益心泰顆粒對(duì)慢性心衰（心氣虛兼血瘀水停證）大鼠AMPK、PGC-1α的影響*

雷 洋 郭志華 劉承鑫 魏佳明 唐 云

（1.湖南省中醫(yī)藥研究院文獻(xiàn)信息研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410006；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

慢性心力衰竭（CHF）患病率高［1］，一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。能量代謝失衡可導(dǎo)致能量代謝重構(gòu)使CHF 惡化，而改善心肌能量代謝可以改善CHF［2］。益心泰顆粒是郭志華教授團(tuán)隊(duì)根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)制的中藥復(fù)方，前期研究結(jié)果表明其可以明顯改善氣虛血瘀水停型CHF 患者中醫(yī)證候、心功能、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）［3］。前期基礎(chǔ)研究還表明，益心泰顆粒可降低CHF 兔左心室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）及血清腦利尿鈉肽（BNP）水平，提高LVEF［4］。心力衰竭與心室重構(gòu)、心肌能量代謝密切相關(guān)。前期基礎(chǔ)研究表明，益心泰顆粒可以改善CHF 心室重構(gòu)，但未研究其是否能改善心肌能量代謝。單磷酸腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）介導(dǎo)多條能量代謝信號(hào)通路。故本研究從能量代謝入手，探討益心泰顆粒對(duì)CHF（心氣虛兼血瘀水停證）模型大鼠的作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

70只雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量200～240 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004。合格證號(hào)：430727221102889045。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～22 ℃，濕度50%左右。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)湖南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：LL2018010801）。

1.2 試藥與儀器

益心泰顆粒，主要成分黃芪、丹參、澤瀉等，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供，每克含生藥3.1 g。鹽酸曲美他嗪片（施維雅天津制藥有限公司，規(guī)格：20 mg/片。國(guó)藥準(zhǔn)字H20055465）。表阿霉素（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：10 mg/瓶。國(guó)藥準(zhǔn)字H20183145）；丙硫氧嘧啶（精華制藥集團(tuán)股份有限公司，規(guī)格：50 mg/片。國(guó)藥準(zhǔn)字H32020795）。ELISA 試劑盒：NT-proBNP 購(gòu)自武漢菲恩生物科技有限公司（貨號(hào)：ER0309）。三磷酸腺苷（ATP）購(gòu)自上海瑞番生物科技有限公司（貨號(hào)：RF10856）；一磷酸腺苷（AMP）購(gòu)自北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)：DECO3207）；游離脂肪酸（FFA）購(gòu)自上海怡淼化學(xué)科技有限公司（貨號(hào)：YXP2245）；乳酸（Lac）購(gòu)自上海欽誠(chéng)生物科技有限公司（貨號(hào)：QC15155）。pAMPK 抗體、AMPK、PGC-1α 抗體均購(gòu)自湖南艾方生物科技有限公司（貨號(hào)：AF300361、AF300877、AF301056）。DYY-7C 電泳儀（北京市六一儀器廠）；SYSTEM Gel-Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RaD公司）。

1.3 造模與分組

將60 只大鼠隨機(jī)分為6 組，每組10 只，即模型組和益心泰高（10.4 g/kg）、中（5.2 g/kg）、低（2.6 g/kg）劑量組和曲美他嗪組（10 mg/kg）。按大鼠日進(jìn)食量的0.02%灌胃丙硫氧嘧啶聯(lián)合3.5 mg/kg 的表阿霉素腹腔注射復(fù)制CHF（心氣虛兼血瘀水停證）模型［5］。正常對(duì)照組予相同量蒸餾水灌胃與腹腔注射。

1.4 給藥方法

6 周后各藥物組予以相應(yīng)藥物灌胃，模型組與正常對(duì)照組予以蒸餾水灌胃，灌胃量每次10 mL/kg，連續(xù)灌胃4周。劑量換算方法：1×大鼠體表面積/70 kg成人平均體表面積×70 kg成人每日用量。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.5.1 LVEF 藥物治療4 周后，戊巴比妥麻醉動(dòng)物，超聲檢測(cè)儀行M超檢測(cè)。

1.5.2 血清NT-proBNP、心肌組織游離脂肪酸（FFA）、腺苷三磷酸/腺苷二磷酸（ATP/AMP）、乳酸（LAC） 麻醉動(dòng)物后，耳緣靜脈取血2 mL，空氣栓塞法處死，取出左心室心肌組織，采用ELISA 法檢測(cè)，具體按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.5.3 心肌病理組織形態(tài)學(xué)檢查 多聚甲醛固定心肌組織，切片（厚10μm）、HE染色、光鏡觀察并采圖。

1.5.4 心肌組織p-AMPK、AMPK、PGC-1α 采用Western blotting 法檢測(cè)。提取總蛋白，酶標(biāo)儀測(cè)定562nm 處的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的蛋白濃度；配制、灌制分離膠，灌制濃縮膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，按說(shuō)明書適當(dāng)稀釋一抗，一抗、二抗孵育，標(biāo)記物顯色，采用圖像分析軟件分析各樣品的條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)對(duì)照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌組織病理改變

模型組心肌細(xì)胞水腫、壞死，細(xì)胞核皺縮，間質(zhì)增寬，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌纖維排列紊亂，部分?jǐn)嗔选Ｖ委熃M心肌細(xì)胞損傷均較模型組有不同程度的減輕，且益心泰中、高劑量組及曲美他嗪組減輕明顯。見圖1。

圖1 各組心臟組織病理觀察（HE染色，400倍）

2.2 各組大鼠LVEF、血清NT-proBNP水平比較

見表1。模型組LVEF顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.01），而血清NT-proBNP 顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）。益心泰顆粒低、中、高劑量組及曲美他嗪組LVEF 均明顯高于模型組（P＜0.05 或P＜0.01），而血清NT-proBNP 顯著低于模型組（P＜0.05 或P＜0.01）。益心泰顆粒低劑量組LVEF 明顯低于曲美他嗪組（P＜0.05），血清NT-proBNP 明顯高于正常對(duì)照組、曲美他嗪組（P＜0.05）；而益心泰顆粒中、高劑量組LVEF、血清NTproBNP均與曲美他嗪組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

表1 各組大鼠LVEF、血清NT-proBNP水平比較（±s）

表1 各組大鼠LVEF、血清NT-proBNP水平比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與曲美他嗪組比較，△P ＜0.05。下同。

n組 別正常對(duì)照組模型組益心泰顆粒低劑量組益心泰顆粒中劑量組益心泰顆粒高劑量組曲美他嗪組NT-proBNP（pg/mL）116.04±29.53 437.42±38.48*331.29±22.64#△245.37±27.21##210.16±45.08##223.73±34.40##10 10 10 10 10 10 LVEF（%）70.35±11.27 37.40±6.35*46.77±5.23#△51.32±5.84##54.71±8.16##52.85±4.70##

2.3 各組大鼠心肌組織FFA、ATP/AMP、LAC比較

見表2。模型組ATP/AMP顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.01），而FFA、LAC 顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）。益心泰顆粒低、中、高劑量組及曲美他嗪組ATP/AMP均明顯高于模型組（P＜0.05 或P＜0.01），而FFA、LAC顯著低于模型組（P＜0.05 或P＜0.01）。益心泰顆粒低劑量組ATP/AMP 明顯低于曲美他嗪組（P＜0.05），F(xiàn)FA、LAC 明顯高于正常對(duì)照組、曲美他嗪組（P＜0.05）；而益心泰顆粒中、高劑量組ATP/AMP、FFA、LAC均與曲美他嗪組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

表2 各組大鼠心肌組織FFA、ATP/AMP、LAC水平比較（±s）

表2 各組大鼠心肌組織FFA、ATP/AMP、LAC水平比較（±s）

組 別正常對(duì)照組模型組益心泰顆粒低劑量組益心泰顆粒中劑量組益心泰顆粒高劑量組曲美他嗪組n 10 10 10 10 10 10 FFA（nmol/mg）174.30±10.27 287.45±12.35*248.74±9.20#△220.36±13.85##213.76±11.14##201.84±8.75##ATP/AMP 9.80±1.08 2.47±0.93*3.69±0.63#△4.97±1.07##5.86±1.05##6.03±1.41##LAC（nmol/mg）301.35±45.27 547.21±36.82*456.07±41.81#△391.92±45.04##364.71±28.56##352.16±44.66##

2.4 各組大鼠p-AMPK、AMPK、PGC-1α 蛋白相對(duì)灰度值比較

見表3、圖4。模型組p-AMPK、AMPK、PGC-1α 蛋白相對(duì)灰度值均顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.01）。益心泰顆粒低、中、高劑量組及曲美他嗪組p-AMPK、AMPK、PGC-1α蛋白相對(duì)灰度值均明顯高于模型組（P＜0.05或P＜0.01）。益心泰顆粒低劑量組p-AMPK、AMPK、PGC-1α蛋白相對(duì)灰度值均明顯低于曲美他嗪組（P＜0.05），而益心泰顆粒高劑量組p-AMPK、AMPK、PGC-1α 蛋白相對(duì)灰度值均與曲美他嗪組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

表3 各組大鼠p-AMPK、AMPK、PGC-1α蛋白表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠p-AMPK、AMPK、PGC-1α蛋白表達(dá)比較（±s）

組 別正常對(duì)照組模型組益心泰顆粒低劑量組益心泰顆粒中劑量組益心泰顆粒高劑量組曲美他嗪組n 10 10 10 10 10 10 p-AMPK 0.68±0.15 0.14±0.05*0.20±0.06#△0.33±0.11#△0.44±0.17##0.51±0.14##AMPK 0.74±0.22 0.12±0.08*0.28±0.09#△0.41±0.08#△0.55±0.13##0.67±0.20##PGC-1α 0.98±0.18 0.16±0.05*0.32±0.08#△0.47±0.10#△0.56±0.13##0.59±0.16##

圖4 各組p-AMPK、AMPK、PGC-1α蛋白表達(dá)

3 討 論

CHF指心血管疾病所致心臟收縮舒張功能障礙而表現(xiàn)的一系列癥狀的臨床綜合征，其患病率高［1］。隨著藥物的不斷更新，心衰的西醫(yī)治療方案不斷完善，且隨著CHF 中心的建設(shè)，方案越來(lái)越規(guī)范，取得了一定的效果，但住院率及死亡率仍居高不下。本病死亡率與癌癥相當(dāng)，住院患者約為2.8%［1］，故對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，顯得非常重要。心臟是高能量代謝器官，CHF 發(fā)生時(shí)代謝底物發(fā)生改變，導(dǎo)致能量供需失衡［6］。能量代謝失衡可導(dǎo)致能量代謝重構(gòu)而使HF惡化［2］，改善心肌能量代謝，可以抑制心肌纖維化、延緩HF發(fā)展［7］。

針對(duì)能量代謝，西醫(yī)臨床主要采用抑制脂肪酸氧化的藥物如曲美他嗪，但其可產(chǎn)生酮體等有害物質(zhì)［8］。故研究有效的中藥制劑改善慢性心力衰竭能量代謝十分必要。氣血運(yùn)行，心臟的活動(dòng)都與心氣密切相關(guān)，心氣是心臟發(fā)揮正常生理作用的原動(dòng)力。心氣虧虛則原動(dòng)力不足，猶如現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所稱能量不足，故有學(xué)者提出“氣”與能量存在內(nèi)在統(tǒng)一性［9］。益心泰顆粒中的君藥為黃芪，其中黃芪的有效成分為黃芪甲苷，有研究表明，其可以激活A(yù)MPK 信號(hào)通路，改善心肌細(xì)胞能量代謝［10］；臣藥為丹參，丹參有效成分為丹參川芎嗪，其可改善CHF 臨床癥狀，減輕心肌能量消耗［11］。基于以上理論基礎(chǔ)，本團(tuán)隊(duì)提出，益心泰顆粒可能具有改善心肌能量代謝的作用。

AMPK 是細(xì)胞能量代謝的“傳感器”，能調(diào)控CHF能量穩(wěn)態(tài)，以改善CHF 心功能，故逐漸成為其潛在治療靶點(diǎn)［12-13］。AMPK 廣泛存在于真核細(xì)胞生物中，當(dāng)ATP/ADP 或ATP/AMP 的比例降低時(shí)，其大量激活而參與能量代謝的調(diào)節(jié)。心臟是高耗能器官，正常生理下，主要由FFA供能，但心肌能量代謝異常后，F(xiàn)FA利用減少，葡萄糖的無(wú)氧酵解供能增加，產(chǎn)生大量的LAC，導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，H+、Ca2+等濃度的異常升高，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞功能障礙而加重心衰的發(fā)展［14］。PGC-1α 是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)輔助激活因子，在AMPK 磷酸化后活化，從而激活下游的核呼吸因子等，刺激線粒體生物合成，促進(jìn)FFA 氧化，而改善心肌能量代謝［15］。

本研究結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，模型組表現(xiàn)為心肌細(xì)胞水腫、壞死，細(xì)胞核皺縮，間質(zhì)增寬，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，LVEF、心肌組織ATP/AMP 比例及心肌組織p-AMPK、AMPK、PGC-1α 蛋白相對(duì)灰度值顯著下降（P＜0.01），而血清NT-proBNP及心肌組織中FFA、LAC含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，益心泰顆粒各劑量組及曲美他嗪組心肌細(xì)胞損傷均有不同程度的減輕，LVEF、心肌組織ATP/AMP比例及心肌組織p-AMPK、AMPK、PGC-1α 蛋白相對(duì)灰度值均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），血清NT-proBNP 及心肌組織中FFA、LAC含量明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），說(shuō)明益心泰顆粒與曲美他嗪均可明顯改善CHF心肌損傷，提高其LVEF，降低血清NT-proBNP及心肌組織FFA、LAC含量，促進(jìn)AMPK、PGC-1α表達(dá)，改善心肌能量代謝。

益心泰顆粒可以改善心氣虛兼血瘀水停證CHF，其機(jī)制可能是促進(jìn)AMPK、PGC-1α 表達(dá)，改善心肌能量代謝。AMPK 相關(guān)的能量通路繁多，本研究只選擇了AMPK/PGC-1α 通路中的重要指標(biāo)，以后研究有待從AMPK 相關(guān)通路研究益心泰改善CHF 的機(jī)制，并研究其相關(guān)通路中的關(guān)聯(lián)。