黃芩苷調控PI3K/Akt通路對過氧化氫誘導的內皮祖細胞損傷的保護作用

吳欽欽 孫珊 嚴鳳琴 卜曉芬 朱虹

(武漢市中心醫院全科醫學科,湖北 武漢 437000)

據報道,全世界死亡和殘疾的主要原因應該是非傳染性疾病和心血管疾病〔1〕。急性心肌梗死(AMI)是一種常見的、死亡率最高的心血管疾病〔2〕。因此,預防和治療這種疾病顯得尤為重要。內皮祖細胞(EPCs)扎根于骨髓,具有強大的增殖能力,被認為是血管生成過程中的主要效應細胞。血管損傷或缺血可刺激骨髓源性EPCs的動員和遷移,使其歸位到相應的靶器官〔3〕。EPCs不僅能融入受損血管,分化為成熟內皮細胞,還能通過旁分泌法修復血管內皮,減輕心臟重構的影響,參與心肌缺血、梗死的恢復過程〔4〕。AMI患者的EPCs常存在動員率低、靶向性差、損傷等問題〔5〕。研究〔6〕顯示,過氧化氫(H2O2)增加了體內活性氧(ROS)的積累,而ROS無法被細胞清除,導致氧化應激損傷和EPCs代謝受損。因此,探索一種新的機制來改善EPCs的功能至關重要。黃芩苷(5,6,7三羥基黃酮7-b-D葡萄糖醛酸)是從黃芩根中分離得到的主要成分,具有多種藥理活性,如抗炎、抗腫瘤、免疫調節等〔7〕。有研究〔8〕報道,黃芩苷具有強大的抗氧化活性,可抑制博萊霉素誘導的大鼠成纖維細胞凋亡,并阻止ROS的產生。黃芩苷可降低血管內黏附因子水平和動脈粥樣硬化斑塊的生成〔9〕。既往研究〔10,11〕發現,黃芩苷通過降低細胞凋亡對缺氧復氧誘導的肺動脈內皮細胞和凝血酶刺激的人臍靜脈內皮細胞均有血管保護作用。然而,黃芩苷作用于EPCs的潛在機制仍未被探索。相關文獻〔12〕表明,磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路的激活對內皮功能障礙和細胞凋亡具有保護作用。本研究探討黃芩苷對H2O2誘導的EPCs損傷的保護作用及其作用與PI3K/Akt通路的調控關系。

1 材料與方法

1.1實驗動物 動物實驗均經醫院動物倫理委員會批準。4月齡,平均體質量(200±10)g的健康成年SD大鼠購自廣東省實驗動物監測所,許可證號：SYXK(粵)2021-0122。所有大鼠飼養在22 ℃和50%濕度的條件下,飲食正常。

1.2主要試劑與儀器 磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、堿性成纖維細胞生長因子、多聚甲醛購自上海碧云天生物公司;M199培養基、胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素購自美國Gibco公司;血管內皮生長因子(VEGF)購自美國Thermo Fisher公司;1,1-二十八烷基-3,3,3,3-四甲基林碳菁標記的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)、甘露醇購自索萊寶生物公司;異硫氰酸熒光素凝集素(FITC-UEA)-1購自德國默克公司;H2O2、黃芩苷(純度95%)、Hoechst33258購自Sigma Aldrich公司;PI3K抑制劑LY294002、噻唑藍(MTT)試劑盒購自英國Abcam公司;胱天蛋白酶(Caspase)-3熒光檢測試劑盒購自Clontech公司;ROS檢測試劑盒(型號：LIVE綠色)購自美國Invitrogen公司;乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、Caspase-3、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt和GAPDH一抗及山羊抗兔二或山羊抗鼠二抗購自英國Abcam公司。

BX53M光學顯微鏡、IX73熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯;SpectraMax5多功能酶標儀購自美國Molecular Devices公司;DxFLEX流式細胞分析儀和CytExpert軟件購自美國Beckman公司。

1.3EPCs細胞的分離與鑒定 SD大鼠用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后頸椎脫臼安樂死,然后用PBS沖洗骨髓腔,直至洗滌液無色透明。骨髓腔灌洗液收集于15 ml離心管中并離心。取上清液和脂肪,用5 ml PBS重懸細胞。取5 ml淋巴細胞分離液和制備好的細胞懸液加入新的15 ml離心管中。密度梯度離心獲得單個核細胞,并將其接種到6孔板中,板上涂有纖維連接蛋白。采用含20%胎牛血清、5 ng/ml堿性成纖維細胞生長因子、20 ng/ml VEGF、1%青霉素-鏈霉素的M199培養基培養細胞。

用100倍光學顯微鏡觀察細胞培養4、8、14 d后細胞形態的變化。讓EPCs細胞在體外分化生長2 w,達到70%融合。然后將Dil-ac-LDL用培養液稀釋至30 μg/ml,加入細胞中,在37 ℃培養箱中培養4 h。PBS洗滌2次后,用4%多聚甲醛固定EPCs細胞15 min,然后加入400 μl 10 μg/ml的FITC-UEA-1于37 ℃培養箱中孵育1 h。用200倍的熒光顯微鏡觀察染色結果。

1.4EPCs細胞分組 根據以往的研究報道〔13〕建立EPCs細胞損傷模型：當EPCs融合度在80%左右時,用無血清低糖DMEM培養基饑餓細胞至少12 h,使細胞在靜止期同步生長。24 h后,細胞培養在37 ℃,5% CO2,500 μmol/L H2O2培養基中,依據文獻〔14〕將EPCs細胞隨機分為對照組、H2O2組;為了探討黃芩苷對H2O2誘導的EPCs細胞損傷,通過參考文獻〔15〕和預實驗設置黃芩苷低、中、高劑量組(分別用30、60、120 μg/ml黃芩苷預處理細胞24 h,再用500 μmol/L H2O2培養基培養24 h);為了明確PI3K/Akt通路與H2O2誘導的EPCs細胞損傷的關系,在黃芩苷高劑量組的基礎上設置黃芩苷高劑量+LY294002組(120 μg/ml黃芩苷和10 μmol/L LY294002〔16〕分別預處理細胞24 h和1 h,再用500 μmol/L H2O2培養基培養24 h)。

1.5MTT檢測EPCs細胞活力 EPCs細胞(1×105)接種在96孔板,每孔加入50 μl無血清培養基和50 μl MTT試劑。96孔板置于培養箱中培養3 h。隨后,除去MTT試劑-培養基混合物,每孔加入150 μl MTT溶劑,然后輕柔振蕩15 min。在590 nm處用多功能酶標儀檢測吸光度,并通過計算處理組與對照組的吸光度百分比來表達細胞活力。

1.6Hoechst33258核染色評價EPCs細胞凋亡 凋亡細胞最顯著的變化是染色體濃縮。Hoechst33258可作為熒光探針與DNA分子結合。在凋亡細胞中,Hoechst33258的攝入量增加,凋亡細胞顯示出強烈的藍色熒光。經過1.4處理后,將EPCs細胞用4%多聚甲醛在0.1 mol/L PBS(pH7.4)中4 ℃固定10 min,然后用PBS洗滌5次。用5 mg/ml Hoechst33258染色10 min后,熒光顯微鏡觀察各組EPCs細胞凋亡情況。

1.7Caspase-3熒光檢測試劑盒檢測EPCs細胞Caspase-3的活性 將1.4中EPCs細胞裂解并離心。然后,將收集的上清液與5 μl的Caspase-3熒光底物(DEVD-AFC)孵育1 h。最后,通過使用FL600熒光閱讀器測量熒光強度來評估Caspase-3活性。

1.8管形成實驗檢測EPCs細胞管形成能力 預冷的基質膠與無血清培養基混合,然后用該混合物涂布24孔板。將培養皿置于37 ℃培養箱中30 min,使基質膠凝固。1.4中EPCs細胞以每孔2×104的劑量加入培養皿中,孵育24 h。倒置顯微鏡拍照。

1.9試劑盒檢測EPCs細胞內氧化損傷標志物水平 將EPCs細胞(1×105細胞/ml)置于6孔板中18 h,并按1.4中方法處理。取適量上清液,按生產廠家說明書測定LDH、MDA、SOD水平。

ROS檢測試劑盒檢測EPCs細胞內ROS水平：EPCs細胞與含10 μmol 2,7二氯二氫熒光素二醋酸酯(H2DCF-DA)的M199共孵育30 min,然后用PBS洗滌。結果采用流式細胞儀分析。

1.10Western印跡檢測EPCs細胞內凋亡、PI3K/Akt通路相關蛋白表達 使用RIPA緩沖液、蛋白酶抑制劑和苯甲基磺酰氟收集蛋白質,用蛋白質定量試劑盒定量,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。然后,通過電泳將蛋白質轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂奶粉封閉膜1 h,然后與Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Caspase-3(1∶1 000)、PI3K(1∶500)、p-PI3K(1∶1 000)、Akt(1∶500)、p-Akt(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)抗體孵育。孵育24 h后,用1% Tris緩沖鹽水和Tween20沖洗膜,用山羊抗兔二抗(1∶10 000)或山羊抗鼠二抗(1∶10 000)孵育。使用電化學發光(ECL)試劑盒和凝膠成像系統顯示蛋白條帶。使用ImageJ對結果進行分析。

1.11統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行分析。組間比較采用單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1骨髓衍生EPCs的鑒定 EPCs培養4 d后呈圓形或橢圓形,培養8 d后呈梭形或圓形,培養2 w后呈鵝卵石狀,見圖1。Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1陽性表達的細胞被鑒定為分化的EPCs,見圖2。

圖1 來源于骨髓的內皮祖細胞形態(×400)

圖2 Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1雙染色鑒定EPCs(×200)

2.2黃芩苷對H2O2誘導的EPCs細胞增殖、凋亡的影響 與對照組比較,H2O2組EPCs細胞活力顯著下降,凋亡率顯著上升(P<0.05);與H2O2組比較,黃芩苷低、中、高劑量組EPCs細胞活力顯著升高,凋亡率顯著降低,且呈劑量依賴性(P<0.05);與黃芩苷高劑量組比較,黃芩苷高劑量+LY294002組EPCs細胞活力顯著降低,凋亡率顯著升高(P<0.05),見圖3、表1。

表1 黃芩苷對H2O2誘導的EPCs細胞管形成及細胞中氧化損傷標志物的影響

圖3 黃芩苷對H2O2誘導的EPCs細胞凋亡的影響(Hoechst33258染色,×200)

2.3黃芩苷對H2O2誘導的EPCs細胞中氧化損傷標志物的影響 與對照組相比,H2O2組EPCs細胞中LDH、ROS、MDA水平顯著升高,SOD水平顯著降低(P<0.05);與H2O2組相比,黃芩苷低、中、高劑量組LDH、ROS、MDA水平顯著下降,SOD水平顯著上升,且呈明顯劑量依賴性(P<0.05);與黃芩苷高劑量組相比,黃芩苷高劑量+LY294002組LDH、ROS、MDA水平顯著上升,SOD水平顯著下降(P<0.05),見表1。

2.4黃芩苷對H2O2誘導的EPCs細胞管形成的影響 H2O2組EPCs細胞的相對分支點數明顯低于對照組(P<0.05);黃芩苷低、中、高劑量組相對分支點數依次高于H2O2組(P<0.05);黃芩苷高劑量+LY294002組相對分支點數顯著低于黃芩苷高劑量組(P<0.05),見表1、圖4。

圖4 黃芩苷對H2O2誘導的EPCs細胞管形成的影響(×100)

2.5黃芩苷對H2O2誘導的EPCs細胞中凋亡相關蛋白的影響 與對照組相比,H2O2組EPCs細胞中Bax、Caspase-3蛋白表達及相對Caspase-3活性明顯增高,Bcl-2蛋白表達及Bcl-2/Bax比值明顯降低(P<0.05);與H2O2組相比,黃芩苷低、中、高劑量組EPCs細胞中Bax、Caspase-3蛋白表達及相對Caspase-3活性呈明顯劑量依賴性下降,Bcl-2蛋白表達及Bcl-2/Bax比值呈明顯劑量依賴升高(P<0.05);與黃芩苷高劑量組相比,黃芩苷高劑量+LY294002組EPCs細胞中Bax、Caspase-3蛋白表達及相對Caspase-3活性明顯升高,Bcl-2蛋白表達及Bcl-2/Bax比值明顯降低(P<0.05),見表2、圖5。

表2 黃芩苷對H2O2誘導的EPCs細胞相關凋亡蛋白及PI3K/AKT通路蛋白表達的影響

1～6：對照組、H2O2組、黃芩苷低、中、高劑量組、黃芩苷高劑量+LY294002組圖5 黃芩苷對H2O2誘導的EPCs細胞中凋亡相關蛋白的影響

2.6黃芩苷對H2O2誘導的EPCs細胞中PI3K/akt通路蛋白表達的影響 與對照組比較,H2O2組EPCs細胞中p-PI3K/PI3K與p-Akt/Akt比值均顯著下降(P<0.05);與H2O2組相比,黃芩苷低、中、高劑量組p-PI3K/PI3K與p-Akt/Akt比值依次明顯上升(P<0.05);與黃芩苷高劑量組相比,黃芩苷高劑量+LY294002組p-PI3K/PI3K與p-Akt/Akt比值明顯降低(P<0.05),見表2、圖5。

3 討 論

血管內皮細胞損傷被認為是動脈疾病級聯的第一步,一直被認為是冠心病發展的關鍵〔17〕。EPCs作為骨髓源性祖細胞,具有很強的增殖能力,被認為是血管生成過程中的主要效應細胞。血管損傷或缺血可刺激骨髓源性EPCs動員、遷移和歸巢〔3〕。有研究〔18,19〕表明,EPC移植是治療AMI安全有效的方法,但氧化應激會導致移植早期大量EPCs死亡,從而削弱治療效果。因此,改善氧化應激下EPCs的生物學功能,促進AMI后心肌修復至關重要。

研究〔20〕表明,為了修復局部不可修復的損傷,EPCs必須首先從骨髓動員進入外周循環,然后再到損傷處分化為血管內皮細胞。大鼠的EPCs一般來源于外周血、骨髓和脾臟。由于骨髓中EPCs的數量最多,本研究從股骨和脛骨骨髓腔中分離并培養了干細胞。細胞培養2 w后,細胞呈鵝卵石樣形態,這與研究〔21〕結果一致。有研究〔22〕表明,H2O2誘導的內皮細胞凋亡與ROS產生之間存在聯系。本研究發現,H2O2會引發EPCs的氧化應激。

相關證據〔7〕表明,黃芩苷參與多種調節功能,包括細胞凋亡和抗氧化應激調控。黃芩苷通過減少細胞凋亡對缺氧/脫氧暴露的人動脈內皮細胞具有血管保護作用〔23〕。此外,黃芩苷可通過激活小鼠腦微血管內皮細胞中Nrf2介導的抗氧化應激通路,保護脂多糖誘導的血腦屏障損傷〔24〕。有研究〔25〕表明,黃芩苷可以通過抗氧化機制保護內皮細胞免受三氧化二砷誘導的細胞毒性作用。本研究提示,黃芩苷對H2O2處理的EPCs具有保護作用。Bcl-2家族蛋白包括促凋亡分子Bax和抗凋亡分子Bcl-2,已被證實參與調節凋亡通路。Caspase-3由Bcl-2激活,其上調表達可加速細胞凋亡〔16〕。本研究提示,黃芩苷通過抑制促凋亡蛋白的表達降低EPCs細胞的凋亡能力,進而緩解細胞損傷。有研究〔26〕表明,血管形成與EPCs功能有關,H2O2情況下,血管形成能力減弱,EPCs功能受損。本研究結果說明,黃芩苷能夠提高H2O2誘導的EPCs血管形成能力。

研究〔8〕表明,黃芩苷通過PI3K/Akt通路發揮抗氧化作用。PI3K/Akt通路的激活促進了EPCs的增殖、轉移和血管修復能力〔27〕。miR-126通過激活PI3K/Akt途徑恢復H2O2處理的EPCs的功能〔26〕。本研究結果表明,黃芩苷恢復了H2O2降低的p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的比值。推測黃芩苷可能通過PI3K/Akt通路在H2O2處理的EPCs中發揮調控作用。進一步研究表明,LY294002阻礙了黃芩苷對H2O2誘導的EPCs PI3K/Akt通路相關蛋白表達、細胞活力、細胞凋亡、血管形成、LDH和ROS生成等功能恢復的作用,提示黃芩苷通過PI3K/Akt通路減輕H2O2對EPCs的調控作用。

綜上,黃芩苷通過恢復PI3K/Akt通路改善H2O2環境下EPCs的氧化損傷。然而,黃芩苷還被發現具有抗炎藥理活性〔7〕。接下來將進行進一步的實驗來探索黃芩苷在H2O2誘導的EPCs中的抗炎作用。此外,有研究〔28〕表明,內皮細胞損傷可追溯到H2O2引起的血管再生障礙與Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/p70核糖體S6蛋白激酶(p70S6K)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路的改變。但本研究為初步研究,后續將通過影響其他信號通路,改善EPCs的分離培養,繼續探討黃芩苷對培養大鼠EPCs功能的影響。