貝那普利對C-BSA誘導膜性腎病大鼠足細胞的影響

冷琳 劉文佳 吳蔚樺 丁文飛 王玉潔 曹靈

(西南醫科大學附屬醫院腎病內科 四川省腎臟疾病臨床醫學研究中心,四川 瀘州 646000)

膜性腎病(MN)是全世界成人特發性腎病綜合征的最常見原因。在中國過去的十年間,MN的發病率每年增加13%,已經超過了免疫球蛋白(Ig)A腎病的趨勢〔1〕。陽離子化牛血清白蛋白(C-BSA)誘導的MN模型已在多種動物身上得到了驗證〔2～4〕,其和人類MN在免疫機制上有共通之處〔3,5,6〕,但在其他機制方面還需要更多的證據。貝那普利是血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)類藥物,是全球改善腎臟病預后組織(KDIGO)發布的臨床實踐指南中治療特發性MN藥物之一〔7,8〕。ACEI可降低血壓和蛋白尿,預防腎臟纖維化,減緩腎病患者腎功能下降,但其腎臟保護作用的具體機制尚未被完全闡明。足細胞凋亡是MN的重要發病機制之一。足細胞病變中機械壓力或生物力學應變可導致血管緊張素(Ang)Ⅱ過表達,增加轉化生長因子(TGF)-β的表達及活性〔9〕,通過TGF-β1-P38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、TGF-β1-Smads等多種信號通路,使足細胞凋亡、脫落、上皮-間充質轉化等,啟動腎小球硬化的發展〔10〕。本研究探討貝那普利對C-BSA誘導MN大鼠足細胞的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級、體質量(140±20)g的雄性SD大鼠24只,由西南醫科大學實驗動物中心〔動物許可證號：SCXK(川)2015-030〕提供,西南醫科大學實驗動物倫理委員會批準(動物倫理編號20190100006)。

1.2試劑與儀器 貝那普利購自北京諾華制藥;AngⅡ酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海橋社;免疫組化檢測試劑盒和二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒、TGF-β1多克隆抗體、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2單克隆抗體、Bcl-2相關X蛋白(Bax)單克隆抗體購自北京中杉金橋,p38MAPK多克隆抗體、腎母細胞瘤悼蛋白(WT)1多克隆抗體購自巴傲得生物科技有限公司,兔抗鼠IgG抗體購自北京Bioss公司;脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物。光學顯微鏡和熒光顯微鏡為日本Olympus;圖像分析軟件來自美國伯樂。

1.3實驗動物模型建立 將24只雄性SD大鼠適應性喂養1 w后隨機分為正常對照組、模型組、貝那普利干預組、貝那普利對照組,每組6只。正常對照組、貝那普利對照組不預免疫、不造模,模型組、貝那普利干預組參照改良Border方法制作大鼠MN模型〔4〕,預免疫1 w后開始正式免疫,每只大鼠隔日尾靜脈注射C-BSA(20 mg/kg),連續4 w,檢測動物尿蛋白均>40 mg/24 h,初步判定造模成功。自正式免疫起,模型組、貝那普利干預組每日予以貝那普利(10 mg/kg)灌胃,而正常對照組、貝那普利對照組每日予以1 ml生理鹽水代替,連續6 w。正式免疫后第5周末收集24 h尿液。各組大鼠于正式免疫后第6周末殺檢,收集腎臟和血清。

1.4血清指標檢測 尿標本和血標本于西南醫科大學附屬醫院檢驗科,用全自動生化儀行血清白蛋白(Alb)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)檢測,免疫散射速率比濁法測定24 h尿蛋白濃度(24 h UTP)。

1.5觀察腎臟病理改變 用4%多聚甲醛固定腎組織,脫水、透明并浸蠟,制成2 μm厚的石蠟切片。常規蘇木素-伊紅(HE)染色、過碘酸六胺銀(PASM)染色和Masson染色觀察腎臟病理改變。

1.6TUNEL法檢測腎組織細胞凋亡 常規對5 μm石蠟切片進行脫蠟和胃蛋白酶消化。在清潔和干燥切片后,將TUNEL檢測液滴添加到切片中,并將切片在37 ℃下無光培養60 min。然后將過氧化物酶標記的抗地高辛抗體滴在切片上反應30 min。DAB顯色、HE染色后,立即用蒸餾水沖洗,脫水,透明中性膠封。結果在光學顯微鏡下進行觀察和拍照。如果細胞核呈棕黃色或棕褐色,則為陽性結果。在高倍(×400)視野下,在每個切片中隨機觀察到10個非重復和非硬化的腎小球。計算單個腎小球中TUNEL陽性細胞的比例(陽性細胞數/有核細胞總數)作為腎小球凋亡指數(AI)。

1.7ELISA測定腎組織勻漿AngⅡ含量 取-80 ℃保存的腎組織4 ℃解凍后切塊。勻漿后加入1.0 ml磷酸鹽緩沖液(PBS),15 000 r/min離心20 min,取上清,按試劑盒說明書操作。在酶標儀上讀取每孔450 nm波長下的OD值,根據樣品的OD值計算樣品的濃度。

1.8免疫組化法檢測腎組織TGF-β1、P38MAPK、Bax、Bcl-2、WT1蛋白表達 大鼠腎組織經固定、脫水、透明、石蠟包埋后,5 μm連續切片,60 ℃烤片,經脫蠟、水化、抗原修復后滴加一抗,4 ℃孵育過夜后加入二抗孵育,DAB室溫顯色。流水沖洗后蘇木素復染,1%稀鹽酸分化,飽和碳酸鋰返藍。上述切片用脫水、透明和中性膠密封,并在光學顯微鏡下觀察和拍攝結果。采用Image-pro plus6.0病理彩色圖像分析處理系統對結果行半定量分析。

1.9統計學處理 采用SPSS13.0軟件進行方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1各組24 h UTP及血清指標比較 正常對照組、貝那普利對照組24 h UTP無明顯差別(P>0.05);與正常對照組相比,模型組、貝非普利干預組24 h UTP、BUN、Scr水平明顯增加、Alb水平明顯下降(P<0.05);與模型組相比,貝那普利干預組Alb、Scr水平明顯升高(P<0.05),見表1。

表1 各組24 h UTP、Alb、Scr、BUN水平及AI比較

2.2腎形態學觀察結果 正常對照組、貝那普利對照組腎組織無病理形態學改變。模型組、貝那普利干預組HE染色可見腎小球明顯腫大,腎小球基底膜(GBM)彌漫增厚,毛細血管袢受壓,管腔狹窄甚至閉塞,球囊腔狹窄甚至粘連,系膜細胞和基質增生,部分腎小管上皮細胞腫脹,腎間質膠原纖維明顯沉積,嚴重纖維化;Masson染色顯示,系膜區和腎間質藍色陽性物質增多,系膜區和腎間質增寬;PASM染色顯示腎小球基底膜彌漫性增厚,部分腎小球出現典型的“釘突”形成和“假雙軌”征。貝那普利干預組病理損害程度較模型組有所減輕,見圖1。

圖1 各組腎組織病理形態(×400)

2.3腎組織中TGF-β1、P38MAPK、Bax、Bcl-2、WT-1的表達情況 第6周末正常對照組、貝那普利對照組在腎小球臟層分布區域可見TGF-β1、P38MAPK、Bax少量表達,Bcl-2、WT-1有較多表達。正常對照組、貝那普利對照組腎小球TGF-β1、P38MAPK、Bax、Bcl-2、WT-1表達無明顯差異(P>0.05)。與正常對照組相比,模型組和貝那普利干預組腎小球TGF-β1、P38MAPK、Bax表達明顯增加,Bcl-2、WT-1表達明顯減少(均P<0.05);與模型組相比,貝那普利干預組腎小球TGF-β1、P38MAPK、Bax表達明顯減少,Bcl-2、WT-1表達明顯增加(均P<0.05),見圖2、表2。

圖2 各組腎組織TGF-β1、P38MAPK、Bax、Bcl-2、WT-1表達(免疫組化染色,×400)

表2 各組腎組織勻漿AngⅡ含量、腎組織TGF-β1、P38MAPK、Bax、Bcl-2、WT-1表達

2.4各組腎組織勻漿中AngⅡ含量的變化 正常對照組、貝那普利對照組腎組織勻漿中有AngⅡ表達,表達無明顯差異(P>0.05)。模型組、貝那普利干預組腎組織勻漿中AngⅡ含量上升。與正常對照組相比,模型組、貝那普利干預組AngⅡ含量均明顯增加(P<0.05);與模型組相比,貝那普利干預組AngⅡ含量明顯減少(P<0.05),見表2。

2.5腎組織中細胞凋亡的動態變化 TUNEL染色結果顯示正常對照組、貝那普利對照組腎小球未見細胞凋亡,腎小球AI無明顯差異(P>0.05);模型組、貝那普利干預組腎小球臟層區域可見凋亡細胞明顯增多,見圖3。與正常對照組相比,模型組、貝那普利干預組腎小球AI均明顯增加(P<0.01);與模型組相比,貝那普利干預組各腎小球AI明顯減少(P<0.05),見表1。

圖3 各組腎小球細胞(TUNEL染色,×400)

3 討 論

MN是成人腎病綜合征的常見病因〔11〕,常常表現為大量蛋白尿,臨床可以體現為腎病綜合征。一個理想的模型將有助于了解MN的發病機制,從而提高診斷和治療。早在20世紀有學者發現C-BSA免疫的兔產生了IgG和C3的上皮下沉積,提出了抗原電荷可能是上皮下沉積形成的關鍵因素〔2〕。有研究發現,在雙轉基因的C-BSA誘發腎病的小鼠中,Th2 細胞與高膽固醇血癥和蛋白尿顯著相關〔3〕。同時在MN 患者中,Th17細胞因子刺激產生的炎癥與MN患者血栓形成與復發密切相關〔6〕。Debiec等〔5〕在MN患者上皮下免疫沉積物中發現牛血清白蛋白,表明C-BSA與帶負電荷的腎小球毛細血管壁結合,隨后形成原位免疫復合物,C-BSA可能是兒童MN的主要致病靶點之一。因此,C-BSA 誘導的MN 模型可以較好地模擬人類MN 的發病機制,而不同的C-BSA劑量在其中至關重要。根據本課題組前期研究中采用改良Border方法,使用低中高不同劑量C-BSA,發現高劑量組能更好地表現MN病理特點〔4〕。本實驗參照改良Border方法用大劑量C-BSA成功構建MN模型,與前期研究相一致。

AngⅡ具有促血管收縮、腎小管水鈉重吸收及細胞增殖等重要生理功能,是腎素-Ang系統的重要組成成分。早期即有報道指出,在MN病人腎臟組織中發現AngⅡ過表達,且可能參與TGF-β的上調〔12〕。亦有報道指出,在5/6腎切除術大鼠模型中,隨著腎組織中AngⅡ生成的減少,TGF-β1 mRNA表達量也隨之減少〔13〕。目前較多研究表明,TGF-β1信號傳導是各種足細胞損傷的關鍵介體,而P38MAPK是其信號通路的樞紐,TGF-β1可調控P38MAPK導致腎臟的病理損傷。已有研究證實,TGF-β1可能是糖尿病腎病進展的關鍵因素,在體內外實驗中,咪唑聚酰胺類化合物(PI)靶向TGF-β1治療可促進系膜細胞生長,改善足細胞損傷,改善腎小球和間質變性〔14〕。本實驗說明,C-BSA誘導MN模型與人類MN在除了免疫方面以外的其他機制上也有一定的相似之處,為其模擬人MN可靠性提供了更多的實驗依據。

貝那普利是臨床常用的ACEI類降血壓藥物。大量研究顯示〔15～17〕,除通過血流動力學發揮作用外,ACEI還可通過抗凋亡、抗氧化應激、抗炎癥、抗纖維化等機制發揮作用,但ACEI類藥物在MN中具體的作用靶點尚不完全清楚,因此確定ACEI發揮腎臟保護作用的可能機制對于深入了解MN的治療是十分必要的。貝那普利可降低DN大鼠及高糖誘導的RMCs中NF-κB、TGF-β、TRPC6水平,抑制高糖誘導的RMCs凋亡,改善DN大鼠腎功能,減輕腎臟損傷〔18〕。ACEI抑制AngⅡ的產生,降低TGF-β的表達和明顯炎癥反應的發生,從而抑制IL-33/sST2減少風濕性心臟病纖維化的進展〔19〕,也可能通過激活核因子E2相關因子(Nrf2)的表達或抑制活性氧(ROS)介導的氧化應激對NOX4的反應發揮抗肝纖維化作用〔20〕。在狼瘡小鼠模型中,卡托普利可降低腦、脾和腎Ⅰ型干擾素應答基因的表達,降低循環和組織干擾素-α水平,降低小膠質細胞活化和減少抑郁樣行為,還能降低血漿中的自身抗體水平及腎和腦中的免疫復合物沉積發揮治療作用〔21〕。本研究結果表明,貝那普利很可能通過抗足細胞凋亡對MN大鼠腎臟發揮保護作用,再次證明了貝那普利預防或治療MN的潛力。

貝那普利可抑制AngⅡ的經典生成途徑,推測貝那普利可能通過減少AngⅡ生成來抑制TGF-β1相關信號通路發揮作用。在糖尿病大鼠模型中證實使用AT1R拮抗劑能有效地降低腎小球TGF-β1的生成量〔22〕。本研究結果表明,貝那普利很可能通過減少AngⅡ,進而抑制TGF-β1/P38MAPK信號通路對MN腎臟發揮保護作用。但有研究發現,在糖尿病腎病小鼠中,缺乏Ca2+結合蛋白Swiprosin-1可激活TGF-β1/P38MAPK信號通路,從而降低線粒體依賴途徑導致的足細胞凋亡,同時在體外高糖誘導的MPC-5足細胞中P38MAPK靶向敲低后,細胞凋亡增加〔23〕。因此,TGF-β1/P38MAPK信號通路在不同條件影響下與足細胞凋亡的關系還需要進一步研究。

綜上,C-BSA誘導的MN大鼠與人MN在免疫方面以外的其他發病機制上具有一定的相似之處,為構建和完善理想的MN實驗模型增加了更多的實驗基礎。貝那普利可以減輕C-BSA誘導的MN大鼠足細胞損傷,發揮腎臟保護作用,其機制與抑制TGF-β1/P38MAPK信號通路活性有關,這為研究ACEI類藥物對MN治療機制提供了更多的實驗依據。ACEI類藥物在臨床應用于許多疾病的治療,但其作用機制有待深入研究。