miR-126對七氟烷麻醉致老齡大鼠認知功能障礙的影響及機制

朱金有 劉振華 鐘瑞逢 李軍軍 黃小亮

(贛州市人民醫(yī)院麻醉科,江西 贛州 341000)

研究顯示,約41.4%的老年患者出現術后認知功能障礙(POCD),表現為記憶受損、焦慮、精神錯亂及人格改變等,不僅對患者的生活質量造成嚴重影響,而且還增加社會醫(yī)療保健負擔〔1,2〕。雖然目前臨床上POCD無有效的防治措施,且發(fā)病機制尚不明確,但有研究表明,七氟烷等常用的吸入用麻醉藥品是誘發(fā)老年患者POCD的重要原因〔3,4〕。微小RNA(miR)作為一種高度保守的非編碼RNA,其在降解或翻譯后調控靶基因的表達,廣泛參與認知功能障礙的多個環(huán)節(jié)〔5〕。miR-126的編碼基因位于染色體9q34.3,屬于miRNA家族的成員,近年來發(fā)現其與細胞增殖分化、腫瘤等過程密切相關〔6〕。有研究顯示,miR-126外泌體可促進腦卒中大鼠的功能恢復,增強神經功能及抑制神經炎癥反應,起到神經保護的作用〔7〕。但miR-126能否減輕七氟烷麻醉致老齡大鼠認知功能障礙尚不清楚。本研究旨在觀察miR-126對七氟烷麻醉致老齡大鼠認知功能障礙的影響及相關作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性SD大鼠65只,體質量570～680 g,20月齡,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司〔許可證編號：SCXK(京)2012-0001〕,動物飼養(yǎng)于SPF級動物房,相對濕度為40%～60%,溫度22～28 ℃,光照時間每日12 h,晝夜循環(huán),正常飼喂。

1.2主要試劑及儀器 miR-126激動劑(miR-126 agonist)及激動劑對照(agonist NC)購自上海銳博生物科技有限公司;七氟烷(批號：20031701)購自上海恒瑞醫(yī)藥有限公司;白細胞介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自南京建成生物工程有限公司;Tunel染色試劑盒購自賽默飛世爾科技有限公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度定量試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;Reverse Transcription System試劑盒和SYBR PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒購自TaKaRa生物技術有限公司(日本);磷脂酰肌醇3激酶(PI3K,p110α亞基)、p-蛋白激酶B(AKT,Ser473)、Akt、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、裂解凋亡蛋白酶(Cleaved-casapse)-3 和GAPDH等抗體購自美國Abcam公司;小動物麻醉機(型號：R550IE)購自深圳瑞沃德生命科技有限公司;Morris水迷宮(型號：XR-XM101)購自上海欣軟信息科技有限公司;聚合酶鏈反應(PCR)儀(型號：Mastercycler?X50)購自Eppendorf;多功能酶標儀(型號：spectramax iD3)購自美谷分子儀器(上海)有限公司。

1.3模型建立及分組 建模前采用Morris水迷宮實驗剔除有認知功能障礙的大鼠,將60只無認知功能障礙的大鼠隨機分成對照(Control)組、七氟烷麻醉(Model)組、miR-126激動劑對照(agonist NC)組和miR-126激動劑(agonist)組,每組15只。除Control組外,其他各組均采用3%七氟烷麻醉4 h建立麻醉模型〔8〕,即連接小動物麻醉機,調節(jié)七氟烷揮發(fā)罐至吸入濃度為3%,麻醉時間4 h。agonist組和agonist NC組于吸入七氟烷麻醉前1 d,經側腦室注射分別10 nmol/kg miR-126 agonist和agonist NC,各5 μl;Control組和Model組相同部位分別注射等量溶劑。麻醉期間監(jiān)測大鼠血氧飽和度(SpO2)和脈率,結束后將大鼠放回籠中飼養(yǎng)。

1.4Morris水迷宮實驗 于建模后第2天進行Morris水迷宮實驗,將水迷宮根據4個等距離點分為4個象限,于第1象限距離池壁20 cm處放置一透明平臺,該平臺低于水面2 cm。將大鼠分別從東、南、西、北4個方向朝池壁放入水中,記錄120 s內第1次找到平臺并停留10 s的時間記為逃避潛伏期,若120 s后未找到平臺,則將大鼠引導至平臺并站立10 s,記錄其逃避潛伏期為120 s。每日訓練4次,訓練間隔時間大于4 min,共訓練5 d,選取第5天內的平均逃避潛伏期時間作為最終逃避潛伏期。于第6天進行,將平臺撤去,分別記錄120 s內大鼠停留于原平臺象限的時間及穿過原平臺的次數。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色 Morris水迷宮實驗結束后,將大鼠斷頸處死,迅速分離海馬組織,根據實驗需要進行保存。取部分海馬組織投入10%甲醛溶液中固定,經脫水機脫水后包埋成蠟塊,再進行切片(4 μm),制成石蠟切片。石蠟切片經脫蠟、復水后進行HE染色,中性樹脂封片。于光學顯微鏡下隨機選取3個視野拍照,并觀察海馬組織的病理學變化。

1.6Tunel染色 海馬組織石蠟切片經脫蠟、水化后,采用過氧化氫(H2O2)封閉抗體,蛋白酶消化后進行保濕,依據Tunel試劑盒說明書,取DIG-d-UTP 1 μl和TdT 1 μl與緩沖液均勻混合,于37 ℃濕盒內,避光孵育2 h;磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,滴加Streptavidin-辣根過氧化物酶(HRP)工作液,避光孵育30 min;PBS洗滌3次,滴加二氨基聯苯胺(DAB)顯色液孵育10 min;PBS洗滌3次,蘇木素復染,梯度酒精復水、二甲苯透明,中性樹脂封面,光學顯微鏡觀察。高倍鏡下隨機選取5個視野觀察,對棕色著色的陽性細胞(凋亡細胞)進行統(tǒng)計。凋亡率(AI)=凋亡細胞/細胞總數×100%,取其平均值。

1.7ELISA檢測 取凍存的海馬組織,加入適量蛋白提取緩沖液,采用勻漿器將其研磨粉碎成勻漿液,4 ℃、3 500 r/min離心10 min,取上清,于-80 ℃冰箱保存。根據ELISA試劑盒說明書操作,終止反應后,酶標儀檢測其吸光度,繪制樣品標準曲線并計算IL-1β、IL-6和TNF-α含量。

1.8實時熒光定量(qRT)-PCR檢測 取凍存的海馬組織,加入TRIzol試劑提取總RNA,測定RNA濃度與純度。采用Reverse Transcription System逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA,再以cDNA為模板采用SYBR PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒進行PCR擴增。PCR擴增體系：1 μl cDNA+0.5 μl上游引物+0.5 μl下游引物+10 μl Master Mix。miRNA內參為U6：上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;miR-126上游引物5′-UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG-3′,下游5′-TCGTACCGTGAGTAATAATGCG-3′。PCR條件為94 ℃變性30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,重復35個循環(huán)。根據公式2-ΔΔCt計算miR-126相對表達量。

1.9Western印跡檢測取凍存的海馬組織,加入適量細胞裂解液,采用勻漿器于冰上將其研磨30 min,再于4 ℃條件下3 500 r/min離心10 min,取上清,并采用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。取20 μg蛋白變性后上樣,行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉膜,5%脫脂牛奶中封閉1 h,TBST清洗3次,分別加入PI3K(p110α亞基)、p-AKT、AKT、Bax、Bcl-2、Cleaved-casapse-3 和GAPDH抗體(均為1∶1 000稀釋),于4 ℃搖床中孵育過夜,TBST清洗3次,加入二抗于常溫搖床中孵育1 h,TBST清洗3次,滴加電化學發(fā)光(ECL)底物顯色,掃描圖像。Image軟件分析蛋白質條帶的灰度值,目的蛋白相對表達水平為目的條帶與GAPDH條帶灰度值的比值。

1.10統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1各組認知功能比較 與Control組比較,Model組逃避潛伏期明顯延長、原平臺象限停留時間明顯縮短,穿越平臺次數明顯減少(P<0.05);與Model組比較,agonist組逃避潛伏期明顯縮短,原平臺象限停留時間明顯延長,穿越平臺次數明顯增加(P<0.05)。見表1。

表1 各組Morris水迷宮實驗結果比較

2.2各組海馬組織HE染色結果 Control組海馬組織無明顯異常;Model組及agonist NC組錐體細胞存在稀疏及缺失,神經元形態(tài)不規(guī)則,出現空泡化細胞及核濃縮;agonist組海馬神經元形態(tài)較規(guī)則,核固縮明顯減輕,邊界清晰,排列微松散。見圖1。

圖1 各組海馬組織(×200)

2.3各組海馬組織細胞凋亡 Control組、Model組、agonist NC組和agonist組海馬組織細胞凋亡率分別〔(4.1±0.5)%、(46.8±1.3)%、(45.9±1.2)%和(22.5±0.8)%〕,差異有統(tǒng)計學意義(F=98.347,P<0.001)。與Control組比較,Model組海馬組織細胞凋亡率顯著增加(P<0.05);與Model組比較,agonist組凋亡率顯著減少(P<0.05),而agonist NC組與Model組凋亡率無顯著差異(P>0.05)。見圖1。

2.4各組海馬組織中IL-1β、IL-6和TNF-α含量 與Control組比較,Model組海馬組織中IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著升高(P<0.05);與Model組比較,agonist組海馬組織中IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組海馬組織中IL-1β、IL-6和TNF-α含量、PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達

2.5各組海馬組織中miR-126表達水平Control組、Model組、agonist NC組和agonist組海馬組織中miR-126相對表達水平分別為1.01±0.05、0.13±0.04、0.15±0.03和3.25±0.19,差異有統(tǒng)計學意義(F=496.387,P<0.001)。與Control組比較,Model組海馬組織中miR-126相對表達水平顯著降低(P<0.05);與Model組比較,agonist組海馬組織中miR-126相對表達水平顯著增加(P<0.05)。

2.6各組海馬組織中PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達水平 與Control組比較,Model組海馬組織中PI3K(p110α亞基)、p-AKT/AKT和Bcl-2蛋白表達水平顯著降低,而Bax和Cleaved-casapse-3蛋白表達量顯著升高(P<0.05);與Model組比較,agonist組海馬組織中PI3K(p110α亞基)、p-AKT/AKT和Bcl-2蛋白表達量明顯升高,Bax和Cleaved-casapse-3蛋白表達量顯著降低(P<0.05)。見表2、圖3。

圖3 各組海馬組織中PI3K/AKT信號通路相關蛋白電泳

3 討 論

隨著年齡的增加,老年患者由于系統(tǒng)器官功能減退、代謝能力下降、手術創(chuàng)傷應激等因素,常常發(fā)生POCD〔9〕。七氟烷作為一種吸入麻醉藥,麻醉誘導和覺醒迅速且平穩(wěn),且不良反應少,在老年患者中廣泛應用〔10〕。然而有研究發(fā)現,應用七氟烷的老年麻醉患者在蘇醒期易發(fā)生躁動,患者術后心血管事件、術后循環(huán)不穩(wěn)定的發(fā)生風險明顯增加〔11〕。此外,由于對中樞膽堿能神經系統(tǒng)的抑制,容易發(fā)生POCD,阻礙了老年患者正常認知的恢復〔12〕。本研究提示,3%七氟烷麻醉4 h誘發(fā)老年大鼠認知障礙模型成功制備。

認知功能作為大腦最重要及最基本的神經功能之一,與海馬組織的關系最為密切。POCD的發(fā)生機制較為復雜,涉及多途徑的信號通路的參與。miRNA是生物體內通過抑制靶mRNA降解或翻譯的單鏈RNA,可對機體的生物學特征進行調控〔13〕。有研究顯示,在認知障礙大鼠存在差異表達的miRNA中,通過調控突出囊泡膜功能、氧化應激及細胞凋亡等途徑影響大鼠的認知功能〔14〕。Kim 等〔15〕研究顯示,miR-126可通過調控PI3K/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路,抑制血管生成、血管完整性、炎癥反應及細胞增殖等過程。本研究表明,miR-126可減輕七氟烷誘導的老齡大鼠認知障礙。

神經炎癥反應會激活小膠質細胞及星形膠質細胞,同時釋放大量的炎癥因子,如IL-1β、IL-6和TNF-α,進而影響神經功能〔16〕。而氧化應激引起的海馬神經元凋亡也與POCD的發(fā)病機制相關〔17〕。本研究結果提示,miR-126可抑制細胞凋亡與炎癥反應,從而起到改善七氟烷誘導的老齡大鼠POCD的作用。

PI3K/AKT信號通路參與多種細胞活動,是經典的抗凋亡信號通路之一,與細胞增殖、凋亡密切相關〔18〕。研究顯示,對該信號通路的調控,可影響神經系統(tǒng)的凋亡與自噬,對認知功能障礙的改善起到重要作用〔19〕。miR-126也可通過調控PI3K/AKT/mTOR 信號通路調控炎癥反應〔15〕。本研究結果表明,miRs-126可激活PI3K/AKT信號通路,實現減輕七氟烷誘導的老齡大鼠認知障礙的作用。但miR-126激動劑并未完全使大鼠的認知功能恢復,這可能與miR-126激動劑沒有使miR-126表達水平恢復至正常,從而無法完全調控相關信號通路,影響了認知功能。