生物信息學(xué)分析髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-2對(duì)低級(jí)別膠質(zhì)瘤的影響

楊緒東，陶瑞明

［ 滄州市第四醫(yī)院（南皮縣人民醫(yī)院）神經(jīng)內(nèi)科，河北 滄州 061500 ］

膠質(zhì)瘤（glioma）是最常見(jiàn)的顱內(nèi)惡性腫瘤，根據(jù)2007 年世界衛(wèi)生組織制定的分類標(biāo)準(zhǔn)，膠質(zhì)瘤分為四級(jí)：Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤被稱為低級(jí)別膠質(zhì)瘤（low-grade glioma,LGG），Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)被稱為高級(jí)別膠質(zhì)瘤（high-grade glioma,HGG）［1-2］。其中LGG 占膠質(zhì)瘤總發(fā)病率的15%～25%，主要包括星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤及少突膠質(zhì)星形細(xì)胞瘤［3］。LGG 的臨床表現(xiàn)不明顯，54%的患者出現(xiàn)頭痛，26%的患者出現(xiàn)癲癇發(fā)作，還有很多患者沒(méi)有臨床表現(xiàn)，所以LGG 的早期發(fā)現(xiàn)及診斷仍沒(méi)有較好的方法。此外，與HGG 相比，LGG 生長(zhǎng)緩慢，生存期較長(zhǎng)，但是如果不及時(shí)診斷及治療，所有LGG 最終都會(huì)進(jìn)展為HGG，導(dǎo)致患者生存率降低甚至死亡［4］。因此，尋找LGG 發(fā)生發(fā)展的相關(guān)標(biāo)志物，對(duì)于LGG 的早期發(fā)現(xiàn)，早期診斷及治療具有重要意義。髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-2（triggering receptor expresses on myeloid cells-2,TREM-2）屬于免疫球蛋白（Ig）跨膜受體超家族成員，是樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等髓樣細(xì)胞的膜表面受體，主要通過(guò)與接頭蛋白DAP-12 結(jié)合來(lái)向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào)［5］。TREM-2 與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。TREM-2 能抑制巨噬細(xì)胞活化，抑制白細(xì)胞介素-6（interleukin-6,IL-6）及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）等促炎因子的釋放，從而發(fā)揮抑制炎癥的作用［6］。活化的巨噬細(xì)胞分為M1型和M2 型，前者發(fā)揮促炎作用，后者具有抑制炎癥作用，TREM-2 在M2 型巨噬細(xì)胞膜上的表達(dá)增強(qiáng)，也提示其能下調(diào)巨噬細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞的功能及炎癥因子的釋放［7］。近年來(lái)，TREM-2 的免疫識(shí)別功能在腫瘤中的作用引起越來(lái)越多的關(guān)注。TREM-2 在肺癌［8］、肝癌［9-10］、結(jié)直腸癌［11］及黑色素瘤［12］的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用，但是TREM-2 在LGG 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用研究較少。為進(jìn)一步明確TREM-2 在LGG 腫瘤組織中的表達(dá)情況及對(duì)惡性表型形成的機(jī)制，本研究以TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)，分析TREM-2 在LGG 中的表達(dá)情況及對(duì)患者總體生存率的影響，以期為L(zhǎng)GG 的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷及治療提供潛在的生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 TREM-2 基因在人LGG 腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)差異

運(yùn)用在線分析軟件GRPIA2（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#index）對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的LGG 患者臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，分析TREM-2 在LGG 腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)差異。具體操作步驟為：在 GRPIA2 在線網(wǎng)站中選擇“Expression Analysis”模塊下的“Expression DIY”進(jìn)行分析。頂部選擇箱式圖“Box Plot”后，輸入“TREM2”基因，腫瘤類型選擇“LGG”，差異閾值等其他參數(shù)默認(rèn)，點(diǎn)擊“Plot”得到TREM-2 在LGG 腫瘤組織和正常組織表達(dá)差異的柱狀圖。

1.2 TREM-2 表達(dá)與LGG 患者臨床病理特征的關(guān)系

在 UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/analysis.html）網(wǎng)站首頁(yè)頂部點(diǎn)擊“TCGA”分析模塊，然后選擇“TCGA Gene analysis”，輸入基因名稱“TREM2”，在TCGA dataset 處選擇腫瘤類型“Brain lower grade glioma”，點(diǎn)擊“Explore”進(jìn)行分析，然后在 links for analysis 分析下點(diǎn)擊“Expression”，得到TREM2 的表達(dá)與LGG 患者年齡、性別、種族、腫瘤分級(jí)、組織學(xué)分型等臨床病理特征之間的關(guān)系。

1.3 TREM-2 表達(dá)對(duì)LGG 患者總體生存的影響

采用UALCAN 和GEPIA2 兩個(gè)在線網(wǎng)站分析TREM-2 的表達(dá)異常對(duì)LGG 患者總體生存率及無(wú)病生存率的影響。具體分析步驟如下：同樣在UALCAN 網(wǎng)站“TCGA Gene analysis”模塊下輸入基因名稱和腫瘤類型，點(diǎn)擊“Explore”進(jìn)行分析，然后在links for analysis 分析下點(diǎn)擊“Survival”得到生存曲線圖；在GRPIA2 在線網(wǎng)站中選擇“Expression Analysis”模塊下的“Survival Analysis”進(jìn)行分析，輸入基因名稱，添加癌癥類型，選擇OS（總體生存率）還是RFS（無(wú)病生存率），點(diǎn)擊“Plot”得到最終的生存分析結(jié)果。

1.4 與TREM-2 基因相關(guān)的信號(hào)通路富集

在UALCAN 在線分析網(wǎng)站中檢索出與TREM-2呈正相關(guān)和負(fù)相關(guān)的基因，其中正相關(guān)基因的相關(guān)系數(shù)（r）需在0.3～0.9 之間，負(fù)相關(guān)基因的相關(guān)系數(shù)（r）需在-0.6～-0.3 之間。然后分別將符合要求的正相關(guān)基因和負(fù)相關(guān)基因輸入DAVID6.8 在線軟件（https：//david.ncifcrf.gov/），對(duì)其進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集。

1.5 分析TREM-2 基因在LGG 中的免疫浸潤(rùn)水平

在 TIMER（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）在線數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索TREM-2 的表達(dá)與LGG純度和免疫浸潤(rùn)程度之間的關(guān)系。在TIMER 中，基因表達(dá)與腫瘤純度之間的相關(guān)性使用Pearson 分析來(lái)計(jì)算，基因表達(dá)與6 種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度之間的關(guān)系采用Spearman 分析，偏相分析方法可以排除腫瘤純度對(duì)分析免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的影響。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行分析，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和t檢驗(yàn)（Student's test），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Kaplan-Meier 分析用于患者總體生存率分析；R4.0.5 版軟件及ggplot2 包用于KEGG 通路富集繪圖。

2 結(jié)果

2.1 TREM-2 基因在人LGG 腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)差異

GEPIA2 在線網(wǎng)站納入的LGG 腫瘤患者為518例，正常對(duì)照207 例；結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，TREM-2 在LGG 腫瘤組織中的表達(dá)高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 TREM-2 在LGG 腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)差異

2.2 TREM-2 的表達(dá)與LGG 患者臨床病理特征的關(guān)系

TREM-2 的表達(dá)水平與LGG 患者的年齡，性別及種族不相關(guān)（P＞0.05）。與患者腫瘤分級(jí)（Grade-2vs.Grade-3，P＜0.05），組織學(xué)分型（星形細(xì)胞瘤vs.少突膠質(zhì)星形細(xì)胞瘤vs.少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤，P＜0.05）相關(guān)，見(jiàn)圖2。

2.3 TREM-2 表達(dá)對(duì)LGG 患者總體生存率和無(wú)病生存率的影響

采用UALCAN 和GEPIA2 網(wǎng)站分別分析了TREM-2 低表達(dá)和高表達(dá)對(duì)LGG 患者總體生存率的影響。圖3A 是UALCAN 網(wǎng)站分析結(jié)果，包括LGG 低表達(dá)患者382 例，高表達(dá)患者129 例，分析結(jié)果表明TREM-2 表達(dá)越高，LGG 患者的總體生存率越低（P=0.00025）。圖3B 是GEPIA2 網(wǎng)站分析結(jié)果，納入LGG 低表達(dá)和高表達(dá)患者分別為257 例，結(jié)果同樣表明TREM-2 表達(dá)越高，LGG 患者的總體生存率越低（P=0.0029）。此外，TREM-2高表達(dá)會(huì)造成LGG 患者的無(wú)病生存期縮短（P=0.015）（圖3C）。

圖3 TREM-2 表達(dá)對(duì)LGG 患者總體生存率及無(wú)病生存率的影響

2.4 TREM-2 相關(guān)基因信號(hào)通路富集

采用UALCAN 在線網(wǎng)站檢索與TREM-2 相關(guān)的基因。其中正相關(guān)基因1 585 個(gè)，相關(guān)系數(shù)（r）在0.87～0.3 之間，負(fù)相關(guān)基因1 554 個(gè)，相關(guān)系數(shù)（r）在-0.54～-0.3 之間。分別將正相關(guān)基因和負(fù)相關(guān)基因輸入DAVID6.8 在線軟件進(jìn)行KEGG 通路富集。1 585 個(gè)正相關(guān)基因共富集在76 條通路中，其中參與基因數(shù)量≥15 個(gè)的信號(hào)通路有60條，主要涉及結(jié)核、癌癥通路、吞噬體、HTLV-1感染、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、破骨細(xì)胞分化、Epstein-Barr 病毒感染及單純皰疹感染等通路（圖4）。1 554 個(gè)負(fù)相關(guān)基因共富集在74 條通路中，其中參與基因數(shù)量≥15 個(gè)的信號(hào)通路有36 條，主要涉及MAPK 信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、谷氨酸能突觸及多巴胺能突觸等（圖5）。

圖4 與TREM-2 正相關(guān)基因的KEGG 通路富集氣泡圖

圖5 與TREM-2 負(fù)相關(guān)基因的KEGG 通路富集氣泡圖

2.5 LGG 中TREM-2 基因的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)

在TIMER 在線數(shù)據(jù)庫(kù)中分析LGG 中TREM-2表達(dá)與腫瘤微環(huán)境中6 種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，TREM-2 的表達(dá)與B 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞的浸潤(rùn)呈正相關(guān)，見(jiàn)圖6。

圖6 TREM-2 表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性分析

3 討論

TREM-2 編碼一種在髓系細(xì)胞表面表達(dá)的天然免疫受體，能調(diào)控巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞，進(jìn)而參與調(diào)控機(jī)體的免疫反應(yīng)，在TLR 配體刺激下可以和接頭蛋白DAP12 耦合，引起下游信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，負(fù)性調(diào)控DC 和巨噬細(xì)胞，進(jìn)而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)［13-15］。由于炎癥介質(zhì)以及免疫炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活能夠誘導(dǎo)細(xì)胞DNA 損傷或者基因突變，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，最終誘發(fā)癌變［16-17］。有研究表明［8］，在肺癌患者巨噬細(xì)胞中，TREM-2 的表達(dá)水平明顯增加，并且與肺癌的惡性等級(jí)呈正相關(guān)，且體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明Leiws 肺癌細(xì)胞高轉(zhuǎn)移株（3LL）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞高表達(dá)TREM-2，同時(shí)3LL誘導(dǎo)的荷瘤鼠體內(nèi)IL-12 分泌減少，IL-10 分泌增加，T 細(xì)胞增殖抑制，提示其有促進(jìn)肺部腫瘤生長(zhǎng)的作用。此外，在結(jié)直腸癌中，TREM-2 會(huì)影響腸道菌群平衡［18］，有助于結(jié)直腸癌的產(chǎn)生。另一方面，敲除TREM-2 能降低IL-23，IL-6 等炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而影響結(jié)直腸癌的進(jìn)展，表現(xiàn)為腫瘤病灶減小，腫瘤增殖速度減慢、腫瘤分級(jí)水平降低等［11］，提示TREM-2 可能對(duì)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展有促進(jìn)作用。然而，對(duì)于TREM-2 在LGG 中的表達(dá)情況及在LGG 發(fā)生發(fā)展中的作用研究較少。

本研究基于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)，采用生物信息學(xué)的方法，初步發(fā)現(xiàn)TREM-2 在LGG 腫瘤組織中的表達(dá)是高于正常組織；病例特征分析發(fā)現(xiàn)，LGG與患者腫瘤分級(jí)呈正相關(guān)，并且還和組織學(xué)分型有關(guān)，在星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)星形細(xì)胞瘤及少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的表達(dá)依次降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與患者的年齡、性別及種族等不相關(guān)。對(duì)患者生存分析結(jié)果表明，TREM-2 表達(dá)越高，LGG 患者的總體生存率和無(wú)病生存率越低。TREM-2 的免疫-炎癥調(diào)節(jié)作用可能是其影響LGG進(jìn)展的重要機(jī)制之一，研究發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)TREM-2與腫瘤微環(huán)境中的B 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等6種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)程度呈正相關(guān)，表明TREM-2的表達(dá)對(duì)LGG 的免疫微環(huán)境具有影響，能夠調(diào)控腫瘤的免疫微環(huán)境。TREM-2 對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)目前已經(jīng)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。對(duì)腫瘤微環(huán)境的scRNA-seq 序列研究表明，TREM-2 在多個(gè)髓樣細(xì)胞亞群中表達(dá)，尤其是巨噬細(xì)胞亞群，TREM-2 巨噬細(xì)胞的富集是肝細(xì)胞癌患者不良臨床結(jié)局的獨(dú)立指標(biāo)［19］。MOLGORA 等［20］人發(fā)現(xiàn)TREM-2 敲除小鼠對(duì)MCA 誘導(dǎo)的肉瘤、結(jié)直腸癌和乳腺腫瘤更具抵抗力，并且證明PD-1 抗腫瘤免疫治療對(duì)TREM-2 缺陷小鼠比WT 荷瘤小鼠更有效。單細(xì)胞RNA 測(cè)序分析髓系細(xì)胞表明，TREM-2 缺乏和抗TREM-2 單抗治療均引發(fā)浸潤(rùn)腫瘤的巨噬細(xì)胞群顯著改變，說(shuō)明TREM-2 是人類腫瘤浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物，是補(bǔ)充檢查點(diǎn)免疫治療的一個(gè)新途徑，但是TREM-2 調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境的機(jī)制還需深入研究。

綜上所述，TREM-2 在LGG 發(fā)生發(fā)展中可能是一個(gè)促癌基因，其對(duì)腫瘤的調(diào)節(jié)作用可能與腫瘤免疫-炎癥微環(huán)境相關(guān)，這為進(jìn)一步研究TREM-2在LGG 的免疫治療提供了新的見(jiàn)解和思路，為L(zhǎng)GG 早期診斷、早期治療提供了潛在靶點(diǎn)。但是，本研究也存在一定局限性，沒(méi)有在體外進(jìn)一步研究TREM-2 對(duì)LGG 增殖、遷移、侵襲等惡性表型及其調(diào)控免疫微環(huán)境的具體機(jī)制，未在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探究其作用來(lái)全面研究TREM-2 在調(diào)控LGG 中發(fā)揮的作用。