蛋白多肽美拉德反應物穩定乳液的研究進展

王美月，布冠好，常永鋒，趙曉玲

（河南工業大學糧油食品學院，河南 鄭州 450001）

乳液是由兩種或兩種以上不相容的液體組成的分散體系，廣泛應用于食品工業中，如牛奶、黃油、奶類飲料、冰淇淋等的加工[1]。然而，乳液在加工、儲存或消耗過程中經常會出現不穩定現象（圖1），這些現象限制了乳液在食品工業中的應用[2]。因此，尋找合適的乳化劑和乳化方法，制備均勻穩定的乳液具有重要的實際意義。

圖1 乳液不穩定的現象Fig.1 Different phenomena of emulsion instability

蛋白多肽通常含有2～20 個氨基酸殘基，分子質量一般小于6 kDa[3]，與蛋白質相比，多肽具有更好的生理活性，其滲透性、溶解性及乳化性也較高[4]。通過蛋白質的酶法改性可以制備蛋白多肽，此方法通過限制性地破壞蛋白分子中的肽鍵，打開蛋白質的折疊結構，使疏水基團暴露出來，既能有效地提高其界面吸附性能，也能使其兩親性能得到顯著增強[5]。雖然這些蛋白多肽作為乳化劑能有效地形成乳液，但在穩定乳液方面效率較低，因為它們形成穩定表面膜的能力有限，易形成絮凝和聚結的乳液[6]。研究發現利用美拉德早期反應對蛋白多肽進行糖基化修飾[7]，可以有效增強蛋白多肽的乳化能力[8]。美拉德反應是一種非酶反應，在高溫下，還原糖與食物中蛋白質的游離氨基反應形成不同的糖共軛化合物，這些產物異構化形成Amadori重排化合物，包括Schiff堿（圖2）[9]。新的糖偶聯物不僅會增強食品的功能性[10-12]，且多糖吸附在油水界面，能夠降低界面張力，形成穩定的液滴。

圖2 美拉德反應初始階段反應原理[9]Fig.2 Reaction principle in the initial stage of the Maillard reaction[9]

美拉德反應對蛋白多肽乳液的穩定性具有促進作用。因此，本文將對蛋白多肽美拉德反應物形成乳液的穩定機制、理化特性、功能特性、影響乳液穩定性因素及其在遞送體系中的應用進行詳細闡述，旨在為構建穩定的蛋白多肽乳液及擴寬其在生物活性物質中的應用方面提供思路和參考。

1 蛋白多肽美拉德反應物穩定乳液的作用機制

1.1 影響乳液穩定性的相互作用

乳液在制備和儲存過程中，在各種條件下（如極端pH值、高鹽離子濃度、高溫等）容易失穩，影響乳液穩定性的相互作用一般分為兩類：空間位阻作用和靜電相互作用[13]。

空間位阻是影響乳液穩定的主要因素，它與乳液體系的界面性質密切相關（圖3A）。在乳液形成過程中，乳化劑吸附在液滴的油水界面上，形成穩定的乳液[14]。不同類型的乳化劑形成不同的界面層厚度，這對液滴間空間位阻的強度有很大影響，當乳化劑形成的界面層具有足夠的厚度時，乳化液會因受到強大的空間排斥力而穩定[15]。然而，當乳液液滴的外部殼層較薄時，形成的空間位阻作用較弱，無法維持乳液的穩定性，易導致乳液失穩。其中重力分離和Ostwald熟化現象的發生就是由于乳液不穩定造成的。

圖3 影響乳液穩定性的空間位阻作用（A）和靜電相互作用（B）Fig.3 Steric effects (A) and electrostatic interactions (B) affecting the stability of emulsions

當液滴的界面強度不足時，靜電相互作用對乳化液的穩定性起關鍵作用（圖3B）。靜電斥力的強度與液滴的電荷密度和離子強度有關，一旦靜電相互作用減弱，乳液就會變得不穩定[13]。在這種情況下，聚結和絮凝是乳液失穩的主要現象，此時液滴間相互吸引的作用（范德華力、疏水性和電荷的耗盡）大于相互排斥作用（如空間斥力和靜電斥力），聚結作用使小液滴的界面層破裂，之后融合在一起形成較大的液滴[16]。

1.2 美拉德反應對蛋白多肽乳液穩定性的影響機制

蛋白質水解會使其分解成小分子的多肽，并提高其溶解度，從而更有效地被界面層吸收[17]。同時，隨著水解液中游離氨基數量的增加，乳液表面張力降低，變得更加穩定[18]。但是，由于蛋白多肽在界面上的吸附較差，且空間位阻較弱，其穩定的乳液在長期儲存和極端條件下表現出的性能并不理想[19]。與糖類物質進行美拉德反應能夠提高蛋白多肽的功能特性[20]，蛋白多肽-糖類美拉德反應物穩定乳液的形成過程如圖4所示，此過程不僅能夠改善由于蛋白多肽分子質量過小而引起的乳化性不足的現象，還可以提高蛋白多肽擴散到油水界面上的速率[21]。蛋白多肽具有較快的界面吸附動力學速度，能有效地增強糖類物質在界面上的吸附，從而形成較厚的空間位阻層，提供靜電斥力，阻止液滴聚集[22]，增強乳液的穩定性。

圖4 蛋白多肽-糖類美拉德反應物的乳液形成過程Fig.4 Formation process of emulsions stabilized by Maillard reaction products from protein-derived peptides and carbohydrates

2 蛋白多肽美拉德反應物穩定乳液的理化特性

一般來說，粒徑大小是影響乳液穩定性的重要指標，粒徑越小的乳液對液滴聚集和重力誘導的相分離的抵抗力越強，也越穩定[21]。當乳液液滴間具有較高的Zeta電位時，靜電排斥力較大，乳液較穩定[23]。孟新宇[24]利用殼聚糖糖基化酪蛋白肽作為乳化劑制備穩定的乳液，發現當復合物親水親油平衡值為12時，乳液的Zeta電位絕對值最大，平均粒徑最小，此時的乳液最穩定。Pan Yi等[18]發現乳清蛋白水解物與糊精之間的共價交聯會提高油滴周圍界面膜的乳化性能和物理穩定性，有利于形成較小尺寸的液滴，此外，所有樣品的多分散指數均不高于0.208，表明油滴在乳液中分布均勻。乳液液滴之間具有較強的靜電排斥作用，可以抑制乳液發生乳析、絮凝及聚結。以脫酰胺玉米蛋白肽-多糖美拉德反應物為乳化劑制備乳液，發現Zeta電位絕對值隨著反應時間的延長而增大[25]。因此，美拉德反應能夠改善蛋白多肽穩定乳液的粒徑和Zeta電位，且粒徑越小，Zeta電位絕對值越大，乳液越穩定。

蛋白多肽的美拉德反應可以影響蛋白質的內部結構，進一步影響其乳化特性。Liu Lili等[26]利用紫外吸收光譜和傅里葉變換紅外光譜分析證實，酶解和糖基化可破壞卵清蛋白的球狀結構，形成緊密有序的網狀結構，增加與水和油的接觸面積，從而改善蛋白質的乳化性。Du Qiwei等[27]利用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察到經過高溫殺菌后，油滴和蛋白質均勻分布在乳清蛋白水解物-果膠穩定的乳液中，乳清蛋白水解物與果膠具有較高的接枝度，能夠抑制蛋白質變性和聚集，從而提高乳液的熱穩定性。

3 蛋白多肽美拉德反應物穩定乳液的功能特性

利用蛋白多肽與糖類物質進行美拉德反應制備的乳液具有較好的功能特性，如界面特性、乳化特性、流變學特性、抗氧化性、凍融穩定性等[28-30]。

3.1 界面特性

界面張力常被用來表征乳化劑的界面特性[31]，美拉德反應通過改變蛋白多肽的界面張力進而影響乳液的穩定性。侯楚楚[32]發現酪蛋白肽與阿拉伯膠形成的接枝物能夠顯著降低界面張力，且水解度較低的酪蛋白肽形成的接枝物在界面層能形成機械強度更高、黏彈性更好的界面膜。葡聚糖使玉米醇溶蛋白多肽的表面疏水性降低了53%，隨著葡聚糖的加入，乳液液滴大小和吸附量均減小，且與蛋白多肽相比，共軛復合物降低了氣水界面張力，提高了復合物的乳化性和乳化穩定性[33]。研究發現蛋白多肽美拉德反應物具有較高的表面活性，有利于增強乳液的穩定性。

3.2 乳化特性

蛋白質水解后在極端條件下乳化穩定性會有所降低，糖類物質可以通過空間位阻作用顯著提高其乳化性[34]，因此，美拉德反應可以進一步提高蛋白多肽穩定乳液的乳化性和乳液穩定性。Regan等[28]利用酪蛋白酸鈉水解物與麥芽糊精進行美拉德反應，結果表明，結合多肽通過空間穩定性在液滴表面形成了更大的聚合層，形成的乳液具有更好的乳化性能。乳液的乳化性和穩定性也受水解度和糖分子質量的影響，低水解度下的受控酶解可導致蛋白質分子的展開，在界面上產生表面活性多肽，并使蛋白質的微觀結構更加靈活，具有柔性結構的生物聚合物容易失去其三級結構，疏水基團直接指向界面的非水側，從而有利于吸附，提高乳液的穩定性[35]。Zhang Jinbo等[36]將β-伴大豆球蛋白與葡聚糖在干熱美拉德反應下進行偶聯，再經胰蛋白酶水解，發現低水解度的偶聯物有較高的乳化性和表面疏水性，可以有效地防止乳液發生橋聯絮凝。糖類物質的引入可使蛋白多肽的親水性提高，空間位阻增大，從而能夠防止油滴聚集。為了增加乳化性能，將胰蛋白酶部分水解的玉米醇溶蛋白與分子質量為2.5 kDa和6 kDa的葡聚糖進行美拉德反應，發現與分子質量2.5 kDa的葡聚糖偶聯的水解產物性能改善最大，且美拉德反應降低了玉米醇溶蛋白水解物的表面疏水性和界面張力，提高了乳化性和乳化穩定性[33]。因此，利用蛋白多肽與糖類物質進行美拉德反應制備的乳液具有較好的乳化特性，且與糖類物質的分子質量和水解度密切相關。

3.3 流變學特性

乳液的流變性和表觀黏度會影響乳液中油滴的平均尺寸和分布以及乳液的動力學穩定性[37]。蛋白質水解物的表觀黏度相比于蛋白質有所降低，可能是小肽分子沿流動方向空間擴散和重排的結果[38]。美拉德反應能夠有效改善蛋白多肽的流變特性。Cerme?o等[19]發現濃縮蛋白水解物乳液在儲存過程中彈性模量值降低，結構弱化，出現乳液失穩現象，而將濃縮乳清蛋白水解物與卡拉膠偶聯制備的復合物乳液在儲藏期間更穩定，其表觀黏度增加，粒子間碰撞減少，穩定性增強。于勇[39]發現馬鈴薯蛋白水解物-葡聚糖共聚物乳液表觀黏度大于由馬鈴薯蛋白制備的乳液，這表明馬鈴薯蛋白水解物-葡聚糖共聚物有效降低了乳液聚集現象的發生。由此可知，蛋白多肽美拉德反應物穩定乳液具有較高的黏彈性，能夠增強油水界面處物質間的相互作用力，有利于乳液的長期穩定性。

3.4 抗氧化性

美拉德反應產物具有較強的清除和猝滅自由基的能力，且產物中的羥基、還原吡咯和呋喃基團可以提供具有抗氧化活性的氫原子[40]。Pan Yi等[18]利用乳清蛋白水解物和線性糊精進行糖基化反應形成結合物，發現與共軛物穩定乳液相比，水解物穩定乳液在14 d的儲存期間氫過氧化物含量明顯增長。由于美拉德反應產物的抗氧化機制是清除自由基和螯合金屬離子[41]，因此，吸附在界面上的共軛物可以螯合過渡金屬，清除溶解在水相中的自由基，從而抑制脂質氧化。而且，含有長鏈糊精的結合物能夠阻止自由基鏈式反應，保護乳液中的油免受氧化[42]。綜上，蛋白多肽美拉德反應產物具有較強的自由基清除能力和金屬螯合能力，在遞送生物活性時能起到抗氧化的作用，有效提高生物活性物質的利用率。

3.5 凍融穩定性

冷凍保藏是延長食品保質期和保持其質構屬性最常用的處理方法之一[43]。然而，環境壓力會對蛋白質乳液穩定性產生影響，如凍融循環可能導致蛋白質乳液不穩定，嚴重限制了蛋白質在冷凍食品中的應用[44-45]。王喜波[46]和Wang Yuying[47]等將大豆蛋白酶解物與葡聚糖美拉德反應物穩定的乳液經過3 次凍融循環后發現，大豆分離蛋白酶解物-葡聚糖共聚物穩定的乳液沒有出現明顯的橋聯絮凝現象，相比于大豆分離蛋白-葡聚糖共聚物穩定的乳液，具有更好的凍融穩定性。酪蛋白水解物和羧甲基殼聚糖偶聯的水包油納米乳液經凍融處理后粒徑分布均勻，比酪蛋白納米乳液的油滴更不容易聚結[48]，這可能是由于蛋白質水解后球形結構的數量減少，界面處展開肽結構的構象靈活，促進了黏彈性界面層的形成[49]。Yu Jie等[50]以大豆蛋白酶解物和葡聚糖的復合物為乳化劑制備的乳液經3 次凍融循環后，發現其乳液脫油率、粒徑、絮凝度和聚結度均小于大豆蛋白-葡聚糖復合物的乳液，且凍融處理后大豆蛋白水解物和葡聚糖復合物形成的乳液更穩定。綜上，美拉德反應處理后的蛋白多肽穩定的乳液具有較好的凍融穩定性，可作為冷凍食品的有效乳化劑。

4 蛋白多肽美拉德反應物乳液穩定性的影響因素

4.1 內部因素

4.1.1 水解度

蛋白質的酶解暴露了多肽的疏水區域，增加了多肽的分子柔性，從而了改善蛋白的乳化性[51]。然而，較高的水解度可能會產生大量的游離氨基酸和短肽鏈，延遲多肽在油水界面上的吸附，降低其乳化性，同時，深度水解后的產物具有不良風味，如苦味、澀味[52]。Hou Chuchu等[53]以酪蛋白疏水肽為修飾劑，通過干法美拉德反應改善酪蛋白的乳化特性，結果表明，當水解度為1.5%時，乳液粒徑最小，在儲藏期間最穩定，且偶聯物的乳化能力是阿拉伯樹膠的46 倍，乳化穩定性是阿拉伯樹膠的21 倍。Ding Yue等[29]將大豆蛋白水解物和麥芽糊精進行干法糖基化反應，結果表明當大豆蛋白水解度為8%時，乳液的液滴尺寸較小，大多數液滴團簇較小，這防止了液滴絮凝，顯著提高了乳液穩定性，因此，適度的水解有利于乳液的穩定。Regan等[28]將酪蛋白酸鈉通過有限、中度和高度水解得到3 種產物，分別與麥芽糖糊精進行干法美拉德反應，在形成乳液時，每種共軛復合物穩定乳液的平均脂肪球大小均小于相應的水解物穩定乳液，經過7 d儲存后，有限和中度水解的美拉德反應共軛復合物穩定乳液儲存穩定性有所提高。由此可知，水解度是影響蛋白多肽形成乳液的重要因素之一，可以通過調節蛋白質的水解度提高乳液的穩定性。

4.1.2 糖分子質量

近年來，有研究證明糖分子質量大小也能影響美拉德反應對蛋白多肽的改性。Li Weiwei等[54]研究了糖鏈長度對大豆蛋白水解物美拉德反應物乳液穩定性的影響，結果表明，乳液的穩定性隨著糖鏈長度的增加而增加，由于大豆肽-葡聚糖復合物緊密排列，在油水界面處形成了較厚的吸附層，為絮凝提供了空間位阻。齊明[55]利用苦蕎蛋白水解物與不同分子質量的糖類（葡萄糖、麥芽糊精、葡聚糖）進行美拉德反應，發現苦蕎蛋白水解物與葡聚糖反應的復合物穩定的乳液具有最小的粒徑和最大的Zeta電位絕對值，復合物不僅具有較好的乳化活性和乳化穩定性，其穩定的乳液也具有更好的穩定性。同樣的，利用葡萄糖、麥芽糊精、葡聚糖對豌豆蛋白水解物進行改性，在所有糖類中，葡聚糖和豌豆蛋白水解物偶聯制備的乳液穩定性最好[56]。由此可知，隨著糖分子質量的增加，乳液液滴的外部殼層厚度增加，空間位阻作用增強，乳液的穩定性提高。此外，葡聚糖具有較大的分子質量，能最大程度地修飾蛋白水解物的空間結構，顯著改善水解物的乳化性，因此，研究中常利用蛋白多肽-葡聚糖美拉德反應物制備穩定的乳液。

4.1.3 反應時間

美拉德反應能夠提高乳液的穩定性，但過度反應會導致其乳化能力下降。Xu Jing等[41]用堿性蛋白酶制備黑豆蛋白水解物，再與葡萄糖進行濕法糖基化反應，孵育時間為1～6 h，結果表明，黑豆蛋白水解物-葡萄糖偶聯物在孵育4 h時，不僅乳化活性和溶解性提高，其還原力和羥自由基清除率也有所增強。馬雙雙[57]研究了玉米蛋白水解物和半乳糖反應3 h和6 h得到的糖基化反應物的功能特性，發現當反應時間為6 h時，復合物的乳化性最好、泡沫穩定性最強，說明充分反應使蛋白質疏水基團暴露出來，親油基團增多，乳液的穩定性提高。張亞婷[58]比較了大豆蛋白酶解物與麥芽糊精的不同反應時間（120、180、240、270、300 min）對乳液穩定性的影響，發現當反應時間為270 min，乳液的粒徑較小，而到300 min時，乳液粒徑顯著增大，這表明此階段的酶解接枝產物乳化能力有所下降，可能是由于美拉德反應進行到后期階段產生了大分子聚合物，影響了反應物的溶解性，從而導致其乳化能力出現一定程度的下降。

4.2 環境因素

許多類型的大分子乳化劑都會受到環境的影響，如在極端條件下（極酸性或極堿性pH值、高鹽離子濃度、高溫等）會失去乳化能力[59]。Arsa等[60]研究了不同pH值（7～10）對米糠蛋白水解物-果糖美拉德反應產物乳液的影響，發現隨著pH值的增加，乳液乳化性和乳化穩定性逐漸增強，pH值為10時，美拉德反應最快，乳化能力最強，這與蛋白質分子的展開有關。美拉德反應物具有較強的空間位阻效應，酪蛋白水解物和羧甲基殼聚糖經美拉德反應制備的偶聯物穩定的納米乳液在pH 4.0條件下沒有出現絮凝物，而酪蛋白穩定的納米乳液出現了許多絮凝體，且在酸性pH值條件下，相比單獨吸附的酪蛋白，偶聯物的吸附層為納米乳液提供了更有效的空間位阻作用，顯著提高了納米乳液的穩定性[48]。侯楚楚[32]發現單獨的酪蛋白肽在酸性乳液中非常不穩定，加入NaCl后，酪蛋白肽在貯存過程中乳液平均粒徑增大，在相同離子強度的體系中，酪蛋白肽-阿拉伯膠接枝物所形成的水包油乳液在儲存28 d后，平均粒徑的增大幅度明顯減小。阿拉伯樹膠與β-乳球蛋白穩定的乳液在4 ℃保存4 周，表現出較高的物理穩定性，這可能是由于低溫抑制了液滴的運動速度，導致乳液的遷移率降低，乳液液滴之間的相互吸引力減弱，從而防止了油相分離[61]。在熱處理過程中，停留在界面上的蛋白質水解物變性，表面電荷損失，樣品的Zeta電位絕對值急劇下降[59]，Drapala等[62]將乳清蛋白水解物和麥芽糊精進行濕法接枝，發現偶聯物在經過熱處理（95 ℃、15 min）后Zeta電位絕對值增大，表現出較好的穩定性。因此，美拉德反應提高了蛋白多肽穩定的乳液在極端條件下的穩定性。

5 蛋白多肽美拉德反應物穩定乳液的應用

許多生物活性物質在應用過程中易出現水溶性差、化學穩定性差、生物利用率低等問題[63]?；趯κ称分猩锘钚晕镔|的包封、保護和釋放優勢，蛋白多肽美拉德反應物及其乳液遞送體系在食品工業中受到了廣泛的關注[64]，表1總結歸納了此方面的相關文獻。圖5展示了蛋白多肽美拉德反應物穩定乳液包埋生物活性物質的過程?？偟貋碚f，由蛋白多肽與糖類物質進行美拉德反應得到的產物穩定的乳液體系可以有效地包封和保護生物活性物質、提高生物活性物質的穩定性、促進鈣離子的吸收、提高活性物質的抗氧化活性及生物利用率等。

表1 蛋白多肽美拉德反應物在遞送體系中的應用Table 1 Application of Maillard reaction products from proteinderived peptides in delivery systems

圖5 蛋白多肽美拉德反應物穩定乳液包埋生物活性物質的過程Fig.5 Process for the encapsulation of bioactive substances in emulsions stabilized by Maillard reaction products from protein-derived peptides

6 結語

乳液對活性物質的遞送作用是目前食品領域研究的熱點之一，蛋白多肽美拉德反應物穩定的乳液具有較好的理化特性和功能特性，能夠有效地遞送生物活性物質，提高其生物利用率。研究發現，蛋白多肽美拉德反應物穩定乳液會受到水解度、糖分子質量、反應時間、環境等多種因素的影響，然而，目前該乳液的作用機制并不完善，需要進一步研究不同肽段對反應過程的影響，也可利用物理或化學方法輔助美拉德反應過程，制備更加穩定的蛋白多肽美拉德反應物乳液，同時通過體外消化實驗、細胞實驗和動物實驗驗證乳液在遞送生物活性物質方面的應用效果。