赤石脂對急性心肌梗死后應用阿司匹林致大鼠胃黏膜損傷的保護作用及機制

史曉梅 劉宏巖 肖鈺雪 王鑫赫 張兆鵬 王松 郭軍鵬

(長春中醫藥大學,吉林 長春 130117)

胃腸疾病最常見的是胃腸出血,潰瘍又是上消化道出血的最常見原因〔1〕。近年來質子泵抑制劑(PPI)和內鏡技術的發展使用,一定程度上提高了上消化道潰瘍出血的診治效果,但仍有難點尚待解決〔2〕。在心血管疾病如急性心肌梗死(AMI)發生后,機體的應激反應及抗血小板聚集等藥物的應用是導致心肌梗死后消化道出血的主要原因〔3〕。而非甾體抗炎藥是消化性潰瘍的發病的獨立影響因素之一,阿司匹林對胃黏膜的損傷成為其臨床應用受限的主要原因。中藥赤石脂的主要成分是含水硅酸鋁,具有止血生肌、斂瘡澀腸的功效。實驗研究及臨床觀察顯示赤石脂對應激性潰瘍出血及胃腸出血有止血作用,能夠吸附消化道有毒物質,增強胃黏膜屏障功能〔4〕。本研究以線栓法復制AMI,并給予阿司匹林制備應激后胃黏膜損傷病理模型,觀察赤石脂對胃黏膜形態學、血清前列腺素(PG)E2和血管內皮生長因子(VEGF)、凝血功能及胃組織細胞外調節蛋白激酶(ERK)、微管相關蛋白1A/1B-輕鏈(LC)3、自噬效應蛋白(Beclin)-1蛋白表達的影響,探討赤石脂對大鼠AMI后應用阿司匹林導致胃黏膜損傷的保護作用和機制。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級SD雄性大鼠32只,體質量為200～220 g,許可證號為SCXK(京)2019-0010,購于(北京)斯貝福生物有限公司。該實驗經長春中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批通過。

1.2藥品及制備 水合氯醛(福晨化學試劑有限公司);阿司匹林(北京索來寶有限公司);奧美拉唑腸溶片(阿司利康制藥有限公司);中藥飲片赤石脂購自長春中醫藥大學附屬醫院。阿司匹林和奧美拉唑分別溶在1%羧甲基纖維素鈉溶液中;赤石脂藥液：根據人與大鼠的體表面積換算比例得出大鼠每日藥物濃度為4.2 g/kg。

1.3試劑與儀器 PGE2、VEGF試劑盒(北京華英生物技術研究所);凝血酶原時間(PT)、纖維蛋白原(FIB)、凝血酶時間(TT)試劑盒(希森美康醫用電子公司);蘇木素-伊紅(HE) 染色試劑盒(北京索來寶有限公司);β-actin、Beclin1、LC3抗體和二抗辣根過氧化物酶(HRP,Proteintech公司);ERK、P-ERK抗體(美國CST公司)。全自動凝血液分析儀(希森美康醫用電子有限公司);DR-200BS型酶標儀(無錫華衛德朗儀器有限公司);智能熒光化學發光成像系統(廣州光儀生物科技有限公司)。

1.4模型制備與給藥 32只SD雄性大鼠隨機分為正常組、模型組、西藥對照組和赤石脂組。將模型組、西藥對照組和赤石脂組結扎左冠狀動脈前降支復制AMI模型〔5～8〕,以ST段出現弓背向上抬高為造模成功;3 d后灌胃0.2 g/(kg·d)阿司匹林溶液4 d復制胃損傷出血模型。西藥對照組灌胃給予4 mg/(kg·d)奧美拉唑溶液,赤石脂丸組給予4.2 g/(kg·d)赤石脂湯液,正常組和模型組灌胃等體積生理鹽水,連續7 d。

1.5胃組織的大體變化及潰瘍指數 沿胃大彎將胃剪開后用水沖洗胃內容物,并吸干水分后觀察黏膜的變化,并按Guth標準對胃黏膜出血病灶進行評分：長度<1 mm為1分,1～2 mm為2分,以此類推,損傷寬度>2 mm時,分數×2,全胃病灶分數總和為損傷指數〔9〕。

1.6HE染色法觀察胃組織 多聚甲醛溶液浸泡胃組織24 h,固定、脫水、石蠟包埋、切片后,按照試劑盒進行染色,封片后在顯微鏡下進行觀察。

1.7測定血清PGE2、VEGF含量及血漿PT、TT和FIB含量 腹主動脈取血靜置30 min,離心提取上清液,酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測PGE2、VEGF含量。用抗凝管取血靜置后離心提取上層血漿,用凝固法測PT、TT和FIB含量。

1.8Western印跡檢測胃組織中P-ERK1/2、LC3和Beclin-1蛋白表達 取50 mg 胃組織置于液氮速凍后,加入RIPA裂解液進行研磨,冰浴30 min,離心提取上清液,二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白定量。凝膠電泳分離蛋白,轉膜,封閉,一抗孵育過夜,次日加入二抗孵育1 h,電化學發光(ECL)法顯影,并分析結果。

1.9統計學分析 采用SPSS22.0和GraphPad-Prism8.01軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1AMI模型制備成功心電圖 正常組心電圖節律規整,各節段時限正常,各波群振幅、形態正常;模型組建模后1～5 min會出現心律失常直至出現典型的ST段弓背向上抬高,為AMI模型制備成功心電圖。見圖1。

圖1 正常組與模型組心電圖

2.2赤石脂對胃組織的大體形態及潰瘍指數的影響 正常組胃組織形態結構正常,胃黏膜表面光滑,紅潤有光澤,無充血、糜爛及脫落現象,皺襞走形規整。模型組胃體積增大,胃壁變薄,胃腔可見大量腐臭胃黃褐色血食物混合殘留,胃組織上可見潰瘍出血點,黏膜色澤蒼白,有部分脫落現象,皺襞萎縮變淺,走向紊亂。西藥對照組與赤石脂丸組肉眼觀變化相似,胃組織結構形態正常,胃腔內偶見少許食物殘留,胃組織上可見潰瘍出血點較模型組明顯減少,胃黏膜表面較光滑,色紅潤略有充血,尚有光澤,皺襞走形較規整。見圖2。與正常組(0.00±0.00)比較,模型組胃黏膜損傷指數明顯升高(12.40±3.65,P<0.01);與模型組比較,赤石脂組、西藥對照組損傷指數明顯降低(2.40±1.14、3.20±1.30,P<0.01)。

圖2 各組胃大體

2.3赤石脂對胃組織鏡下形態學的影響 正常組胃組織黏膜完整,結構排列齊整,未見黏膜充血及糜爛;模型組黏膜上皮缺失、片狀脫落,黏膜下層血管擴張、炎細胞浸潤;赤石脂組和西藥對照組胃黏膜結構相對較完整,腺體排列整齊,未見黏膜脫落等病理變化,炎細胞浸潤少見。見圖3。

圖3 各組胃組織病理形態學(HE染色,×400)

2.4赤石脂對胃損傷模型大鼠血清PGE2、VEGF含量的影響 與正常組比較,模型組血清PGE2、VEGF顯著降低(P<0.01);與模型組比較,赤石脂組與西藥對照組血清PGE2、VEGF含量均顯著升高(P<0.01)。見表1。

表1 各組PGE2、VEGF水平、PT、TT和FIB含量、P-ERK、LC3和Beclin-1蛋白表達

2.5赤石脂對胃損傷模型大鼠血漿中PT、TT和FIB的影響 與正常組比較,模型組凝血系統指標PT、TT明顯延長,FIB含量顯著增高(P<0.05,P<0.01);與模型組比較,赤石脂組和西藥對照組PT、TT均顯著縮短,FIB含量均顯著降低(P<0.05,P<0.01)。見表1。

2.6赤石脂對胃損傷模型大鼠胃組織P-ERK、LC3和Beclin-1蛋白表達的影響 與正常組比較,模型組P-ERK/ERK、Beclin-1、LC3表達顯著升高(P<0.01);與模型組比較,赤石脂組和西藥對照組P-ERK/ERK、Beclin 1、LC3表達顯著降低(P<0.01)。見表1、圖4。

圖4 各組P-ERK、LC3Ⅰ、Ⅱ和Beclin-1蛋白表達

3 討 論

赤石脂首載于《神農本草經》,色赤,甘溫偏補,酸澀能收,治療“黃疸、泄利、腸澼膿血、癰疽瘡瘍”等疾病。《名醫別錄》中記載“養心氣、治腹痛泄澼、癰疽瘡痔、崩漏下、胞衣不出”〔10〕。在《金匱要略》中張仲景應用赤石脂,增強溫澀收斂、固腸止血之力多配合溫熱藥,增補養溫暖下焦多配合補益藥〔11〕。總而言之,赤石脂具有止血生肌,斂瘡澀腸止瀉等作用。現代研究表明,赤石脂具有既止血、又抗血栓形成,縮短出血時間和凝血時間及抗潰瘍形成的作用;赤石脂還具有抗炎止瀉、吸附炎性滲出物,保護胃黏膜等作用。本課題組前期研究證實,烏頭赤石脂丸方能夠治療AMI、心肌梗死后心力衰竭及心律失常等疾病〔12～14〕。

胃黏膜損傷是防御與損傷因素失衡而致。PGE2能夠抑制胃酸分泌,增加胃黏液的分泌及胃黏膜血流量,繼而增強胃黏膜抗損傷能力〔15〕。VEGF具有促進血管內皮細胞增殖的作用,有利于潰瘍愈合和黏膜修復〔16〕。阿司匹林通過抑制環氧化酶的活性,從而減少PGE2的合成,導致胃黏膜損傷。本研究顯示,赤石脂能夠增加PGE2和VEGF的含量而增強胃黏膜防御保護功能和損傷修復能力。PT能夠反映外源性的凝血系統功能,而TT能夠反映出內、外源凝血系統功能。FIB為纖維蛋白原,與纖溶系統的聯系較為密切〔17〕。本研究結果表明,赤石脂通過激活內、外源性凝血途徑及纖溶系統而防治心肌梗死和血栓形成。

自噬是細胞降解蛋白質或細胞器以滿足細胞代謝和細胞器更新需要的一種方式。LC3和Beclin是調控自噬的關鍵蛋白,常作為自噬的標志物〔18,19〕。當自噬發生時,LC3Ⅰ會經泛素化修飾后與磷脂酰乙醇胺結合形成LC3Ⅱ,因此LC3Ⅰ向Ⅱ轉化的程度即機體的自噬程度〔20〕。Beclin1 能夠促進 LC3Ⅰ向Ⅱ轉化,并加速自噬體與溶酶體融合而促進自噬〔21〕。當LC3Ⅱ 表達水平上升激活自噬,使線粒體被自噬溶酶體吞噬,影響胃腸活動能量供給,誘導胃腸功能紊亂,從而引發胃動力障礙〔22〕。本研究表明,赤石脂能夠抑制細胞過度自噬,改善胃腸功能和動力障礙,從而改善胃損傷。