黃芩苷對糖尿病大鼠視網膜小膠質細胞激活的影響及機制研究

蘆凌羽，王林洪

小膠質細胞是中樞神經系統中的免疫細胞[1]，其被激活后大量表達白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6），而IL-6 介導慢性炎癥反應[2]，在許多炎癥反應中表達升高[3]，并將信號轉導和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription3，STAT3）通路激活，導致炎癥反應加強，可促進視網膜變性及細胞凋亡的發生。IL-6/STAT3 是經典的炎癥信號通路，而該通路可進一步促進小膠質細胞的激活，形成了一個正反饋循環，加重了視神經變性及神經節細胞的凋亡[4]。近年來，中藥在慢性疾病的治療中被廣泛應用[5]，黃芩苷是從中藥黃芩中提煉出來的黃酮類化合物，有抗炎、抗氧化作用[6]。有研究[7]表明，天然黃酮類化合物有改善糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）的作用，并且對鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導的糖尿病大鼠神經病變也有預防作用。本研究旨在討論黃芩苷對小膠質細胞激活的影響，及作用機制是否與IL-6/STAT3信號通路有關。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60 只雄性SD 大鼠，6 周齡，體重200～250 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號[SCXK（京）2021-0001]。所有大鼠在恒溫恒濕的環境飼養，自由進食，室溫20～22 ℃，晝夜循環照明，定期檢查大鼠眼部健康狀況。本研究實驗動物及實驗所用條件符合國家科學技術委員會的《實驗動物管理條例》相關規定。

1.2 藥品、試劑與儀器

鏈脲佐菌素（上海柯意哲科學實驗室，SS9500），黃芩苷（西安圣青生物科技有限公司，S31635），蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色劑（南京建成生物工程研究所有限公司，20210102），冰醋酸（天津市化學試劑公司，20201122），STAT3 引物、IL-6 引物（上海弗元生物科技有限公司，GS0830、KT1340），鼠抗簇分化抗原68（cluster of differentiation 68，CD68）抗體、鼠抗STAT3 抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司，SC20020、SC8019），實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司，BL698A）。多功能智能顯微鏡、光學顯微鏡（日本OLYMPUS公司，BX-64、CKX53），石蠟切片機、烤片機（科迪儀器設備有限公司，KD-202A、KDTHII），PCR 儀（美國貝克曼庫爾特公司，ABI7500）。

1.3 糖尿病大鼠模型建立

選取40 只大鼠，單次腹腔注射STZ 建立糖尿病模型。將STZ 溶于檸檬酸鈉溶液中，以60 mg/kg 的劑量腹腔注射，其余20只大鼠腹腔注射等劑量檸檬酸鈉溶液。連續3 d 測定大鼠空腹血糖，將每次血糖均≥16.7 mmol/L 的大鼠判斷為糖尿病模型建立成功[8]。若造模過程中出現死亡或者血糖不達標的大鼠不計算在內，繼續選取同批大鼠進行造模，確保最后造模成功的大鼠總數為40只。

1.4 分組與給藥

將造模成功的大鼠隨機分為模型組（model group，MG）和黃芩苷組（baicalin group，BG），另將對照的20 只大鼠設為對照組（control group，CG），每組20 只。BG 組大鼠給予黃芩苷水溶液（50 mg/kg）每日清晨灌胃，CG 組、MG 組大鼠給予同體積的蒸餾水灌胃，連續給藥12 周。在整個研究過程中，密切觀察大鼠的生理狀態，剔除生理狀態差、體重差異大以及在實驗中死亡的大鼠后，在12 周時發現BG組剩余17 只、MG 組剩余14 只、CG 組剩余19 只，于每組中再次采用隨機抽樣的方法各選取12 只大鼠進行實驗。

1.5 標本取材

所有大鼠在12 周時先禁食12 h，然后測量血糖并記錄。麻醉后立即摘取大鼠右眼眼球，浸入固定液中固定30 min 后取出眼球，在眼球左右對稱開口，再次放入固定液中固定24 h，進行石蠟切片，用于組織病理學實驗。

1.6 HE染色

切片常規脫蠟后水化，分別使用蘇木素和伊紅進行染色，然后進行梯度濃度乙醇和二甲苯浸泡，最后向切片滴入中性樹膠封片，靜置于通風處24 h。自然風干后放入切片盒中，使用光學顯微鏡檢查視網膜形態，選取合適視野進行拍攝。

1.7 免疫組織化學法測量CD68蛋白表達

切片常規脫蠟后水化，進行抗原修復，封閉10 min。重復洗滌3 次后，滴加鼠抗CD68 抗體（稀釋比例1∶200），放入4 ℃冰箱24 h。次日洗滌3 次后，加入試劑B，放置入濕盒中20 min，再次洗滌3次。然后加入試劑C，室溫下反應10 min，洗滌3 次。顯色后放入蘇木素中30 s 進行復染，洗滌后再加至梯度濃度乙醇和二甲苯中浸泡。最后滴加中性樹膠風干，在顯微鏡下拍照。以細胞核呈現棕黃色的細胞為陽性表達，使用Image-Pro Plus 軟件測量光密度值。

1.8 免疫熒光法測量STAT3蛋白表達

切片常規脫蠟后水化，進行抗原修復，封閉10 min。重復洗滌3 次后，滴加鼠抗STAT3 抗體（稀釋比例1∶200），放入4 ℃冰箱24 h。次日洗滌3 次后，滴加羊抗鼠二抗（稀釋比例1∶200），室溫下避光孵育60 min，再次洗滌后，進行染色，于顯微鏡下觀察并拍照。

1.9 RT-qPCR法測定IL-6、STAT3 mRNA的相對表達量

提取視網膜組織中RNA，RNA 通過逆轉錄酶合成cDNA，進行逆轉錄。按照說明書配置及設計引物（表1），將試劑在管內混勻，每個樣本設置3 個副孔，放入PCR 儀中，進行擴增。首先94 ℃反應3 min，然后94 ℃反應20 s→60 ℃反應20 s→72 ℃反應30 s，循環40次，最后72 ℃反應5 min。以β-肌動蛋白（β-actin）作為內參照蛋白，以相對定量法2-△△Ct計算IL-6、STAT3 mRNA的相對表達量。

表1 qRT-PCR實驗相關引物信息

1.10 統計學方法

本研究采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示。方差分析（ANOVA）進行多組變量間的相互比較，兩兩比較采用LSD-t檢驗。當P＜0.05 時，認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芩苷對糖尿病大鼠視網膜形態的影響

與CG 組相比，MG 組大鼠視網膜神經節細胞（retina ganglion cell，RGC）丟失明顯增多，而經黃芩苷治療后的BG 組大鼠RGC數量增加；MG組大鼠視網膜厚度較CG 組薄，而BG 組大鼠視網膜厚度較MG組厚（圖1）。

圖1 黃芩苷對糖尿病大鼠視網膜形態的影響（HE染色，×200）

2.2 黃芩苷對糖尿病大鼠視網膜小膠質細胞激活的影響

CG 組小膠質細胞局限在內核層；MG 組小膠質細胞數量增多，且分布在視網膜的每一層中；BG 組小膠質細胞數量較MG 組少，且小膠質細胞遷移受限（圖2）。3組間大鼠視網膜小膠質細胞CD68表達比較（表2），差異有統計學意義（F=28.000，P=0.000）。MG 組CD68 表達高于CG 組（t=7.348，P=0.000），BG 組CD68 表達低于MG 組（t=2.449，P=0.019），差異均有統計學意義。

圖2 黃芩苷對糖尿病大鼠視網膜小膠質細胞激活的影響（免疫組織化學染色，×200）

表2 黃芩苷對糖尿病大鼠視網膜CD68和STAT3 mRNA、IL-6 mRNA表達的影響（±s，n=12）

表2 黃芩苷對糖尿病大鼠視網膜CD68和STAT3 mRNA、IL-6 mRNA表達的影響（±s，n=12）

注：* 與CG 組比較，P＜0.05；# 與MG 組比較，P＜0.05；CG 對照組；MG 模型組；BG 黃芩苷組；CD68 簇分化抗原68；STAT3 信號轉導和轉錄激活因子3；IL-6 白細胞介素-6。

IL-6 mRNA 1.00±0.52 3.78±0.18*2.43±0.17#209.75 0.000組別CG組MG組BG組F值P值CD68 0.09±0.01 0.12±0.01*0.11±0.01#28.000 0.000 STAT3 mRNA 1.00±0.49 2.19±0.10*1.18±0.09#57.365 0.000

2.3 黃芩苷對糖尿病大鼠視網膜STAT3、IL-6 表達的影響

CG 組視網膜STAT3 表達主要分布在內叢狀層，而MG 組視網膜各層均有大量STAT3陽性表達，BG 組視網膜各層中STAT3 表達明顯弱于MG 組（圖3）。3 組間大鼠視網膜STAT3 mRNA、IL-6 mRNA的表達比較（表2），差異均有統計學意義（FSTAT3=57.365、FIL-6=209.75，均P=0.000）。MG 組視網膜STAT3 mRNA、IL-6 mRNA 表達高于CG 組（tSTAT3=9.935、tIL-6=17.501，均P=0.000），BG 組視網膜STAT3 mRNA、IL-6 mRNA表達低于MG組（tSTAT3=8.432、tIL-6=9.944，均P=0.000），差異均有統計學意義。

圖3 黃芩苷對糖尿病大鼠視網膜STAT3表達的影響（免疫熒光染色，×200）

3 討論

在健康的視網膜中，小膠質細胞通過釋放神經保護因子和抗炎因子參與視網膜防御免疫系統。然而，如果持續面對炎癥刺激，長期激活的小膠質細胞會釋放過量的細胞因子而導致神經炎癥[9]，致使神經節細胞凋亡。因此，針對小膠質細胞的藥物治療以減輕慢性神經炎癥，可能是保護神經節細胞的一種有效的方法。

黃芩苷是一種多靶點藥物，具有抗氧化和抗炎等多種保護作用。IGNACIO S 等[10]發現，使用黃芩苷干預肌萎縮側索硬化癥模型小鼠，使CD68 等小膠質細胞標志物的表達下調。還有研究[11]表明，黃芩苷可能是調節中樞神經系統炎癥反應和細胞凋亡的藥物。因此，為了評估黃芩苷是否可以抑制小膠質細胞的激活，本研究對小膠質細胞標記物CD68進行免疫組織化學染色以定量定位觀察，發現CG組大鼠視網膜上只有在視網膜內核層中可以檢測到小膠質細胞，而MG 組大鼠除了內核層中小膠質細胞增多外，其余各層中也出現了小膠質細胞。值得注意的是，黃芩苷治療后的BG 組大鼠視網膜各層中的小膠質細胞顯著減少，幾乎阻止了DR 導致的小膠質細胞激活，表明經黃芩苷干預后，在一定程度上可抑制小膠質細胞的激活。

IL-6 是激活的小膠質細胞高表達的炎癥因子，而IL-6 與其受體復合物的結合可導致STAT3 的激活，并激活細胞內外2 條促凋亡信號通路。研究[12]表明，受體結合后通過直接的凋亡作用或者采用間接干擾生長因子，如胰島素樣生長因子-1（insulinlike growth factors-1，IGF-1）和胰島素受體的細胞內物質，來誘導神經元死亡。而這些細胞內物質的最可能來源是視網膜小膠質細胞，引起促炎細胞因子的分泌增加，進一步使視網膜炎癥反應加劇，導致視網膜變性及神經節細胞的凋亡[13]。在本實驗中可發現，經黃芩苷治療后的BG 組大鼠視網膜中STAT3 mRNA 及IL-6 mRNA 的表達量較MG 組大鼠下降，表明黃芩苷抑制了STAT3和IL-6的表達。

綜上所述，本研究發現黃芩苷可抑制DR 大鼠模型視網膜的小膠質細胞的激活，降低了各項炎癥指標，該作用機制可能與抑制IL-6/STAT3信號通路有關。本研究可為DR藥物研發提供新的方向。