特丁基對苯二酚在不同油脂貯存過程中轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的識別、分離與鑒定

徐夢琪，祝振杰，陳小軍，李 軍，畢艷蘭,

（1.河南工業(yè)大學糧油食品學院，河南 鄭州 450001；2.中原食品實驗室，河南 漯河 462300；3.河南啟億糧油工程技術(shù)有限公司，河南 鄭州 450001）

油脂氧化是造成油脂及富油食品品質(zhì)劣變的主要因素之一，添加抗氧化劑可有效延緩脂質(zhì)氧化并延長貨架期。具有代表性的合成抗氧化劑特丁基對苯二酚（tertbutylhydroquinone，TBHQ）具有優(yōu)良的抗氧化效果[1-3]，GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》中規(guī)定在油脂中最大添加量為200 mg/kg。TBHQ在油脂中發(fā)揮抗氧化作用的機理是酚羥基提供氫質(zhì)子與油脂中的自由基（R·、RO·或ROO·）反應，自身形成穩(wěn)定的自由基共振體，阻斷自由基鏈式反應[4-6]。因含有兩個活潑的酚羥基，油脂中的TBHQ在貯存過程中易發(fā)生轉(zhuǎn)化導致其含量降低[7]。

研究發(fā)現(xiàn)大豆油和豬油在室溫條件下貯存2 個月后，TBHQ的檢測量比實際添加量分別減少了11%和56%[8]。食品企業(yè)也常有檢測到的油脂中TBHQ實際含量與其標識添加量不符的現(xiàn)象，例如熔點為33 ℃的棕櫚油作為煎炸用油時常加入TBHQ延緩氧化[9]，為了方便使用，通常會以60 ℃保溫運輸貯存。在煎炸使用前檢測到TBHQ含量僅為初始添加量的10%～80%，企業(yè)會質(zhì)疑TBHQ的含量降低導致其抗氧化效果不能保障油脂使用過程中的品質(zhì)。因此，TBHQ在油脂貯存條件下的轉(zhuǎn)化逐步被關(guān)注。

在高溫加熱條件下，關(guān)于油脂中TBHQ損耗的研究很多，其結(jié)論是加熱情況下TBHQ以揮發(fā)和轉(zhuǎn)化的形式損耗，主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是叔丁基對苯醌（2-tert-butyl-1,4-benzoquinone，TBBQ）[10-12]，揮發(fā)產(chǎn)物包括TBHQ和TBBQ[13]。但是目前關(guān)于油脂常溫貯存條件下TBHQ轉(zhuǎn)化情況的研究較少。Li Jun等[14]研究發(fā)現(xiàn)在常溫貯存過程中，TBHQ也會緩慢損失，添加200 mg/kg TBHQ的豬油貯存8 周，TBHQ轉(zhuǎn)化為TBBQ的量為48.02 mg/kg，且TBHQ和TBBQ含量總和比原始添加量減少了16 mg/kg。隨著常溫貯存時間的延長，TBHQ的減少量大于TBBQ的生成量，這說明常溫貯存的油脂中TBHQ的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物除了TBBQ外，可能還生成了新物質(zhì)，這個假設在2019年被Xu Xiaolan等[15]研究證實，其發(fā)現(xiàn)在室溫貯存下含TBHQ豬油（不含任何天然抗氧化劑）中分離出TBHQ另一種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物2-(2-甲基烯丙基)氫醌（2-methylallylhydroquinone，MAHQ），而MAHQ是否也在其他油脂中存在，并且是否會受油脂中的天然抗氧化劑影響，目前鮮見研究報道。

因此，本研究選用含有生育酚的大豆油[16]、含有生育酚和生育三烯酚的棕櫚油[17]以及豬油作為原料，研究貯存過程中TBHQ在不同油脂中的轉(zhuǎn)化情況，識別和鑒定TBHQ轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，并對其結(jié)構(gòu)進行表征，考察不同種類油脂中TBHQ轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是否一致，旨在為科學應用TBHQ提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

精制食用豬油（不含任何抗氧化劑）天津九源油脂有限公司；一級大豆油（不含任何外源抗氧化劑）山東香馳控股有限公司；煎炸用棕櫚油（不含任何外源抗氧化劑）白象食品股份有限公司；TBHQ（純度＞98%）阿拉丁試劑（上海）有限公司。

甲醇、正己烷（均為色譜純）上海麥克林生化科技有限公司；氘代甲醇（純度≥99.8%）劍橋同位素實驗室公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

8890氣相色譜儀（配有氫火焰離子化檢測器及OpenLAB CDS色譜工作站）、1290液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧電離源（electro-spray ionization，ESI））、Mass Hunter Workstation數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 美國Agilent公司；AVANCE III 500MHz核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）波譜儀、INVENIO S傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）瑞士Bruker公司；TU-1810紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；Rancimat 892油脂氧化穩(wěn)定性分析儀 瑞士萬通科技公司。

1.3 方法

1.3.1 原料油脂基本理化指標

參照GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的測定》、GB 5009.229—2016《食品中酸價的測定》、GB 5009.227—2016《食品中過氧化值的測定》分別測定脂肪酸含量、酸價和過氧化值。氧化誘導期的測定參考GB/T 21121—2007《動植物油脂 氧化穩(wěn)定性的測定》，參數(shù)設置：空氣流量：20 L/h；加熱溫度：110 ℃；樣品質(zhì)量：（3.00±0.01）g；測量池蒸餾水用量：60 mL。生育酚含量的測定參考AOCS Official Method Ce 8-89Determination of Tocopherols and Tocopherols in Vegetable Oils and Fats by HPLC，色譜柱：Sun Fire Prep Silica柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相正己烷-異丙醇（99∶1，V/V）；進樣量：20 μL；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；熒光檢測器：發(fā)射波長330 nm，激發(fā)波長290 nm。

1.3.2 油樣的配制

分別取一定量的大豆油、豬油（于55 ℃水浴至完全融化）和棕櫚油（于60 ℃水浴至完全融化），準確稱取0.1 g（精確至0.1 mg）TBHQ溶于499.9 g上述油脂中，準確稱取1.25 g（精確到0.1 mg）FeCl3·6H2O溶解于50 mL鹽酸溶液中，得到Fe3＋質(zhì)量濃度為0.5 g/100 mL的溶液。使用移液管準確量取上述Fe3＋溶液0.1 mL于油樣中得到含1 mg/kg Fe3＋的油樣。混合均勻后分別密封保存在塑料（大豆油）和玻璃（豬油、棕櫚油）樣品瓶中，大豆油和豬油室溫（（20±5）℃）貯存，棕櫚油60 ℃保溫貯存。

1.3.3 油樣中TBHQ及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的提取

油樣中TBHQ及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的提取方法參考美國分析化學家協(xié)會的標準方法和楊李勝等[18]的萃取方法，結(jié)合本實驗作出調(diào)整，準確稱取（2.00±0.01）g油樣于試管中，分3 次加入10 mL色譜級甲醇（4、3、3 mL），封口渦旋3 min，然后4 ℃、3000 r/min離心5 min，移取上清液定容至10 mL，封口置于－18 ℃冰箱中冷凍保存4 h去除多余脂質(zhì)，吸取上清液過0.22 μm有機濾膜后裝入氣相小瓶，待氣相色譜測定。

1.3.4 油樣中TBHQ及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的檢測

油樣中TBHQ及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的檢測方法采用氣相色譜法，參考Cacho[19]、葉沁[20]、周玨[21]等的氣相色譜條件：HP-5毛細管柱（30 m×320 μm，0.25 μm）；升溫程序：起始溫度60 ℃，保持2 min，然后以10 ℃/min升溫至250 ℃，保持2 min；載氣：氮氣，純度99.999%，流速1 mL/min；進樣口溫度：230 ℃；進樣量：1 μL；進樣方式：不分流進樣；檢測器：火焰離子化檢測器；檢測器溫度：250 ℃；空氣流速：300 mL/min；氫氣流速：30 mL/min；氮氣流速：25 mL/min。

1.3.5 油樣中TBHQ及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離純化

油樣中TBHQ 及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離純化采用制備型液相色譜（preparative liquid chromatography，Prep-LC）技術(shù)，參考彭毓敏等[22]的方法，結(jié)合本實驗作出相應調(diào)整。采用Waters 2545制備液相色譜儀；檢測器：Waters 2489紫外檢測器；色譜柱：XBridge Prep C18（19 mm×250 mm，5 μm）；流量：5 mL/min；進樣量：300 μL；紫外檢測波長：280 nm；柱溫箱：35 ℃。流動相：溶劑A是水，溶劑B是甲醇，等度洗脫：流動相A為60%，流動相B為40%；洗脫時間：20 min。將對應色譜峰的物質(zhì)使用餾分收集器收集于10 mL玻璃試管中，待分析。

1.3.6 油樣中TBHQ及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的鑒定與表征

1.3.6.1 超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜（ultrahigh performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）分析

使用UPLC-Q-TOF-MS分析TBHQ及其在油脂中轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的準確相對分子質(zhì)量以及離子碎片信息，參考倪冰冰[23]和Shin[24]等的方法，結(jié)合本實驗作出相應調(diào)整。液相色譜條件如下，色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱（50 mm×2.0 mm，1.8 μm）；流動相A：水，流動相B：乙腈；流速：0.3 mL/min；等度洗脫：流動相A 40%，流動相B 60%；柱溫箱：35 ℃；進樣量：1 μL。

質(zhì)譜參數(shù)如下，離子源：ESI；離子模式：負離子，MS和MS/MS兩種模式；毛細管電壓：3500 V；Fragmentor電壓：175 V；噴嘴電壓：1000 V；鞘氣溫度：350 ℃，流速：11 L/min；干燥器溫度：200 ℃，流速：12 L/min；碰撞電壓：25～40 V；ESI掃描范圍：50～500。

1.3.6.2 NMR分析

樣品預處理：取純化后的TBHQ、TBBQ和化合物1、2、3溶解于0.6 mL氘代甲醇，完全溶解后轉(zhuǎn)移至核磁管內(nèi)。儀器：AVANCE III 500 MHz；溫度：298 K；一維氫譜：采用30°小角度激發(fā)，空掃兩次，采樣掃描128 次；一維碳譜：采用組合脈沖去耦，空掃4 次，采樣掃描1024 次[25]。

1.3.6.3 紫外光譜分析

取純化后的TBHQ、TBBQ和化合物1、2、3用甲醇配制成20 mg/L工作液，紫外分光光度計設置波長間隔為1 nm，波長范圍為200～400 nm，掃描速度為快速，以甲醇為參照對基線進行校正，將待測油樣裝入石英比色槽2/3高度處進行光譜掃描，得到模擬曲線。

1.3.6.4 FTIR分析

取純化后的TBHQ、TBBQ和待測物于真空干燥箱中烘干，并按1∶100比例與KBr充分研磨，再壓制成均勻透明薄片，采用FTIR測定，掃描范圍4000～400 cm－1、分辨率4 cm－1、連續(xù)掃描次數(shù)32 次，得到模擬曲線。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 原料油脂脂肪酸組成及主要理化指標分析

由表1、2可知，所選用原料油脂初始理化指標均符合GB/T 8937—2006《食用豬油》、GB/T 1535—2017《大豆油》和GB/T 15680—2009《棕櫚油》的規(guī)定，且所選用原料油脂的脂肪酸組成和生育酚組成及含量均符合其典型特征。因此，所選原料油脂用作分析油脂中TBHQ轉(zhuǎn)化情況具有一定代表性。

表1 豬油、大豆油和棕櫚油主要脂肪酸組成相對含量及其基本理化指標Table 1 Fatty acid composition and basic physicochemical indexes of lard,soybean oil,and palm oil

表2 豬油、大豆油和棕櫚油中生育酚和生育三烯酚組成及含量Table 2 Compositions and contents of tocopherol and tocotrienol in lard,soybean oil,and palm oil mg/kg

2.2 貯存過程中豬油、大豆油和棕櫚油中TBHQ以及TBBQ含量的變化

將添加200 mg/kg TBHQ的豬油、大豆油在室溫下貯存，添加200 mg/kg TBHQ的棕櫚油在60 ℃下保溫貯存6 個月，并使用氣相色譜法檢測貯存期間各油脂中TBHQ剩余量及TBBQ生成量，結(jié)果如圖1所示，隨著貯存時間的延長，豬油、大豆油和棕櫚油中TBHQ含量均呈下降趨勢（P＜0.05），TBBQ含量呈緩慢上升趨勢（P＜0.05）。大豆油、豬油和棕櫚油中TBHQ含量最初分別為（201.4±1.2）、（201.2±1.2）、（203.6±0.3）mg/kg，在貯存3 個月時TBHQ 和TBBQ 含量之和分別為（163.8±0.7）、（168.1±0.9）、（170.0±2.3）mg/kg，在貯存6 個月時TBHQ 和TBBQ 含量之和分別為（130.1±0.9）、（125.5±0.7）、（131.6±0.7）mg/kg。觀察發(fā)現(xiàn)，隨著時間的延長，TBHQ和TBBQ含量之和越來越小，這表明貯存條件下油脂中TBHQ的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物不僅有TBBQ，還有可能存在其他的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。

圖1 貯存90 d和180 d后大豆油、豬油和棕櫚油中TBHQ和TBBQ含量變化Fig.1 Changes in TBHQ and TBBQ contents in soybean oil,lard and palm oil after storage for 90 and 180 days

2.3 大豆油、豬油和棕櫚油中TBHQ轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離與鑒定

為加速TBHQ在油脂中轉(zhuǎn)化，更加直觀了解其在油脂中轉(zhuǎn)化規(guī)律，添加Fe3＋促進轉(zhuǎn)化進程。將貯存180 d不含TBHQ大豆油、添加有200 mg/kg TBHQ大豆油和添加有200 mg/kg TBHQ＋1 mg/kg Fe3＋大豆油分別經(jīng)色譜甲醇提取，經(jīng)冷凍離心去除多余脂質(zhì)后與TBHQ和TBBQ標準品進行氣相色譜分析，由圖2A可知，TBHQ和TBBQ標準品在氣相色譜中保留時間分別為12.26 min和8.08 min，含TBHQ大豆油的氣相色譜圖中除了出現(xiàn)TBHQ和TBBQ的峰外，還出現(xiàn)了另一未知化合物（保留時間12.16 min）（以下稱化合物1），在添加有1 mg/kg Fe3＋的樣品中化合物1含量明顯增加，因此，初步推斷有新的化合物產(chǎn)生，但是否為Xu Xiaolan等[15]鑒別出的MAHQ，需要進一步研究。圖2B、C表明，在貯存180 d不含TBHQ豬油和棕櫚油、添加有200 mg/kg TBHQ豬油和棕櫚油以及添加有200 mg/kg TBHQ＋1 mg/kg Fe3＋豬油和棕櫚油的甲醇提取液中發(fā)現(xiàn)與大豆油中保留時間相同的未知峰（將豬油、棕櫚油中未知色譜峰分別記為化合物2和化合物3）。通過Prep-LC技術(shù)分別分離純化出TBHQ、TBBQ和化合物1、2、3，純化后的化合物1、2、3的氣相色譜圖中保留時間與圖2中未知峰保留時間匹配。

圖2 貯存180 d油的甲醇提取液氣相色譜圖Fig.2 GC chromatograms of oils and fats stored for 180 days

利用UPLC-Q-TOF獲得經(jīng)Prep-LC純化后的TBHQ、TBBQ和化合物1、2、3的一級、二級質(zhì)譜圖。首先，將質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過Mass Hunter Workstation軟件進行初步處理，采用Qualitative Analysis軟件，由提取離子流圖和一級高分辨質(zhì)譜信息獲得各物質(zhì)的保留時間以及準分子質(zhì)量，結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)與本地譜庫進行匹配，結(jié)果如圖3所示。TBHQ、TBBQ和化合物1、2、3一級質(zhì)譜圖顯示基峰質(zhì)荷比m/z分別為165.0917、163.1134和163.0131、163.0136、163.0690 [M－H]－的準分子離子峰，從而得到它們的分子質(zhì)量分別為166、164、164、164、164。化合物1、2、3分子質(zhì)量相同且與MAHQ的分子質(zhì)量吻合，分析二級質(zhì)譜圖對比發(fā)現(xiàn)碎片離子與Xu Xiaolan等[15]研究結(jié)果一致。

圖3 TBHQ、TBBQ及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of TBHQ,TBBQ and conversion products

為了進一步驗證該化合物1、2、3是否均為MAHQ，將純化后的物質(zhì)溶解于氘代甲醇中進行NMR分析。圖4為TBHQ、TBBQ和未知化合物1、2、3的NMR譜圖。分析圖4C～E可知，三者NMR譜圖一致，對比TBHQ（圖4A1）及TBBQ（圖4B1）1H-NMR譜圖，TBHQ與化合物1均在δ6.5～7.0附近出現(xiàn)苯環(huán)上H的化學位移，而在烷基取代基部分H化學位移有所不同。TBHQ的叔丁基取代基上H的化學位移相同，因此H的化學位移均為δ1.35，且響應較高；同樣，TBBQ的叔丁基取代基上H的化學位移均為δ1.28，而MAHQ的烷基取代基為甲代烯丙基，其雙鍵上的H化學位移為δ3.24，甲基上H的化學位移為δ1.70。綜上分析可知，化合物1、2、3為同種物質(zhì)且NMR譜圖與Xu Xiaolan等[15]研究的MAHQ吻合，由此說明在含TBHQ大豆油、豬油和棕櫚油的甲醇提取液中確實存在MAHQ。

圖4 TBHQ、TBBQ及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的NMR譜圖Fig.4 NMR spectra of TBHQ,TBBQ and conversion products

2.4 TBHQ、TBBQ及MAHQ結(jié)構(gòu)表征分析

由圖5可知，TBHQ和MAHQ的分別在294 nm和297 nm出現(xiàn)中等強度吸收峰，250～300 nm是苯環(huán)B吸收帶的特征吸收，這是由n→π*和π→π*躍遷形成[26]，由此進一步表明兩者均具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)。而TBBQ較大吸收峰出現(xiàn)在248 nm，這是由于醌結(jié)構(gòu)中雙鍵的吸收峰。三者在200 nm附近均出現(xiàn)較強的紫外吸收峰，這是由烷基上電子σ→π*躍遷形成[27]。

圖5 TBHQ、TBBQ和MAHQ的紫外光譜圖Fig.5 UV spectra of TBHQ,TBBQ and MAHQ

由圖6可知，TBHQ和MAHQ分別在3254 cm－1和3264 cm－1出現(xiàn)較強吸收，這是由苯環(huán)上O—H伸縮振動產(chǎn)生[28-29]；在1442 cm－1和1473 cm－1出現(xiàn)較強吸收，這是由C—O原子之間的伸縮振動產(chǎn)生，兩者為酚的特征吸收峰。TBHQ、TBBQ和MAHQ分別于2963、2979、3038 cm－1處出現(xiàn)苯環(huán)上C—H伸縮振動，于1591、1648、1641 cm－1處出現(xiàn)苯環(huán)的環(huán)伸縮振動。900～1200 cm－1為三者苯環(huán)上取代基吸收峰[26,30]。綜上分析，TBHQ在油脂中的另一轉(zhuǎn)化產(chǎn)物MAHQ與TBHQ相比，苯環(huán)結(jié)構(gòu)依然存在，且仍存在兩個酚羥基，但在苯環(huán)上取代基的部分有所不同。

圖6 TBHQ、TBBQ和MAHQ的FTIR圖Fig.6 FTIR spectra of TBHQ,TBBQ and MAHQ

3 結(jié)論

添加TBHQ的豬油、大豆油和棕櫚油經(jīng)貯存一段時間后，TBHQ較原始添加量明顯下降，分析得出TBHQ在油脂貯存過程中的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物除了TBBQ，還存在MAHQ，且加速油脂氧化后兩種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量均明顯增加。TBBQ屬于醌類物質(zhì)，叔丁基取代基未發(fā)生變化；MAHQ和TBHQ都是含有兩個羥基的酚類物質(zhì)，而MAHQ苯環(huán)上的取代基是甲代烯丙基。由于油脂種類不同，相同時間下TBHQ的轉(zhuǎn)化程度不同，TBBQ與MAHQ生成量也不同。