基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討鷹嘴豆芽素A治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用機(jī)制

王東萍 葛萬(wàn)文 袁國(guó)強(qiáng)

[摘要]?目的?通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接的方法探究鷹嘴豆芽素A治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用機(jī)制。方法?檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（traditional?Chinese?medicine?systems?pharmacology?database?and?analysis?platform，TCMSP）、TargetNet、Swiss?Target?Prediction等數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)，篩選出鷹嘴豆芽素A對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，利用DisGeNET、GeneCards等數(shù)據(jù)庫(kù)獲得神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用靶點(diǎn)。取藥物與疾病的交集靶點(diǎn)，借助STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用（protein-protein?interaction，PPI）分析，利用Cytoscape?3.9.1軟件構(gòu)建潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。對(duì)交集靶點(diǎn)通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行本體論富集分析（gene?ontology，GO）和京都基因和基因組百科全書(shū)（Kyoto?encyclopedia?of?genes?and?genomes，KEGG）通路富集分析。通過(guò)DockThor數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)鷹嘴豆芽素A和關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，Pymol軟件進(jìn)行可視化處理。結(jié)果?共篩選出鷹嘴豆芽素A靶點(diǎn)149個(gè)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)靶點(diǎn)5654個(gè)，藥物與疾病交集靶點(diǎn)97個(gè)，核心靶點(diǎn)為表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal?growth?factor?receptor，EGFR）、雌激素受體（estrogen?receptor，ESR1）、熱休克蛋白（heat?shock?protein，HSP）90AA1、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix?metalloproteinase，MMP）9、PPARG、PTGS2，靶點(diǎn)參與的功能主要與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡等過(guò)程有關(guān)。GO富集分析發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆芽素A在生物過(guò)程、細(xì)胞組成、分子功能多方面參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療。KEGG通路108條，包括腫瘤、化學(xué)致癌作用-受體活性、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、PI3K/Akt等信號(hào)通路。分子對(duì)接結(jié)果顯示鷹嘴豆芽素A與關(guān)鍵靶點(diǎn)均有較好的結(jié)合活性。結(jié)論?鷹嘴豆芽素A可能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、增強(qiáng)化療敏感性等發(fā)揮治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用。

[關(guān)鍵詞]?鷹嘴豆芽素A；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對(duì)接

[中圖分類號(hào)]?R739.4????[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]?A ????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.05.001

Mechanism?of?Biochanin?A?in?treating?gliomas?based?on?network?pharmacology?and?molecular?docking

WANG?Dongping1，?GE?Wanwen2，?YUAN?Guoqiang3

1.School?of?traditional?Chinese?and?Western?Medicine，?Gansu?University?of?Chinese?Medicine;?Department?of?Clinical?Teaching，?Gansu?Provincial?Hospital，?Lanzhou?730000，?Gansu，?China;?2.Cuiying?Biomedical?Research?Center，?Lanzhou?University?Second?Hospital，?Lanzhou?730030，?Gansu，?China;?3.Key?Laboratory?of?Neurology，?Gansu?Province，?Lanzhou?730030，?Gansu，?China

[Abstract]?Objective?To?analyze?the?mechanism?of?Biochanin?A?in?the?treatment?of?Gliomas?based?on?network?pharmacology?and?molecular?docking.?Methods?Traditional?Chinese?medicine?systems?pharmacology?database?and?analysis?platform?（TCMSP），?TargetNet，?Swiss?Target?Prediction?were?used?to?search?the?active?components?and?targets?of?Biochanin?A.?DisGeNET，?GeneCards?databases?were?used?to?search?the?corresponding?targets?of?Gliomas.?The?intersection?of?active?components?of?Biochanin?A?and?gliomas?target?were?selected?to?obtain?the?potential?target?of?Biochanin?A?in?treating?Gliomas.?Protein?gene?interaction?data?were?obtained?by?STRING?database，?and?protein-protein?interaction?network?was?constructed?by?importing?into?Cytoscape?software.?Gene?ontology?（GO）?function?and?Kyoto?encyclopedia?of?genes?and?genomes?（KEGG）?pathway?enrichment?analysis?of?the?same?target?proteins?of?drug?and?disease?were?carried?out?by?DAVID?database.?Molecular?docking?was?performed?by?using?DockThor?and?Pymol?software.?Results?A?total?of?149?targets?of?Biochanin?A，?5654?gliomas?relate-genes，?97?common?targets?of?Biochanin?A?and?gliomas?are?collected.?The?key?targets?were?epidermal?growth?factor?receptor?（EGFR），?estrogen?receptor?（ESR1），?heat?shock?protein?（HSP）90AA1，?matrix?metalloproteinase?（MMP）9，?PPARG?and?PTGS2.?The?targets?were?mainly?play?an?essential?role?in?cell?proliferation，?invasion，?cell?apoptosis，?and?other?biological?pathways.?GO?enrichment?analysis?demonstrated?that?Biochanin?A?could?involve?the?treatment?of?Gliomas?in?biological?process，?cell?composition?and?molecular?function.?KEGG?108?signaling?pathways?mainly?related?to?pathways?in?cancer，?chemical?carcinogenesis-receptor?activation，?Lipid?and?atherosclerosis，?PI3K/Akt?pathway.?Molecular?docking?indicated?that?Biochanin?A?had?a?good?bonding?activity?with?the?key?targets.?Conclusion?Biochanin?A?may?play?a?role?in?the?treatment?of?glioma?by?inhibiting?tumor?cell?proliferation，?inducing?apoptosis?and?enhancing?chemotherapy?sensitivity.?The?study?built?a?foundation?for?drug?development?and?innovative?research.

[Key?words]?Biochanin?A;?Gliomas;?Network?pharmacology;?Molecular?docking

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，起源于膠質(zhì)細(xì)胞，增殖快，侵襲性強(qiáng)，預(yù)后極差[1]。它是最復(fù)雜的癌癥類型之一，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的45%，5年生存率約為5%[2]。膠質(zhì)瘤的主要治療方法是基于經(jīng)典的Stupp方案，包括手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后放療和替莫唑胺化療。此外，免疫治療、靶向治療和其他新的治療方法在膠質(zhì)瘤的治療方面取得了很大的進(jìn)展。然而總體結(jié)果仍然不令人滿意，治療后易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[3]。中醫(yī)具有完整的理論體系和辨證論治的主導(dǎo)思想，在增效減毒，改善臨床癥狀，提高生活質(zhì)量，降低復(fù)發(fā)率，延長(zhǎng)患者生存期等方面發(fā)揮重要作用，是神經(jīng)膠質(zhì)瘤防治的重要方法。

鷹嘴豆芽素A（Biochanin?A，BCA）是一種存在于紅三葉草、鷹嘴豆、大豆、花生等豆科植物中的含異黃酮的天然化合物，在體內(nèi)某些生理和病理過(guò)程中可以起到植物雌激素的作用。大量研究表明，鷹嘴豆素Ａ具有防治骨質(zhì)疏松、降血脂、抗氧化、抗炎、抗菌和抗腫瘤等生物學(xué)功能[4]。與其他一些植物雌激素在婦科癌癥中的促進(jìn)作用不同，BCA還對(duì)咽鱗癌、肝細(xì)胞性肝癌、胰腺癌、前列腺癌和結(jié)腸腫瘤有抗腫瘤作用[5]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，綜合分析鷹嘴豆素Ａ的作用靶點(diǎn)及其與神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)的作用途徑，以期發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆素A治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的潛在作用靶點(diǎn)，闡明鷹嘴豆素A治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用機(jī)制。

1??資料與方法

1.1??獲取藥物靶點(diǎn)

分別從TargetNet（http：//targetnet.scbdd.com/），TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），STITCH（http：//stitch.embl.de/）數(shù)據(jù)庫(kù)和Swiss?Target?Prediction平臺(tái)（http：//www.swisstargetprediction.ch/）查詢鷹嘴豆芽素A的藥物靶點(diǎn)，合并去重。

1.2??獲取神經(jīng)膠質(zhì)瘤靶點(diǎn)

以“Gliomas”為關(guān)鍵詞，從DisGeNET（https：//?www.disgenet.org/），GeneCards（https：//www.genecards.?org/），TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）數(shù)據(jù)庫(kù)檢索神經(jīng)膠質(zhì)瘤的靶點(diǎn)基因，獲得的疾病靶點(diǎn)合并去重后在UniProt（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.3??構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

為進(jìn)一步明確BCA治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的潛在作用靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，將篩選出的BCA和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)獲取蛋白互作信息，物種設(shè)為“Homo?sapiens”，設(shè)置互作強(qiáng)度大于0.4，隱藏沒(méi)有相互作用的靶點(diǎn)，借助Cytoscape?3.9.1軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行進(jìn)一步分析和可視化。

1.4??富集分析以及通路分析

對(duì)BCA治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤潛在靶點(diǎn)通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.?gov/tools.jsp）進(jìn)行基因本體論富集分析（gene?ontology，GO），檢索其生物過(guò)程（biological?process，BP），分子功能（molecular?function，MF），細(xì)胞組分（cellular?component，CC）與京都基因和基因組百科全書(shū)（Kyoto?encyclopedia?of?genes?and?genomes，KEGG）通路富集分析。分別選取前10個(gè)進(jìn)行富集分析繪制富集分析圖。

1.5??分子對(duì)接

通過(guò)Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.?gov/）檢索獲得BCA的3D結(jié)構(gòu)，從PDB（http：//?www.rcsb.org/pdb/home/home.do）中檢索獲取關(guān)鍵靶點(diǎn)的受體蛋白，將活性成分的3D結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵靶點(diǎn)的受體蛋白結(jié)構(gòu)上傳至在線分析平臺(tái)DockThor[6]（https：//dockthor.lncc.br/v2/）進(jìn)行分子對(duì)接，利用Pymol軟件通過(guò)加氫，去除水分子等步驟，對(duì)受體和配體之間的相互作用進(jìn)行可視化。

2??結(jié)果

2.1??藥物和疾病靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

利用TCMSP、Swiss?Target?Predication等數(shù)據(jù)庫(kù)檢索BCA對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，整理后去重，在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，共得到BCA藥物靶點(diǎn)149個(gè)。

通過(guò)GeneCards、DisGeNET、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)檢索神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)靶點(diǎn)基因，最后將3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)基因匯總后去重，即得到神經(jīng)膠質(zhì)瘤的相關(guān)靶點(diǎn)基因5654個(gè)。建立成分靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集，對(duì)活性成分和疾病靶點(diǎn)取交集，獲得97個(gè)相交靶點(diǎn)，繪制韋恩圖（圖1）。

2.2??鷹嘴豆芽素A治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)分析

為進(jìn)一步揭示鷹嘴豆芽素A抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用機(jī)制，用Cytoscape軟件繪制97個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖（用Degree值排序關(guān)鍵靶點(diǎn)），Degree值越高表明該靶點(diǎn)與疾病的關(guān)聯(lián)性越高。整合后，保留了6個(gè)degree值最高的作為鷹嘴豆芽素A治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵靶點(diǎn)EGFR、ESR1、HSP90AA1、MMP9、PPARG、PTGS2。

2.3??GO和KEGG富集分析

對(duì)BCA與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的潛在靶點(diǎn)通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO富集分析得到BP359條，CC60條，MF121條，共540條，分別篩選前10條作富集分析圖（圖2）。生物過(guò)程包括蛋白質(zhì)磷酸化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、RNA聚合酶調(diào)節(jié)；細(xì)胞組成包括質(zhì)膜、胞液、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等；分子功能包括蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合、DNA結(jié)合、蛋白激酶活性等。KEGG通路富集分析108條，選取P值最小的前20條通路并制作成氣泡圖，主要富集于腫瘤通路、化學(xué)致癌作用-受體活性、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、PI3K/Akt、神經(jīng)活性受體配體、CAMP信號(hào)通路、活性氧等信號(hào)通路具體通路結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.4??分子對(duì)接

選取神經(jīng)膠質(zhì)瘤PPI網(wǎng)絡(luò)中degree較高的6個(gè)核心蛋白EGFR、ESR1、HSP90AA1、MMP9、PPARG、PTGS2進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接結(jié)合能見(jiàn)表1。根據(jù)Dockthor計(jì)算，配體與受體相結(jié)合時(shí)，所需結(jié)合能越低，結(jié)合就越穩(wěn)定，效果越好。將結(jié)果導(dǎo)入Pymol軟件進(jìn)行可視化，得到分子對(duì)接三維圖（圖4）。

3??討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的中位生存期很少超過(guò)18個(gè)月，預(yù)后極差，所以確定膠質(zhì)瘤患者新的治療方案至關(guān)重要[7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種有前途的生物信息學(xué)方法，可以從整體水平上系統(tǒng)地了解藥物與其靶標(biāo)之間相互作用的分子機(jī)制及其在疾病中的意義[8]。近年來(lái)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已被用于預(yù)測(cè)某些化合物在多種疾病中的有效靶點(diǎn)和途徑，尤其是與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)的癌癥。分子對(duì)接技術(shù)是從已知的蛋白質(zhì)和小分子化合物出發(fā)，通過(guò)模擬蛋白質(zhì)的幾何構(gòu)型和能量匹配來(lái)識(shí)別藥物的重要方法[9]。

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)BCA治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)其中degree值較大的6個(gè)靶點(diǎn)為EGFR、ESR1、HSP90AA1、MMP9、PPARG、PTGS2。EGFR是表皮生長(zhǎng)因子受體其與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡等有關(guān)。BCA和替莫唑胺聯(lián)合應(yīng)用對(duì)U-87和T98膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞通過(guò)調(diào)控p-ERK、p-AKT、EGFR及c-Myc的水平，BCA增強(qiáng)替莫唑胺抗腫瘤作用，增強(qiáng)化療藥物的敏感性[10]。ESR1是雌激素受體，鷹嘴豆芽素A屬于異黃酮類植物雌激素，其分子結(jié)構(gòu)和大小類似于雌激素，可以發(fā)揮雌激素作用，可以起到神經(jīng)保護(hù)的作用[11]。

研究證明BCA在缺血缺氧再灌注大鼠模型中通過(guò)減輕腦水腫、減少腦梗死面積起到神經(jīng)保護(hù)作用[12]。HSP90AA1屬于熱休克蛋白90α家族，在腦膠質(zhì)瘤組織中HSP90蛋白的表達(dá)水平上調(diào)是腫瘤細(xì)胞增殖和產(chǎn)生耐藥的關(guān)鍵蛋白，與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[13]。PPARG調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化并控制脂質(zhì)和葡萄糖穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因的表達(dá)。PPARG通過(guò)抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生具有抗炎作用[14]。PTGS2是花生四烯酸合成前列腺素的限速酶，在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)。Tan等[7]研究發(fā)現(xiàn)PTGS2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤放療耐藥患者中高表達(dá)，可激活NF-κB信號(hào)通路，防止放療后DNA損傷。PTGS2可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，提高放射耐受性。MMP9是基質(zhì)金屬蛋白酶，參與多種腫瘤的病理學(xué)過(guò)程。有研究表明，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者血清中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP1、MMP2、MMP9水平明顯升高，與腫瘤分期和臨床分期呈正相關(guān)，和預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[15]。BCA可通過(guò)降低MMP9的酶活性導(dǎo)致U87膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的侵襲性降低[16]。

GO功能分析顯示，BCA主要通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡過(guò)程、一氧化氮生物合成、缺氧和炎癥反應(yīng)等方面參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療。KEGG通路富集分析表明，癌癥通路、PI3K-Akt、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、活性氧等信號(hào)通路是治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的主要作用機(jī)制。激活的PI3K/AKT/mTOR途徑增加了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，導(dǎo)致血管無(wú)力，血流緩慢和間質(zhì)壓力上升，該通路介導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移[17]。有研究表明鷹嘴豆芽素A有降血脂作用，在高脂血癥的小鼠中鷹嘴豆芽素A可降低低密度脂蛋白膽固醇和總膽固醇水平[18]。氧化應(yīng)激也是導(dǎo)致神經(jīng)變性、衰老、腫瘤發(fā)生的重要因素[19]，因此，清除自由基和激活細(xì)胞保護(hù)防御系統(tǒng)有利于健康。鷹嘴豆素Ａ可對(duì)神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)退行性疾病有保護(hù)作用[20]。

鷹嘴豆芽素A可能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K-Akt、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)受體配體、活性氧起作用。分子對(duì)接顯示，鷹嘴豆芽素A與EGFR、ESR1、HSP90AA1、MMP9、PPARG、PTGS2等關(guān)鍵靶點(diǎn)有較好的結(jié)合活性。綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)初步探討了鷹嘴豆芽素A治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的潛在作用機(jī)制，這是一個(gè)多靶點(diǎn)、多通路、多途徑的復(fù)雜過(guò)程。但本研究?jī)H從理論角度探討了其參與抗腫瘤的機(jī)制，后續(xù)研究可在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步開(kāi)展臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證，深入研究鷹嘴豆芽素A治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用機(jī)制。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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