地從組織中被清除,而不會(huì)引起炎癥反應(yīng),但在肺損傷或疾病發(fā)生時(shí),肺泡上皮細(xì)胞凋亡可能會(huì)增加,凋亡的調(diào)節(jié)失衡可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡和炎癥反應(yīng)的進(jìn)一步加重,從而使慢阻肺癥狀加重,故其變化是反映肺泡上皮細(xì)胞活性的有效指標(biāo)〔19〕。Caspase3參與調(diào)控和執(zhí)行細(xì)胞凋亡程序,其激活后可進(jìn)一步激活其他Caspase酶,形成一個(gè)級(jí)聯(lián)的酶活動(dòng)網(wǎng)絡(luò),最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡,故Caspase3的活性調(diào)節(jié)對(duì)于維持正常的細(xì)胞生存和細(xì)胞凋亡的平衡至關(guān)重要〔20〕。而對(duì)于慢阻肺大鼠,余甘子葉提取物可能是通過(guò)抑制其上游信號(hào)通路的激活,來(lái)抑制Caspase3的轉(zhuǎn)錄及翻譯,從而抑制半胱氨酸蛋白酶類的級(jí)聯(lián)激活、抑制炎性細(xì)胞聚集與活化,進(jìn)而抑制神經(jīng)氨酸酶、細(xì)胞色素c、促凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白(Bax)、Bcl-2相互作用細(xì)胞凋亡促進(jìn)因子(Bak)等的相互作用、抑制細(xì)胞凋亡等相關(guān)因子的產(chǎn)生,最終達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡,有效改善疾病的目的。趙朝華等〔21〕研究發(fā)現(xiàn),Caspase3在慢阻肺中表達(dá)顯著上升,給予阿奇霉素治療后,可改善大鼠肺組織形態(tài)和纖維化并抑制其氧化應(yīng)激及Caspase3表達(dá),這與本文結(jié)果類似。

綜上,余甘子葉提取物可有效改善慢阻肺大鼠氣道高反應(yīng)及肺泡上皮細(xì)活性,其作用機(jī)制可能與抑制Caspase3表達(dá)有關(guān)。