急性心肌梗死中環(huán)狀RNA CDR1as位點(diǎn)篩選的研究

唐賽賽，孫秀梅，王海鳳，許夢婷，林 浩，李文勇

（1.山東中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，山東 煙臺 264199；2.濱州醫(yī)學(xué)院煙臺附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東 煙臺 264100；3.濱州醫(yī)學(xué)院煙臺附屬醫(yī)院腫瘤科，山東 煙臺 264100）

心肌梗死（myocardial infarct，MI）發(fā)病率逐年升高，且呈年輕化趨勢。近年來，一些個(gè)體中已有明顯的家族遺傳表現(xiàn)，提示遺傳因素在誘發(fā)MI過程發(fā)揮重要作用，而基因多態(tài)性是決定這種遺傳性的重要因素。因此，進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性（SNP）對比研究，可確定SNP位點(diǎn)與疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系[1-2]。位于X染色體q27.1的小腦變性相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物（CDR1as）也叫LINC00632。其作為miRNA-7海綿，通過抑制miRNA-7a活性而上調(diào)其靶基因聚ADP核糖聚合酶（PARP）和特異性蛋白1（SP1）[3]的表達(dá)，促進(jìn)MI進(jìn)程[4]。Shao等[5]研究發(fā)現(xiàn)CDR1as在糖尿病心肌病中促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡；Zhang等[6]研究發(fā)現(xiàn)MI患者外周血CDR1as表達(dá)水平明顯升高，這均提示CDR1as可作為心臟損傷輔助診斷的依據(jù)。因此，本研究對CDR1as基因中國漢族人群最小等位基因頻率（MAF）＞20%的SNPs位點(diǎn)（rs12688274、rs5907638、rs76284232）進(jìn)行分型，篩選出影響MI發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的SNPs位點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

①獲取基因在染色體上的位置信息。打開http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/Index，輸入基因 LINC00632，點(diǎn)擊“Go”進(jìn)入LINC00632基因信息界面，出現(xiàn)染色體上的位置為X:139,791,932-139,854,844。②VCF to PED Converter界面操作步驟。點(diǎn)擊“Tools”按鈕找到左側(cè)“VCF to PED Converter”打開并點(diǎn)擊“VCF to PED Converter”將CDR1as在染色體上的位置信息和Choose data collections or provide your own file URLs選擇Phase 3。Select one or more phase 3 populations選擇中國漢族北京人群（CHB），Base format選擇Numbers。勾選biallelic only，其他參數(shù)默認(rèn)，點(diǎn)擊run，如圖1所示。③等待刷新完畢，顯示done，點(diǎn)擊查看結(jié)果。下載ped和info文件，info文件存儲SNP的編號、位置信息，ped下載后將該文件解壓縮后與info文件放在同目錄下。④在Haploview里，默認(rèn)第一種輸入格式linkage format，Data File點(diǎn)擊Browser選擇之前保存的ped文件，info文件自動識別（也可“Browser”手動選擇info文件，其他參數(shù)不變，點(diǎn)擊“OK”導(dǎo)入數(shù)據(jù)）。進(jìn)入check marker界面，將根據(jù)哈代-溫伯格平衡定律的cut off值設(shè)為0.05，MAF設(shè)為0.2。其他參數(shù)默認(rèn)，點(diǎn)擊“rescore markers”自動篩選符合條件的SNP，在表格區(qū)域顯示在check markers篩選的SNPs。設(shè)置篩選條件，默認(rèn)r2閾值為0.8，r2＞0.8說明兩個(gè)位點(diǎn)高度連鎖，其他參數(shù)可不調(diào)整。確認(rèn)參數(shù)后，點(diǎn)擊run tagger，彈出篩選結(jié)果，得到15組（其中10個(gè)沒有和其他SNPs高度連鎖）。最后，根據(jù)位點(diǎn)在基因上的位置和MAF大于20%選出合適的位點(diǎn)進(jìn)行分析。

圖1

2 結(jié)果

2.1 CDR1as染色體位置在千人基因組中查找到CDR1as在染色體的位置為X: 139,791,932-139,854,844，用于VCF to PED Converter。

2.2 CDR1as中其他高度連鎖的染色體位置編號通過Haploview軟件得到CDR1as中其他高度連鎖的染色體位置編號，見表1。

表1 CDR1as中其他高度連鎖的染色體位置編號（MAF＞20%）

2.3 CDR1as中沒有高度連鎖的染色體位置CDR1as中其他沒有捕獲的染色體位置為X:139796996，X:139854816，X:139812042，X:139826741，X:139853006，X:139797629，X:139793630，X:139803812，X:139845866，X:139844407。

2.4 CDR1as的基因多態(tài)性結(jié)合NCBI上SNP位點(diǎn)在染色體的位置，挑選位于外顯子區(qū)域并且有轉(zhuǎn)錄本的SNPs，見表2。

表2 CDR1as的基因多態(tài)性

3 討論

MI常見以冠狀動脈粥樣硬化為基礎(chǔ)疾病的患者，在各種因素誘導(dǎo)下冠狀動脈斑塊破裂，心肌進(jìn)而急性缺血、缺氧，持續(xù)一段時(shí)間后引起心肌缺血性壞死。MI主要癥狀為持久且嚴(yán)重的心絞痛，常伴心律失常、低血壓、心力衰竭甚至休克，好發(fā)于老年人群。隨著人口老齡化加劇，MI發(fā)病率呈上升趨勢且逐漸年輕化，嚴(yán)重威脅生命安全，因此盡早識別、診斷對保護(hù)心肌正常細(xì)胞及改善患者預(yù)后十分關(guān)鍵。MI病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其危險(xiǎn)因素包括遺傳、抽煙、喝酒、年齡、性別等[7]。目前認(rèn)為MI是多基因參與、遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，遺傳因素不僅與MI發(fā)病相關(guān)，還影響MI進(jìn)展與預(yù)后情況。遺傳變異的主要物質(zhì)就是基因，基因在結(jié)構(gòu)上分為編碼區(qū)和非編碼區(qū)兩部分。真核生物的編碼區(qū)是不連續(xù)的，分為外顯子和內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄過程中會修剪內(nèi)含子，拼合外顯子形成轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。外顯子區(qū)域占整個(gè)人類基因組1%左右，卻包含85%左右的已知疾病的變異基因。相比全基因組測序，外顯子測序成本低，且可檢測到全基因組測序無法鑒定的SNP位點(diǎn)。最常見的遺傳變異是SNP，當(dāng)排除其他混雜因素時(shí)，一個(gè)遺傳標(biāo)記在病例組中出現(xiàn)的頻率明顯高于正常對照組，說明其與該疾病具有關(guān)聯(lián)性。

1976年，環(huán)狀RNA（circRNA）首次從RNA病毒中被檢測出來[8]，被認(rèn)為是線性RNA剪接錯(cuò)誤的產(chǎn)物[9]。但近年來，高通量測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用，研究發(fā)現(xiàn)很多人類疾病的發(fā)生發(fā)展與circRNA有關(guān)，circRNAs在心血管疾病發(fā)生和發(fā)展中的分子機(jī)制被探討和驗(yàn)證[10-13]，如circRNAs分子在人類、老鼠心臟內(nèi)廣泛表達(dá)，并可作為微型核糖核酸或相關(guān)蛋白的海綿分子，參與心血管疾病的調(diào)節(jié)過程[14]。且circRNA與線性RNA不同，其不具有5'端帽子和3'端尾結(jié)構(gòu)，呈共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不易受RNA外切酶降解，因此可在組織或體液中穩(wěn)定存在。這提示circRNA具有成為心血管疾病的分子診斷標(biāo)志物的潛力[15-16]。也有研究表明circRNA基因的多態(tài)性可影響自身的空間結(jié)構(gòu)，改變circRNA的表達(dá)及其調(diào)控的信號通路，進(jìn)而影響個(gè)體對心肌梗死的易感性[17]。Geng等[4]研究發(fā)現(xiàn)circRNA中的CDR1as參與MI的過程，發(fā)揮針對miR-7的“分子海綿”生物功能，與miR-7結(jié)合后miR-7活性受到負(fù)向調(diào)控，使miR-7對miR-7靶基因PARP和SP1的抑制作用下降，從而上調(diào)靶基因表達(dá)促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。MI發(fā)生后會引起心肌細(xì)胞凋亡、纖維化重塑等變化，嚴(yán)重影響心臟功能[18]。所以適當(dāng)減少心肌細(xì)胞凋亡對治療MI非常重要。

綜述所述，針對MI的研究中CDR1as可能作為一個(gè)新型潛在靶點(diǎn)，本文在CDR1as眾多個(gè)SNPs位點(diǎn)篩選出位于外顯子區(qū)域且有轉(zhuǎn)錄本的3個(gè)檢測位點(diǎn)分別為rs12688274、rs5907638、rs76284232，證明通過PubMed、千人基因組計(jì)劃和Haploview聯(lián)用可實(shí)現(xiàn)標(biāo)簽SNPs篩選，值得進(jìn)一步探索。這可能為后續(xù)研究CDR1as與MI的相關(guān)性節(jié)省大量人力物力，也可能為其他基因篩選SNP提供新的方法。