細(xì)胞外囊泡分析方法*

楊立敏,李景虹

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 化學(xué)與藥學(xué)院,青島 266109;2. 清華大學(xué) 化學(xué)系,北京 100084)

0 引言

細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)是細(xì)胞分泌的磷脂雙層囊泡,主要分為外泌體、微囊泡和凋亡小體[1]。目前,“外泌體”常用于指小EVs的混合群體。根據(jù)國(guó)際細(xì)胞外囊泡協(xié)會(huì)的命名建議,本文使用“EVs”表示不同的囊泡。EVs富含來源于親本細(xì)胞的生物活性成分,包括脂類、蛋白質(zhì)和核酸等信息,是細(xì)胞間通訊的載體,在不同的生理病理過程中發(fā)揮著重要作用[2]。EVs廣泛分布于大多數(shù)體液中,是液體活檢的有效生物標(biāo)志物之一,可用于非侵入性疾病診斷和治療效果監(jiān)測(cè),對(duì)疾病診斷及預(yù)后監(jiān)測(cè)具有重要價(jià)值[3]。因此,對(duì)EVs及其攜帶生物分子(蛋白質(zhì)、核酸分子)的分析已成為近年的研究熱點(diǎn)。

本文綜述了基于抗體或核酸適配體的EVs及其表面蛋白質(zhì)的高靈敏、高特異性檢測(cè)新方法;基于傳感探針直接遞送或膜融合介導(dǎo)傳感探針遞送的EVs內(nèi)部核酸的原位、準(zhǔn)確檢測(cè)新策略。最后對(duì)該領(lǐng)域未來的發(fā)展方向進(jìn)行了展望。

1 EVs直接分析

EVs是液體活檢的重要生物標(biāo)志物之一,其直接分析有利于非侵入性疾病的早期診斷。基于抗體和核酸適配體能夠特異性識(shí)別EVs這一特性,研究者們提出了一系列生物傳感新方法用于EVs高靈敏、高選擇性檢測(cè)。

1.1 基于抗體的EVs分析方法

抗體可特異性地識(shí)別并結(jié)合抗原,且對(duì)核酸酶降解具有抵抗力,已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究、醫(yī)學(xué)診斷和疾病治療中。Song等[4]發(fā)展了一種基于表面分子印跡技術(shù)的人工磁性膠體抗體用于EVs的快速分離和檢測(cè)(圖1(a)),實(shí)現(xiàn)了血漿中EVs的靈敏檢測(cè)。Jin等[5]利用上轉(zhuǎn)換納米粒子的光學(xué)性質(zhì)和全內(nèi)反射熒光成像技術(shù)的背景消除特性,實(shí)現(xiàn)了單一EV的檢測(cè),見圖1(b)。Lu等[6]將免疫金銀染色技術(shù)和泊松分布統(tǒng)計(jì)相結(jié)合,實(shí)現(xiàn)了無(wú)需細(xì)胞計(jì)數(shù)的高通量單一EV分析。Song等[7]結(jié)合智能手機(jī)開發(fā)了一種快速、靈敏、便攜的生物傳感器用于EVs的定量檢測(cè),見圖1(c)。

圖1 基于抗體的EVs分析方法

為解決臨床EV檢測(cè)面臨的樣品制備費(fèi)力和檢測(cè)通量有限等問題,Lee等[8]構(gòu)建了一種用于從血漿中快速分析腫瘤EVs的集成磁電化學(xué)裝置,樣品處理簡(jiǎn)單,無(wú)需對(duì)EVs進(jìn)行純化,實(shí)現(xiàn)了高通量檢測(cè)EVs。針對(duì)EVs的高度異質(zhì)性,Zhang等[9]基于磁性納米微球和熒光標(biāo)記技術(shù),提出了一種簡(jiǎn)單的微流控方法用于檢測(cè)兩種不同蛋白表達(dá)的EVs表型,見圖1(d)。Shi等[10]報(bào)道了一種簡(jiǎn)便的納米流體活檢測(cè)定方法,通過雙特異性生物標(biāo)記抗原共識(shí)別和捕獲策略,實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)腫瘤EVs的準(zhǔn)確檢測(cè)。

體液中含有高濃度的EVs,但也存在細(xì)胞碎片、水溶性或脂溶性代謝物和蛋白酶等干擾物。相比之下,眼淚不含這些干擾物,可認(rèn)為是一種“更清潔”的液體。建立無(wú)需樣品預(yù)處理的淚液內(nèi)EVs檢測(cè)方法,實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便、快速、高靈敏直接檢測(cè)淚液的EVs,對(duì)患者進(jìn)行診斷可能會(huì)更方便[11-12]。

1.2 基于核酸適配體的EVs分析方法

利用核酸適配體對(duì)EVs表面蛋白的特異性識(shí)別,是實(shí)現(xiàn)EVs表面蛋白質(zhì)檢測(cè)的有效途徑[13]。Luo等[14]基于DNAzyme觸發(fā)的組裝和去組裝系統(tǒng),通過普通離心方式即可實(shí)現(xiàn)EVs高效分離和精確定量,見圖2(a)。Wu等[15]提出了一種流動(dòng)多價(jià)磁界面用于腫瘤EVs的高效分離、超靈敏檢測(cè)及蛋白質(zhì)組學(xué)分析。Zhu等[16]開發(fā)了一種兩性離子電致化學(xué)發(fā)光傳感界面,實(shí)現(xiàn)了免標(biāo)記檢測(cè)EVs,見圖2(b)。

圖2 基于核酸適配體的EVs分析方法

將EVs識(shí)別與核酸信號(hào)放大策略結(jié)合是提高EVs檢測(cè)的有效途徑。Yang等[17]開發(fā)了一種基于三維(3D)DNA機(jī)器聯(lián)合機(jī)器學(xué)習(xí)算法的新策略,實(shí)現(xiàn)了EVs的穩(wěn)定、高靈敏檢測(cè)。Wang等[18]以靶標(biāo)EVs作為3D軌道,以分裂適體作為識(shí)別元件,開發(fā)了一種自助式跟蹤的DNA行走器,通過EVs糖蛋白分析實(shí)現(xiàn)了免清洗、準(zhǔn)確檢測(cè)腫瘤EVs,見圖2(c)。

熱泳技術(shù)利用溫度梯度下EVs的定向移動(dòng),高效地提取純化操作等過程,有利于實(shí)現(xiàn)EVs的簡(jiǎn)單、快速檢測(cè)。Sun等[19]研究了一種熱泳介導(dǎo)的DNA計(jì)算裝置用于腫瘤EVs的檢測(cè),見圖2(d)。進(jìn)一步將雙適體識(shí)別、聚乙二醇增強(qiáng)EVs熱泳累積和EVs膜上的AND門操作結(jié)合,建立了一步熱泳AND門操作分析方法,無(wú)需復(fù)雜的樣品制備與預(yù)處理,實(shí)現(xiàn)了在15 min內(nèi)的EVs直接檢測(cè)[20]。

2 EVs表面蛋白質(zhì)分析

EVs表面蛋白反映母細(xì)胞的信息,可區(qū)分不同的EVs亞群。開發(fā)EVs表面蛋白質(zhì)的精準(zhǔn)定量分析方法,準(zhǔn)確解析EVs蛋白異質(zhì)性和含量,對(duì)于疾病的診斷與病情評(píng)估具有重要意義。

2.1 基于抗體的EVs表面蛋白質(zhì)分析

EVs表面多種蛋白質(zhì)檢測(cè)可提供更多的分子信息。Revzin等[21]提出了一種電化學(xué)免疫分析方法(圖3(a)),實(shí)現(xiàn)了EVs表面兩種蛋白質(zhì)標(biāo)志物的定量檢測(cè)。Li等[22]基于微陣列的夾心免疫分析,開發(fā)了一種簡(jiǎn)單、靈敏的方法用于EVs表面蛋白質(zhì)的多重檢測(cè)。Chen等[23]研究了納米等離子體夾心免疫分析方法,實(shí)現(xiàn)了EVs表面程序性死亡配體1(PD-L1)的快速、高靈敏檢測(cè)。Qiao等[24]制備了磁性捕獲探針用于高效EVs的捕獲和釋放,實(shí)現(xiàn)了原位一步高通量篩選EVs PD-L1。Kelley等[25]提出了一個(gè)納米級(jí)細(xì)胞檢測(cè)平臺(tái)NanoEPIC,可對(duì)血漿中的sEV進(jìn)行表型分選和sEV PD-L1分析,對(duì)單個(gè)sEV具有高分辨率能力,見圖3(b)。

圖3 基于抗體識(shí)別的EVs表面蛋白質(zhì)分析

EVs表面單分子標(biāo)志物表達(dá)水平分析有利于鑒定EVs異質(zhì)性表型。Ko等[26]提出了一種無(wú)液滴的高靈敏、雙數(shù)字分析方法,實(shí)現(xiàn)了單個(gè)EV中絕對(duì)定量單個(gè)分子。基于雙成像單囊泡技術(shù),可實(shí)現(xiàn)單個(gè)EV表面蛋白分析和目標(biāo)特異性EV亞型的量化[27]。Weissleder等[28]提出了一種基于抗體的免疫測(cè)序方法,可從單個(gè)EVs中對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行多重測(cè)量。

2.2 基于核酸適配體的EVs表面蛋白質(zhì)分析

利用核酸適配體能夠特異性識(shí)別蛋白質(zhì)這一特性,研究者們提出了多種基于核酸適配體的EVs表面蛋白質(zhì)分析方法。Zhou等[29]基于可編程的DNA電路提出了一種熒光生物傳感方法,實(shí)現(xiàn)了EVs表面PD-L1靈敏、準(zhǔn)確測(cè)定。Liu等[30]建立了新型比率型電化學(xué)分析方法用于EVs表面蛋白質(zhì)的高靈敏檢測(cè),見圖4(a)。Ye等[31]設(shè)計(jì)了一種具有多重限制結(jié)構(gòu)的微流控芯片用于EVs的分離富集用于EVs表面蛋白表達(dá)量分析。

圖4 基于核酸適配體的EVs表面蛋白質(zhì)分析

通過多種適配體同時(shí)識(shí)別多種蛋白質(zhì),可建立EVs表面多種蛋白質(zhì)同時(shí)檢測(cè)方法[32]。基于聚合酶驅(qū)動(dòng)的邏輯信號(hào)放大系統(tǒng),Zhang等[33]建立了sEV表面蛋白質(zhì)特異性和超靈敏檢測(cè)新方法,見圖4(b)。基于滾環(huán)擴(kuò)增輔助的流式細(xì)胞術(shù)方法,可同時(shí)識(shí)別和分析4個(gè)EVs蛋白標(biāo)志物的細(xì)微差別[34]。

大多數(shù)EVs表面蛋白質(zhì)分析方法需要將EVs進(jìn)行分離與富集,該過程繁瑣耗時(shí),建立高靈敏、快速、低成本檢測(cè)新方法,無(wú)需EVs分離提取等操作是EVs相關(guān)研究的重點(diǎn)與熱點(diǎn)[35]。Sun等[36]利用微流控?zé)嵊靖患昂怂徇m體識(shí)別技術(shù),無(wú)需EV分離提取等操作,實(shí)現(xiàn)了多種EV膜蛋白的高靈敏、快速、低成本檢測(cè)。利用熱泳適體傳感器分析血漿EV的癌癥相關(guān)蛋白譜,結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)算法,發(fā)現(xiàn)8個(gè)EV蛋白標(biāo)記的加權(quán)總和可準(zhǔn)確識(shí)別轉(zhuǎn)移性乳腺癌,見圖4(c)[37]。

3 EVs核酸原位檢測(cè)方法

EVs內(nèi)部核酸的原位檢測(cè)可有效避免傳統(tǒng)方法繁瑣的分離與提取步驟,且可防止核酸降解產(chǎn)生的影響,具有高精準(zhǔn)性。為實(shí)現(xiàn)EVs核酸原位檢測(cè),通常采用直接遞送或膜融合方式將傳感探針遞送至EVs內(nèi)部。

3.1 基于傳感探針直接遞送的檢測(cè)策略

DNA納米探針可直接進(jìn)入EVs,且能夠?qū)鞲刑结樝拗圃诰植繚舛容^高的緊湊空間中,從而提高EVs內(nèi)核酸檢測(cè)的反應(yīng)速度與靈敏度[38]。為增加傳感探針在DNA納米結(jié)構(gòu)上的數(shù)量,Cao等[39]制備了多分支DNA結(jié)構(gòu),實(shí)現(xiàn)了高靈敏度檢測(cè)EVs內(nèi)miRNA。單一熒光信號(hào)易受復(fù)雜生物基質(zhì)的干擾,產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào),研究基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法可有效避免此問題,提高檢測(cè)準(zhǔn)確度[40]。此外,Li等[41]設(shè)計(jì)合成了一種雙加速DNA級(jí)聯(lián)放大器納米結(jié)構(gòu)用于EVs原位、超快和靈敏成像,見圖5(a)。

圖5 基于傳感探針直接遞送的原位檢測(cè)EVs核酸策略

基于Au納米顆粒的球形核酸探針在EVs原位檢測(cè)方面?zhèn)涫荜P(guān)注[42]。Duan等[43]發(fā)現(xiàn)Au納米耀斑探針能夠直接進(jìn)入EVs,且熒光信號(hào)增加,實(shí)現(xiàn)人血漿EVs中miRNA原位檢測(cè),見圖5(b)。基于Au納米探針研發(fā)的表面增強(qiáng)拉曼散射策略,可實(shí)現(xiàn)原位定量EVs內(nèi)miRNA,見圖5(c)[44]。

3.2 基于膜融合方式遞送傳感探針的檢測(cè)策略

傳感探針直接內(nèi)化進(jìn)入EVs的效率有限,可能會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。利用脂質(zhì)體與EVs膜融合策略,將其裝載的傳感探針遞送至EVs內(nèi),是原位檢測(cè)EVs內(nèi)部核酸的另一有效途徑。EVs表面帶有負(fù)電荷,制備正電荷表面的脂質(zhì)體便可通過靜電作用介導(dǎo)二者發(fā)生膜融合,將傳感探針遞送進(jìn)入EVs內(nèi)部,實(shí)現(xiàn)EVs核酸的原位檢測(cè)[45-46]。

在脂質(zhì)體和EVs上分別修飾核酸,通過拉鏈?zhǔn)紻NA雜交也可有效介導(dǎo)膜融合,將傳感探針遞送至EVs內(nèi),可縮短反應(yīng)時(shí)間,提高檢測(cè)效率,見圖6(a)[47]。EVs具有高度異質(zhì)性,不同EVs中miRNA的表達(dá)水平差異較大,將識(shí)別EVs標(biāo)志物的變構(gòu)適配體探針作為輸入單元構(gòu)建正交條形碼,利用智能脂質(zhì)體探針,可實(shí)現(xiàn)腫瘤EVs亞群追蹤及其miRNA原位分型[48]。

圖6 基于膜融合方式遞送傳感探針的原位檢測(cè)EVs核酸策略

受到自然囊泡運(yùn)輸?shù)膯l(fā),Yang等[49]開發(fā)了一種核酸適體介導(dǎo)的選擇性融合策略,用于原位檢測(cè)腫瘤EVs內(nèi)miRNAs,見圖6(b)。此外,Li等[50]基于癌細(xì)胞仿生囊泡特異性靶向同源腫瘤細(xì)胞分泌的EVs,見圖6(c),實(shí)現(xiàn)了循環(huán)EVs內(nèi)源RNA標(biāo)志物分選。

4 總結(jié)與展望

EVs攜帶豐富的核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物分子,與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),是液體活檢的生物標(biāo)志物之一。EVs及其攜帶生物分子的分析與研究有利于實(shí)現(xiàn)非侵入性疾病早期診斷和療效監(jiān)測(cè)。隨著對(duì)EVs生理和病理作用研究的不斷深入,開發(fā)EVs分析新方法的需求持續(xù)增長(zhǎng)。EVs攜帶的核酸與蛋白質(zhì)等分子可能因其母細(xì)胞類型和病理生理狀態(tài)而有很大差異。復(fù)雜生物流體中的循環(huán)EVs可能成為多種疾病的診斷、預(yù)后和療效監(jiān)測(cè)的潛在生物標(biāo)志物。因此,發(fā)展簡(jiǎn)單、快速、高靈敏度、高選擇性的分析方法,實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物樣品中EVs的高效分離與富集,進(jìn)一步對(duì)其攜帶生物分子進(jìn)行原位、準(zhǔn)確分析,可為探索其生理學(xué)功能提供重要的參考信息。總之,EVs及其攜帶生物分子的分析研究將有助于實(shí)現(xiàn)疾病的精準(zhǔn)診療。