高同型半胱氨酸經TRPC6/NF-κB誘導腎小球足細胞鐵死亡的機制

李小琴 汪樂新 馬小軍 李娜 盧冠軍， 張智涵 張鵬程

1寧夏醫科大學總醫院泌尿外科 （銀川 750004）；2寧夏醫科大學臨床醫學院 （銀川 750004）；3吳忠市人民醫院護理部 （寧夏吳忠 751100）；4浙江中醫藥大學附屬第三醫院 （杭州 310000）

慢性腎臟病（chronic kidney diseases，CKD）是一種以腎功能進行性損害為特征的疾病，已成為全球關注的主要健康問題［1］，其具有不可逆、進行性且早期癥狀不明顯等特點，是導致終末期腎?。╡nd-stage renal disease， ESRD）和腎功能衰竭的主要病因之一［2］。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是一種源自蛋氨酸代謝而來的含硫氨基酸，主要在腎臟代謝；Hcy 的積累即高同型半胱氨酸血癥（high homocysteine，HHcy），被認為是CKD 發生發展的罪魁禍首［3-4］。它主要通過觸發氧化應激、內質網應激和炎癥反應等方式促進CKD 的發生發展，隨時間推移可能導致ESRD［4-5］。課題組前期已證實HHcy 會造成腎損傷［6-7］。但目前為止還沒有降低Hcy 的有效策略。因此，明確Hcy 引起腎損傷的致病機制，對預防或治療與Hcy 相關的ESRD 至關重要。

足細胞是腎臟濾過屏障中獨特的終末分化上皮細胞，足細胞功能的喪失被認為是腎小球疾病早期發展的關鍵因素。近年來，廣受關注的瞬時受體電位-6 通道（TRPC6）是一種廣泛表達在足細胞的非選擇性高通透Ca2+通道［8］，越來越多的研究［9-11］證實TRPC6 與腎小球疾病的發病密切相關，TRPC6 是一種重要的足細胞膜蛋白且對維持足細胞的正常生理功能至關重要。據報道［12］稱，TRPC6過度激活可導致足細胞和系膜細胞損傷，而氧化應激是導致腎小球細胞中TRPC6 異常開放發生細胞損傷的主要原因；然而，TRPC6 是否參與了Hcy引起腎損傷的發病機制尚不清楚。

鐵死亡是一種與鐵離子相關的氧化死亡方法，主要以細胞內活性氧（ROS）堆積、過度的氧化反應和膜脂質過氧化反應為特征的非細胞凋亡形式的細胞死亡，它主要受Xc-系統（主要為SLC7A11）以及谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）的調節［13］，SLC7A11 和GPX4 活性降低導致細胞抗氧化能力下降和脂質ROS 積累，進而發生鐵死亡［14-15］。很多CKD 患者都存在不同程度的鐵代謝和脂質代謝紊亂?？紤]到Hcy 對腎臟的損害以及Hcy、TRPC6、鐵死亡之間的潛在聯系，我們推測TRPC6 和鐵死亡可能參與了Hcy 誘導的足細胞損傷。因此，本研究以TRPC6 的分子調控為切入點，從腎小球足細胞鐵死亡的視角闡明Hcy 致病機制，為進一步研究CKD 的發生與發展提供了必要的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器小鼠腎足細胞株（MPC-5）購自中國華拓生物；Hcy 細粉購買于美國Sigma；DMEM 培養基和胎牛血清均購買于美國Gibco 公司；TRPC6、GPX4、SLC7A11 購買于美國Abcam；NFκb 購自中國Affinity；兔二抗購買于中杉金橋；MDA 檢測試劑盒購買于南京建成；蛋白質提取試劑盒購自中國凱基生物；總RNA 提取試劑盒購買于北京TianGen；反轉錄試劑盒、熒光PCR 試劑盒均購自日本TaKaRa；TRPC6 上下游引物由上海生工合成；TRPC6 干擾片段購自上海吉瑪公司；Lipofectamine2000 助轉劑購于美國invirogen；凋亡檢測試劑盒購于美國BD；全自動酶標儀和凝膠化學發光成像分析儀來自美國Bio-Rad；普通 PCR 擴增儀和實時熒光定量PCR 儀購于德國Analytik Jena；電轉、電泳儀來自美國，BioRad；流式細胞儀來自美國，BD；激光共聚焦購自美國Zeiss；超凈工作臺為中國安泰公司；CO2培養箱、微型離心機和高速冷凍離心機購自美國Eppendorf；BS1105 型精密天平購于德國Sartorius 公司。

1.2 細胞干預及分組在 DMEM 培養基中加入10%胎牛血清，將其置于37 ℃、5% CO2濃度的培養箱中，連續2 d 進行傳代，計算對數增長并選擇第3 - 4 代進行試驗。參考相關文獻［7］，80 μmol/L 的Hcy 濃度為最佳干預濃度。因此，待細胞長到70%時，用80 μmol/L Hcy 干預作為Hcy 組，對照組不作任何處理，待干預達48 h 后采集細胞，進行下一步實驗。

1.3 細胞轉染與分組參考LipofectamineTM2000說明書轉染si-TRPC6 和si-NC 到腎足細胞。在轉染前1 d，向6 孔板中每個孔接種2 × 105個細胞，待培養至70%匯合時。 a 液：將250 μL DMEM 與5 μL si-TRPC6 均勻混合。b 液：250 μL DMEM 與6 μL LipofectamineTM2000 均勻混合，放置5 min 后，輕輕混合a、b 液，室溫20 min。慢慢地將a/b 混合液添加到培養液中，添加普通的新鮮培養基到3.5 mL，搖動均勻，在37 ℃的溫度箱中放置6 ～ 8 h，將轉染液吸走，換上普通的培養液，在48 h 后采集細胞，進行下一步實驗。

1.4 qRT-PCR 檢測TRPC6 基因參考總RNA 試劑盒說明書，逐步提取每一組細胞的總RNA，然后反轉錄成cDNA。借助NCBI 網站查出鼠源TRPC6和GAPDH 基因序列，引物交給上海生工生物有限公司設計和合成；TRPC6 上游引物：5′-CTGATCCTCAGATCATCTCT-3′；下游引物：5′-GAGTAAAGGTTGAACATTCC-3′；PCR 在以下條件下進行：在95 ℃下30 s，在95 ℃下5 s，在59.2 ℃下34 s，共計45 個循環，每個樣品重復3 次。以GAPDH 為內參，采用相對定量法（2-ΔΔCT法）計算TRPC6 的相對表達量。

1.5 Western blot 檢測TRPC6、GPX4、SLC7A11、NF-κB 蛋白表達吸棄培養瓶中細胞培養液，用PBS 漂洗細胞2 次，將細胞收集到離心管中，在預冷4 ℃離心機5 000 r/min，離心5 min，吸棄上層液；參考凱基試劑盒說明進行總蛋白質的提取，BCA 方法測定其含量，加入200 mL loading buffer，震蕩搖勻，95 ℃沸騰10 min；根據蛋白質分子的大小，用SDS-PAGE 在8%和12%的凝膠上離析，離析開的蛋白質按分子大小裁剪并轉移到PVD膜上，用5%的脫脂牛奶在25 ℃下封閉120 min，PBST 液漂洗3次，每次10 min；參考抗體說明書用通用抗體稀釋液按1∶1 000 配制TRPC6、GPX4、SLC7A11、NFκb 抗體稀釋液，將洗好的 PVD 膜放入一抗孵育盒內，4 ℃冰箱恒溫搖床過夜，次日將PVD 膜浸泡于PBST 內清洗3 次，10 min/次；后按1∶5 000 比例配制兔二抗稀釋液，25 ℃搖床孵120 min。后PBST 漂洗3 次，10 min/次。在避光情況下，使用ECL 發光A 液、B 液按1∶1 配制，將膜浸泡于發光液內10 s 后，通過凝膠成像系統可視化蛋白質條帶。使用Image Lab 對蛋白條帶進行半定量，以β-action 作為內參對照。

1.6 免疫熒光檢測TRPC6 蛋白表達將狀態良好的腎足細胞培養于20 mm 激光共聚焦培養皿內，Hcy 刺激48 h 后自培養箱內取出；吸去培養基，用4 ℃ PBS 清洗細胞，室溫搖床慢搖5 min，共3 次，棄PBS；用體積分數4%多聚甲醛固定兩組細胞0.5 h，PBS 搖床慢搖3 次，每次5 min，吸去PBS；每個培養皿加入100 μL 山羊血清，室溫封閉30 min；吸去山羊血清，加入相對的TRPC6 一抗抗體（1∶400），在4 ℃條件下避光孵育12 h 后取出，室溫條件下放置0.5 h，PBS 清洗3 次，每次5 min，在避光條件下，每個皿加入100 μL熒光二抗（1∶100），37 ℃孵育1 h后PBS清洗；避光條件下，加入100 μL DAPI 染核5 min 后PBS 漂洗；后每個皿滴入100 μL防熒光淬滅劑封固，把染色后的細胞放于暗盒內，在激光共聚焦顯微鏡下將細胞調至視野范圍內進行觀察照相。

1.7 細胞流式術檢測細胞凋亡水平胰酶消化采集足細胞，制備細胞懸液，用PBS 清洗2 次，每次5 min，12 000 r/min 離心5 min，用500 μL 1×Annexinv 結合細胞懸液，加入5 μL Annexinv-FITC和PI 染色并標記單染管，雙染管，空白管，在單染管只加PI，雙染管加Annexinv-FITC 和PI，空白對照管不加，放置20 min 后在流式細胞儀上測定細胞凋亡水平。設置雙參數散點圖（PI：縱坐標，Annexinv-FITC：橫坐標），劃分4 個部分，即左上方為機械性損傷細胞率，而右上方為凋亡較晚的細胞率；左下方為正?；铙w細胞率，右下方為凋亡較早的細胞，以右上方細胞比率+右下方細胞比率計算細胞凋亡率。

1.8 MDA 檢測采集各組細胞的上清液，標記，14 000 r/min 離心5 min，取上層液，嚴格參考MDA試劑盒說明書測定各組細胞中MDA 含量。

1.9 統計學方法使用prism 9.0 軟件進行數據的統計分析，計量數據顯示為均數±標準差，使用獨立樣本t檢驗分析兩組細胞間的差異，使用單因素方差分析（One-way analysis of variance，ANOVA）分析多組細胞間的差異。當P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高同型半胱氨酸誘導腎小球足細胞鐵死亡同Control 組比較，Hcy 組GPX4、SLC7A11 表達水平均降低（P＜ 0.05），同時Hcy 組凋亡率增加、MDA 表達水平增高，兩組比較均差異有統計學意義（P＜ 0.05）。綜合分析，Hcy 可引起氧化自由基的累積，是足細胞發生鐵死亡的重要依據之一（圖1 和表1）。

表1 兩組間MDA 水平的比較Tab.1 Comparison of MDA levels between the two groups

圖1 高同型半胱氨酸致足細胞鐵死亡Fig.1 High homocysteine induced iron death in podocytes

2.2 高同型半胱氨酸誘導了腎小球足細胞中TRPC6及NFκb的表達同Control組對比，足細胞中的TRPC6蛋白及mRNA表達量均升高（P＜ 0.05）；Western blot 結果表明，與對照組相比，NF-κb 信號通路蛋白表達增加（P＜ 0.05）。上述結果提示：Hcy 上調了TRPC6 及NF-κb 的表達（圖2）。

圖2 Hcy 上調TRPC6 及NF-κB 的表達Fig.2 Homocysteine increasing the expression of TRPC6 and NF-κB

2.3 轉染TRPC6 干擾片段后TRPC6 mRNA 表達情況為進一步研究TRPC6 在腎小球足細胞鐵死亡中的作用，將TRPC6 干擾片段及TRPC6 NC 轉染后分組為Control、si-NC及si-TRPC6（si-TRPC6-1、si-TRPC6-2、si-TRPC6-3）組，通過qRT-PCR 檢測TRPC6 mRNA 表達量，結果提示：與Control 組比較，si-NC 的TRPC6 mRNA 表達沒有差異；與si-NC組相對比，si-TRPC6（si-TRPC6-1、si-TRPC6-2、si-TRPC6-3）組中TRPC6 的mRNA 表達水平降低，其中si-TRPC6-3 干擾效果最強（P＜ 0.05），后續則選擇si-TRPC6-3 干擾片段用于實驗，這也提示干擾TRPC6 的模型構建成功（圖3）。

圖3 轉染干擾TRPC6 后TRPC6 mRNA 的表達Fig.3 Expression of TRPC6 mRNA after transfection interferes with TRPC6

2.4 轉染TRPC6 干擾片段后鐵死亡相關蛋白、TRPC6 及NF-κb 的表達情況為了揭示TRPC6/NF-κb 是否參與Hcy 誘導足細胞發生鐵死亡的過程，細胞轉染TRPC6 干擾片段及TRPC6 NC 后給予Hcy 干預，Western blot 分組為Control、Hcy、si-NC+Hcy、si-TRPC6+Hcy，采用Western blot 檢測鐵死亡相關蛋白、TRPC6及NF-κb的表達，結果提示：與Hcy組相比，si-NC+Hcy 組的GPX4、ALC7A11、TRPC6以及NF-κB 表達均無差異；與si-NC+Hcy 組相對比，si-TRPC6+Hcy 組中鐵死亡相關蛋白：GPX4、ALC7A11 表達增加（P＜ 0.05）；TRPC6 及NF-κb 蛋白表達減低（P＜ 0.05）；流式細胞術檢測轉染干擾TRPC6 后細胞凋亡水平，結果提示：與Hcy 組對比，si-NC+Hcy 組中凋亡率無明顯差異；與si-NC+Hcy 組相比，si-TRPC6+Hcy 組中凋亡水平有所下降（P＜ 0.05），提示TRPC6/NF-κb 參與了Hcy 誘導腎足細胞發生鐵死亡的過程（圖4）。

圖4 TRPC6/NF-κB 參與了Hcy 誘導的腎小球足細胞鐵死亡Fig.4 TRPC6/NF-κB is involved in Hcy induced renal podocyte iron death

3 討論

腎功能的損害已影響了全世界超過10%的人口，大多數腎臟疾病的特征是腎小球濾過屏障的破壞。而足細胞是構成腎臟濾過屏障的主要部分，其受損破壞了腎小球濾過屏障的完整性，進而引起蛋白尿和腎臟損害。HHcy 已被認為是ESRD進展和與ESRD 相關的心血管并發癥發展的獨立危險因素［3-4］。有研究［16］報道，在ESRD 患者中，發生HHcy 的概率高達85% ～ 100%。課題組前期已經證實HHcy 會造成腎小球足細胞損傷［6-7］，但Hcy在腎臟疾病中的復雜機制尚未被完全闡明。因此，本研究旨在探討Hcy 誘導腎小球足細胞的損傷機制并尋求新的治療靶點來緩解腎臟疾病的進展。

HHcy 最初被報道為動脈粥樣硬化的危險因素［17］。后來，大量的流行病學和臨床病例對照研究［18-19］發現血漿Hcy 水平與心血管疾病之間存在顯著的正相關關系。有學者回顧此類研究發現腎臟病患者血清肌酐和Hcy 濃度之間也存在明顯的正相關［20］。雖然很多證據提示HHcy 與CKD 致病機制密切相關，但是其在CKD 發生和發展中的作用總是缺少令人信服的證據。研究［21］顯示，HHcy可以直接作用于腎小球細胞，引起腎小球功能障礙，進而導致ESRD，并且氧化應激、內質網應激、炎癥等參與了Hcy 引起腎損害的過程，特別是氧化應激越來越受到關注。已有研究［22］提示Hcy 主要通過觸發局部組織或細胞中的氧化應激來參與足細胞的自噬與凋亡，但Hcy 誘導足細胞鐵死亡的方式至今未見相關報道。鐵死亡是一種鐵離子依賴性的氧化死亡方式，主要以細胞內ROS 堆積，過度的氧化反應和膜脂質過氧化反應為特征的非細胞凋亡形式的細胞死亡。目前研究表明，鐵死亡主要受Xc-系統以及谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）調節［23］。其發生的主要原因是谷胱甘肽（GSH）合成減少以及GPX4 活性被抑制。GSH 是GPX4 發揮活性的關鍵輔助因子，而半胱氨酸是GSH 合成的重要原料，主要來源于Hcy 代謝。如果GPX4 的表達下調，細胞對鐵死亡更敏感；而GPX4 的功能活性與Hcy 代謝密切相關。本實驗采用80 μmol/L Hcy 刺激腎小球足細胞48 h 后，檢測發現SLC7A11、GPX4 表達下調，這提示Hcy 可以引起足細胞發生鐵死亡。而MDA 是脂質的最終過氧化產物，它的表達量能夠反映機體內ROS的含量，是機體氧化應激損傷的一個重要指標。于是我們通過檢測兩組間MDA 水平發現Hcy 組MDA 水平較對照組明顯增加。這些實驗結果表明Hcy 可能通過觸發氧化應激引起ROS 累積，進而誘導足細胞發生鐵死亡。

TRPC6 是一種Ca2+滲透性陽離子通道，它是構成腎臟足細胞裂隙膜結構的重要蛋白之一，并且在維持腎小球基底膜正常濾過功能中發揮重要作用［8］。該通道已被證明是腎臟疾病期間足細胞消耗的主要參與者［24-26］。REISER 等［25］研究表明，TRPC6 在遺傳性腎小球硬化、微小病變及膜性腎臟疾病中的表達明顯升高。另有報道［26］稱TRPC6高表達導致大鼠足細胞損傷及蛋白尿增加。以上證據表明TRPC6 在足細胞損傷中起著關鍵作用。因此抑制TRPC6 的表達水平可能會成為未來有效保護足細胞的重要方法。然而，TRPC6 在Hcy 致足細胞鐵死亡中的作用及機制目前尚不清楚。據研究［27］發現，TRPC6 是一個氧化還原敏感通道，它是ROS 致腎臟損害的新靶點［28］，其作用機制與Ca2+內流引起腎功能損害密切相關。在動物模型和人類受試者中，ROS 的過量產生和TRPC6 通道的功能障礙都與腎損傷有關［28-30］。有文獻報道TRPC6 敲低后，ROS 和細胞內Ca2+水平均降低，且可減少腎性蛋白尿［29］；且越來越多的證據表明，TRPC6 在足細胞中的表達和功能受到ROS 的控制［29-30］。筆者推測TRPC6 可能參與了Hcy 誘導足細胞發生鐵死亡的過程，為驗證這一假說，本研究檢測了 TRPC6 在Control 組和Hcy 組的表達，發現與Control 組比較，Hcy 組TRPC6 蛋白及mRNA 呈現高表達，提示Hcy上調了TRPC6的表達。進而我們通過Xc-系統-GPX4軸探討TRPC6 在Hcy 誘導腎小球足細胞發生鐵死亡的作用機制，本實驗構建了3 個TRPC6 的干擾片段并轉染足細胞，我們選擇了干擾效率最好的si-TRPC6-3 進行下一步實驗；在Hcy 刺激的同時加入TRPC6 干擾片段，Western blot 結果顯示si-TRPC6+Hcy 組較si-NC+Hcy 組比較，鐵死亡相關蛋白SLC7A11 和GPX4 表達增加，凋亡率下降，而與Hcy 組比較，轉染陰性對照組對誘導的足細胞凋亡率及鐵死亡相關蛋白無明顯影響。以上研究提示，干預TRPC6 可減輕Hcy 引起的足細胞鐵死亡。此外，NFκB 是機體炎性反應的關鍵信號通路，有文獻［31］報道TRPC6可調節NF-κB 信號來增強星形膠質細胞的凋亡；另有學者［32］報道了NF-κB 可能參與了腎損傷。故我們檢測了Hcy 組NF-κB 蛋白的表達，結果提示，較對照組相比，Hcy 組NF-κB 蛋白表達增加；干擾TRPC6 后NF-κB 表達降低，表明在Hcy 誘導足細胞發生鐵死亡的過程中，TRPC6 可能具有調控NF-κB 的作用。MA 等人［28］通過系統性綜述TRPC6 在糖尿病腎病中足細胞損傷的作用時，也證實了這一結果；他發現線粒體ROS 能增加NFκB 的活化，NF-κB 可促進TRPC6 的表達，而TRPC6 升高則又加劇Ca2+超載，正反饋性加重腎小球足細胞的損傷。

綜上所述，本研究首次證實了Hcy 可能通過觸發氧化應激誘導腎小球足細胞發生鐵死亡，并證明了TRPC6/NF-κB 參與了Hcy 誘導腎小球足細胞鐵死亡這一過程。這些發現可能為臨床防治Hcy 導致的腎臟損傷提供新的藥物作用靶點和新的治療思路，并有助于我們進一步闡明CKD 的發病機制。另外，ROS 調控TRPC6 介導的Ca2+信號仍需進一步的研究來確定潛在的分子機制，希望ROS/TRPC6 通路將為CKD 的治療提供新的治療策略。

【Author contributions】LI Xiaoqin made experimental operation，data collation ， statistical analysis and paper writing. WANG Lexing made study guidance and paper revision. MA Xiaojun and LI Na made proofreading of data and articles. LU Guanjun， ZHANG Zhihan and ZHANG Pengcheng designed the project. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.