咪達唑侖通過調控LncRNA NR2F2-AS1對腎癌786-O細胞增殖、遷移及凋亡的影響

周宇 曹欽鈺 劉蕾

(遵義市第一人民醫院泌尿外科,貴州 遵義 563000)

腎癌是我國常見的一種惡性腫瘤,且呈逐年上升趨勢,已嚴重威脅患者生命安全〔1,2〕。目前研究發現,麻醉可影響腎癌等腫瘤手術患者遠期預后,患者外周血液中腫瘤細胞數量與患者生存及預后密切相關,表明靜脈麻醉藥對腎癌等腫瘤細胞生長及轉移具有重要作用〔3〕。長鏈非編碼(Lnc)RNA屬于內源性非編碼RNA分子,其富含微小(mi)RNA的結合位點,并可通過充當miRNA的競爭性內源(ce)RNA而正向調控靶基因表達從而參與腫瘤發生及發展過程〔4〕。但LncRNA是否可作為靜脈麻醉藥調節腎癌細胞生物學行為的潛在靶點尚未明確。咪達唑侖是常用的一種靜脈麻醉藥,其具有良好的鎮靜效果,研究表明,咪達唑侖可促進肺腺癌細胞凋亡,并可抑制肺腺癌移植瘤生長〔5〕。但咪達唑侖對腎癌細胞生物學行為的影響尚未明確。研究表明,下調LncRNA核受體亞家族2組F成員反義RNA(NR2F2-AS)1表達可抑制鼻咽癌細胞增殖并誘導細胞凋亡〔6〕。但LncRNA核受體亞家族2組F成員反義RNA(NR2F2-AS)1在腎癌細胞生長及轉移過程中的作用機制尚未闡明。本研究探討咪達唑侖通過調控LncRNA NR2F2-AS1表達對腎癌細胞增殖、遷移及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 咪達唑侖(上海甄準生物科技有限公司,規格：10 mg);人腎癌細胞786-O(美國ATCC);反轉錄與熒光定量PCR試劑盒(北京天根生化);si-NC、si-NR2F2-AS1(廣州銳博生物);pcDNA、pcDNA-si-NR2F2-AS1(上海吉滿生物);CCK-8試劑、細胞凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);Transwell小室(美國Corning);兔抗人B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體(美國CST);內參GAPDH與山羊抗兔辣根過氧化物酶(HRP)/IgG二抗(美國Santa Cruz)。

1.2實驗分組 在6孔板每孔中接種對數生長期786-O細胞1×104個,加入含有不同濃度(0、20、40、60 μmol/L)咪達唑侖的DMEM培養基培養24 h〔7〕,分別記為0、20、40、60 μmol/L組。將si-NC、si-NR2F2-AS1分別轉染至786-O細胞,分別記為si-NC組、si-NR2F2-AS1組。參照LipofectamineTM3000轉染試劑說明書將pcDNA、pcDNA-NR2F2-AS1分別轉染至786-O細胞,轉染成功后加入含有濃度為60 μmol/L咪達唑侖的DMEM培養基培養24 h,分別記為咪達唑侖+pcDNA組、咪達唑侖+pcDNA-NR2F2-AS1組。

1.3CCK-8實驗檢測細胞增殖 將1.2中所有組別的786-O細胞1×103個接種于96孔板每孔,與10 μl CCK-8溶液反應2 h,在450 nm處,應用酶標儀測定吸光度(A)值。抑制率(%)=(1-A實驗/A對照)×100%。

1.4流式細胞術檢測細胞凋亡率 將1.2中所有組別的786-O細胞加入胰蛋白酶消化后經3 000 r/min轉速離心5 min,棄上清后用預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,加入400 μl結合緩沖液懸浮細胞后分別加入5 μl膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)與5 μl碘化丙啶(PI),將上述處理后的細胞進行避光放置,放置15 min后用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。使用Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(Solarbio,北京)進行細胞凋亡測定。 首先,收集細胞并用 1×結合緩沖液洗滌2次,然后用1×結合緩沖液重懸,最終濃度為 1×106個/ml。 接下來,將 5 μl Annexin Ⅴ-FITC 和 5 μl PI溶液加入100 μl細胞懸液中,室溫避光培養15 min。 最后,通過 FACScan 流式細胞儀(BD Biosciences,San Jose,CA,美國)檢測樣品。

1.5Transwell實驗檢測細胞遷移 將1.2中所有組別的786-O細胞(1×105個/孔)接種于上室,然后將600 μl培養液(含有10%胎牛血清)加入小室,48 h后將500 μl 4%多聚甲醛加入小室中固定細胞20 min,隨后用1%結晶紫染色液染色10 min,最后使用顯微鏡觀察遷移細胞數。

1.6實時熒光定量-聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測LncRNA NR2F2-AS1的表達水平 取1 ml Trizol試劑提取786-O細胞總RNA。RNA反轉錄合成cDNA,cDNA加入20倍焦碳酸二乙酯(DEPC)水稀釋后進行RT-qPCR擴增,熱循環條件：95 ℃預變性2 min,95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共循環40次。應用ABI StepOnePlus RT-qPCR儀檢測LncRNA NR2F2-AS1相對表達量。

1.7Western印跡檢測Bax、Bcl-2蛋白表達量 用400 μl RIPA裂解液提取1.2中所有組別的786-O細胞的總蛋白。使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后蛋白樣品,轉膜并用5%脫脂奶粉在室溫下放置2 h。分別將兔抗人Bax(1∶1 000)、兔抗人Bcl-2(1∶1 000)一抗與內參GAPDH抗體(1：3000)稀釋液添加到膜中,4 ℃孵育24 h,將山羊抗兔HRP/IgG二抗稀釋液(1∶5 000)加入膜中并在室溫孵育1 h,成像后,ImageJ軟件用于各條帶灰度值測量。

1.8統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1咪達唑侖對腎癌786-O細胞增殖、凋亡、遷移的影響 與咪達唑侖0 μmol/L組比較,咪達唑侖20、40、60 μmol/L組細胞增殖抑制率、凋亡率和Bax蛋白水平明顯升高,遷移細胞數和Bcl-2蛋白水平明顯降低,且呈劑量依賴性(P<0.05),見圖1、表1、圖2。

表1 咪達唑侖及抑制LncRNA NR2F2-AS1對腎癌786-O細胞增殖、凋亡、遷移和對咪達唑侖處理的腎癌786-O細胞增殖、遷移的影響及細胞中LncRNA NR2F2-AS1表達

圖1 各組細胞凋亡

1～8：咪達唑侖0、20、40、60 μmol/L組、si-NC組、si-NR2F2-AS1組、咪達唑侖+pcDNA組、咪達唑侖+pcDNA-NR2F2-AS1組圖2 Western印跡檢測各組凋亡蛋白表達

2.2咪達唑侖對腎癌786-O細胞中LncRNA NR2F2-AS1表達的影響 與咪達唑侖0 μmol/L組比較,咪達唑侖20、40、60 μmol/L組LncRNA NR2F2-AS1的表達量明顯降低,且呈劑量依賴性(P<0.05),見表1。

2.3LncRNA NR2F2-AS1轉染效率的檢測 與si-NC組(1.00±0.00)比較,si-NR2F2-AS1組LncRNA NR2F2-AS1表達量(0.37±0.03)明顯降低(t=36.373,P=0.000);與咪達唑侖+pcDNA組(1.00±0.00)比較,咪達唑侖+pcDNA-si-NR2F2-AS1組LncRNA NR2F2-AS1表達量(2.85±0.21)明顯升高(t=15.259,P=0.000)。

2.4抑制LncRNA NR2F2-AS1對腎癌786-O細胞增殖、凋亡、遷移的影響 與si-NC組比較,si-NR2F2-AS1組細胞增殖抑制率、凋亡率和Bax蛋白水平明顯升高,遷移細胞數和Bcl-2蛋白水平明顯降低(P<0.05),見圖1、表1、圖2。

2.5LncRNA NR2F2-AS1對咪達唑侖處理的腎癌786-O細胞增殖、遷移、凋亡的影響 與咪達唑侖+pcDNA組比較,咪達唑侖+pcDNA-NR2F2-AS1組細胞增殖抑制率、凋亡率和Bax蛋白表達明顯降低,遷移細胞數、Bcl-2蛋白表達明顯升高(P<0.05),見表1。

3 討 論

LncRNA在腎癌組織和細胞系中表達異常,并可通過調節miRNA/mRNA表達而參與腎癌細胞生長及轉移過程,還可能作為腎癌靶向治療的潛在靶點〔8～10〕。咪達唑侖可抑制神經膠質瘤和肺癌細胞增殖〔11〕。咪達唑侖可通過促進miR-137表達而抑制胃癌細胞增殖及促進細胞凋亡〔12〕。咪達唑侖通過下調轉錄共激活因子p300表達而抑制人頭頸部鱗癌細胞增殖〔13〕。本研究結果提示,咪達唑侖可抑制腎癌細胞增殖及遷移。Bax屬于促凋亡蛋白,Bcl-2屬于抗凋亡蛋白,當細胞接收凋亡信號時Bax表達上調而Bcl-2表達下調進而促進細胞凋亡〔14〕。本研究結果提示,咪達唑侖可促進腎癌細胞凋亡。LncRNA NR2F2-AS1在非小細胞肺癌細胞中高表達,其促非小細胞肺癌細胞增殖及促轉移的作用機制與通過充當miR-320b的ceRNA分子而促進整合位點基因(BMI1)表達有關〔15〕。沉默LncRNA NR2F2-AS1可誘導結直腸癌細胞周期阻滯及細胞增殖〔16〕。LncRNA NR2F2-AS1可促進透明細胞腎細胞癌細胞生長〔17〕。本研究結果提示,咪達唑侖可能通過下調LncRNA NR2F2-AS1的表達而影響腎癌細胞生物學行為。同時,咪達唑侖可通過抑制LncRNA NR2F2-AS1表達而抑制腎癌細胞生長及轉移,并可誘導細胞凋亡。

綜上,咪達唑侖可通過抑制LncRNA NR2F2-AS1表達而抑制腎癌細胞增殖及遷移,并可促進腎癌細胞凋亡,LncRNA NR2F2-AS1可能作為咪達唑侖影響腎癌細胞生物學行為的潛在靶點。但咪達唑侖調節腎癌細胞生物學行為的具體作用機制仍需進一步探究。