鱷梨蒂腐病毛色二孢屬真菌對6 種殺菌劑的敏感性

徐璐茜, 高銀潔, 葉倩倩, 賀 瑞, 王 萌, 楊 葉*,

(1.海南大學 南繁學院 (三亞南繁研究院)，海南 三亞 572025；2.海南大學 熱帶農林學院，海口 570228；3.海南大學 生命健康學院，海口 570228)

鱷梨Persea americanaMill.又名牛油果、油梨、酪梨，屬于樟科 (Lauraceae) 鱷梨屬 (Persea)果樹，是一種重要的熱帶和亞熱帶經濟水果，兼具果、糧、油性質。因其果實富含促進健康的營養物，兼具食用及保健等功能，深受全球消費者的喜愛[1-3]。截至2020 年全球鱷梨種植面積達到77.2 萬hm2，全球的市場規模達到了716 億元，預計2026 年將達到901 億元[4]。2020 年我國鱷梨栽培面積為2.3 萬 hm2，產量為12.9 萬噸，云南、廣西和海南是國內鱷梨的主要產地[5-6]。目前，國內鱷梨產業總體上還處于起步階段，國內市場主要依靠進口。海關數據顯示，2010—2018 年，中國鱷梨進口量從 1.93 噸飆升至4.39 萬噸，是所有進口水果中增長幅度最大的品種， 2017 年和 2018年我國鱷梨進口額均在 1 億美元以上[6]。

采后鱷梨果實的保鮮期短，且容易被病菌感染而導致腐爛，是目前制約鱷梨產業化的主要因素之一。據報道，由于管理措施不當，鱷梨果實中由真菌性病害導致的采前和采后損失可高達80%[7]。蒂腐病 (stem-end rot) 也稱焦腐或黑腐病，在世界上所有鱷梨種植區都有發現，也是危害鱷梨果實的重要采后病害之一[8]。可侵染鱷梨導致蒂腐病的病原體有多種，主要是葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae) 的毛色二孢屬 (Lasiodiplodiaspp.)，如L.theobromae和L.pseudotheobromae[9-11]；另外，葡萄座腔菌科的Diplodia mutila、Diaporthe rudis和Neofusicoccum luteumin等也能引起鱷梨蒂腐病的發生[11-13]。Lasiodiplodiaspp.病菌具有潛伏侵染的特性，在鱷梨發育過程中通過果柄基部自然孔洞或機械傷口入侵果實，潛伏至采摘后果實后熟過程中才發病；早期癥狀為果梗基部出現褐色不規則小斑點，隨著果實成熟病斑迅速擴展，后期果皮變色壞死、果肉軟化腐爛[8-9,14]。同時該病原菌還可引起多種熱帶和亞熱帶水果蒂腐病的發生，如：芒果、番荔枝、番石榴、山竹、百香果、菠蘿蜜和龍眼等[15-20]。

目前針對采后蒂腐病的防治措施包括：采前和采后的殺菌處理、物理處理、生物防治、農業技術和果實成熟抑制等[15]。蒂腐病菌在鱷梨各發育階段都可能存在[7]，因此，從鱷梨開花到果實收獲期間應用殺菌劑，均可大幅度降低果實上初始病原菌數量，從而有效控制鱷梨采后腐爛[15]。甲基苯并咪唑氨基甲酸酯抑制劑(MBCs)作用于β-微管蛋白合成，抑制細胞有絲分裂，具有廣譜內吸的特點，對多種真菌病害具有保護和治療活性，除了單劑，生產上常與其他殺菌劑混合或復配使用[21]。14α-脫甲基酶抑制劑類殺菌劑(DMIs)作用于14α-脫甲基酶，阻斷病原菌甾醇的生物合成，具有廣譜及持效期長等特點[22]。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑(QoIs)作用于線粒體呼吸鏈，通過阻斷細胞色素bc1 復合體的電子傳遞而抑制ATP 的合成，具有高效、內吸和廣譜的特點[23]。其中，MBCs 的多菌靈、苯菌靈和甲基硫菌靈，DMIs 的咪鮮胺、抑霉唑等殺菌劑，在國外很早就被用于控制鱷梨、芒果等熱帶水果的采后病害[24-27]；而QoIs 的嘧菌酯等對由Botryosphaeria引起鱷梨蒂腐也具有良好的防效[25-26]。上述3 大類型的內吸性殺菌劑在國內也已被廣泛應用于熱帶水果采前和采后病害的防治。針對鱷梨，有研究指出，咪鮮胺、甲基硫菌靈、苯醚甲環唑等殺菌劑對炭疽病具有良好的抑菌效果[28]；本課題組調查發現，鱷梨生產上有使用這些殺菌劑防治炭疽病等病害。值得注意的是，雖然鱷梨在采前沒有專門針對蒂腐病進行防治，但是生產上大量使用的各類殺菌劑也可能導致鱷梨蒂腐病原群體產生潛在的抗藥性風險。

雖然中國鱷梨生產規模化發展迅速，但尚無相關登記注冊藥劑，針對鱷梨蒂腐病的研究也幾乎為空白，缺乏系統的藥劑篩選及抗藥性監測資料。2021 年本課題組對海南省部分鱷梨果園的調查顯示，蒂腐病的發病率通常在30%左右，個別果園的鱷梨發病率高達60%以上。因此，針對鱷梨蒂腐病菌進行對殺菌劑的敏感性測定，建立敏感性基線，開展抗藥性監測和抗性風險評估，對殺菌劑的田間科學使用，以及鱷梨蒂腐病的有效防治均具有重要意義。本研究擬針對MBCs 殺菌劑多菌靈和甲基硫菌靈，DMIs 殺菌劑咪鮮胺和苯醚甲環唑以及QoIs 殺菌劑吡唑醚菌酯和嘧菌酯，進行鱷梨蒂腐病菌的室內敏感性測定，確定殺菌劑的抑菌活性，評估潛在的抗藥性風險，以期為指導鱷梨蒂腐病的科學防治提供理論依據，也為延緩田間殺菌劑抗性的產生提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試病原菌

供試的101 個鱷梨蒂腐病菌菌株分屬Lasiodiplodia的5 個種，由海南大學植物保護學院殺菌劑生物學實驗室分離鑒定并保存。供試菌株中，采自海南省白沙縣的有52 株、儋州市40 株，云南省孟連縣9 株；5 種蒂腐病菌分別為L.pseudotheobromae(58 株)，L.theobromae(27 株)，L.mahajangana(9 株)，L.euphorbiaceicola(2 株)，Lasiodiplodiaspp.(5 株)，其中，L.pseudotheobromae和L.theobromae為優勢種。

1.2 藥劑及配制

供試6 種殺菌劑原藥分別為MBCs 殺菌劑多菌靈 (純度97.2%) 和甲基硫菌靈 (97%)，DMIs 殺菌劑苯醚甲環唑 (96.1%) 和咪鮮胺 (97%)，QoIs 殺菌劑吡唑醚菌酯 (96%) 和嘧菌酯 (96.5%)，均為海南正業中農高科技有限公司提供。99%水楊羥肟酸(SHAM)，上海麥克林生化科技有限公司。首先將多菌靈、甲基硫菌靈、苯醚甲環唑和咪鮮胺分別溶解并配制成1 × 103μg/mL 的母液，吡唑醚菌酯、嘧菌酯和水楊羥肟酸(SHAM)分別配制成5 × 105μg/mL 的母液備用，溶劑見表1。

表1 本研究中所使用殺菌劑的最終濃度Table 1 The fungicide final concentrations used in the study

1.3 試驗方法

1.3.1 敏感性測定 采用菌絲生長速率法測定101 株鱷梨蒂腐病菌對6 種殺菌劑的敏感性。在PDA 培養基中分別加入不同量的殺菌劑母液，配制得到不同濃度的含藥培養基平板，最終試驗濃度詳見表1。此外，吡唑醚菌酯和嘧菌酯處理組中分別加入水楊羥肟酸母液使其終濃度為100 μg/mL，其作用是降低旁路呼吸途徑對QoIs 殺菌劑的影響。對照培養基中僅含有等量的溶劑。每處理3 個重復，試驗重復2 次。然后將培養3 d 后的菌絲塊 (直徑5 mm) 轉移到含藥PDA 平板上，于恒溫培養箱28 ℃培養36 h 后，測量菌落直徑并計算抑制率(I，%)。

式中：Dc和Dt分別為對照組和處理組菌落直徑，cm。

1.3.2CYP51和Cytb基因克隆及序列分析

1.3.2.1 基因組DNA 提取 選取1.3.1 節中測得的對苯醚甲環唑和咪鮮胺抗性和敏感的菌株、對吡唑醚菌酯表現高水平抗性和敏感的菌株進行試驗。各供試菌株于空白PDA 培養基上28 ℃培養3 d 后，從菌落邊緣打取菌餅轉接至鋪有75 mm無菌玻璃紙的空白PDA 平板中央，28 ℃培養36 h后，用無菌載玻片刮取菌絲，加入液氮充分研磨，根據DNA 提取試劑盒說明書提取基因組DNA。

1.3.2.2 靶標基因克隆及測序 設計引物LtCYP51-F：5′-CCCTCCGTCTCCCTACACCT-3′，LtCYP51-R：5′-TTCTCCCTCCTCTCCCAAA-3′，用于擴增CYP51基因片段。PCR 擴增體系：總體系為40 μL，其中2 × Phanta Max Master Mix 20 μL，模板 DNA 0.8 μL，引物各1.6 μL，ddH2O 16 μL。PCR 擴增程序：95°C 預變性 3 min，35 個循環 (95°C 預變性30 s，58°C 退火 50 s，72°C 聚合 90 s)，最后72°C 延伸5 min。設計引物Cytb1-F：

5′-TTATGGGTCATACAGAGC3- ′，Cytb1-R：5′-TA CAATAGCAGGCGGAGT -3′，用于擴增Cyt b基因片段，該片段含甲氧基丙烯酸酯類抗性潛在基因突變位點 (F129L、G137R、G143A)。PCR 擴增體系：總體系為40 μL，其中2 × Phanta Max Master Mix 20 μL，模板 DNA 0.8 μL，引物各1.6 μL，ddH2O 16 μL。PCR 擴增程序：95°C 預變性3 min，35 個循環 (95°C 預變性30 s，55°C 退火50 s，72°C 聚合 90 s)，最后72°C 延伸 5 min。上述所有PCR 產物運用凝膠電泳檢測，通過DNA 回收試劑盒純化，將純化后的DNA 送天一輝遠生物科技有限公司（廣州）測序，測序結果分別采用BLAST 和DNAMAN 進行比對分析。

1.3.3CYP51和Cyt b基因表達量測定 使用Primer 6.0 軟件設計實時熒光定量 (qRT-PCR) 引物，以actin基因作為內參基因，測定CYP51和Cyt b基因的表達量，設計引物見表2。針對1.3.2.1節所選菌株，先將PDA 培養基上培養3 d 的菌株于菌落邊緣取菌餅轉移至PDB 培養液中，28 ℃、145 r/min 下培養24 h，然后分別采用終濃度為10 μg/mL 的苯醚甲環唑、咪鮮胺以及100 μg/mL 的吡唑醚菌酯含藥培養液繼續培養12 h，以加入等量溶劑的PDB 為對照。參照RNA 提取試劑盒說明書提取上述各處理菌株的RNA，使用Vazyme HiScriptRIII RT SuperMix for qPCR (+ g DNA wiper) 試劑盒對RNA Sample 進行逆轉錄。反應程序： 4 × g DNA wiper Mix 4 μL，RNA 樣品500 ng，加入RNase-free ddH2O 至16 μL，42 ℃條件下孵育5 min；加入5 × HiScript qRT Super Mix 4 μL，37 ℃條件下孵育15 min，85 ℃條件下孵育5 s。cDNA 產物置于 -20 ℃環境中保存。qRT-PCR 反應體系：2 × ChamQ SYBR qPCR 10 μL，ddH2O 8.2 μL，引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，總體系20 μL。qRT-PCR 擴增程序：95 ℃，30 s 預變性；95 ℃，5 s，42 個循環，變性；60 ℃，30 s，42 個循環，退火/延伸。相對基因表達量參照 2-ΔΔCT方法計算[29]。每次試驗含3 個生物學重復與3 個技術重復。

表2 qRT-PCR 分析特異性引物Table 2 Specific primers for qRT-PCR analysis

1.4 數據處理

將供試藥劑濃度轉換為濃度對數，抑制率轉換為幾率值，使用probit 分析求回歸方程y= a +bx并計算EC50值。所有數據均采用Levene 檢驗進行方差分析。敏感性分布采用Shapiro-Wilk 檢驗正態性，當P＞ 0.05 時為正態分布；采用基于log10轉換的EC50值構建直方圖，通過箱形圖識別異常值，繪制鱷梨蒂腐病菌對6 種殺菌劑的敏感性分布圖，并進行正態分析[29-30]。以EC50值大于敏感性基線的5 倍為抗性菌株。統計分析均采用SPSS 軟件 (V 21.0)和Tukey 檢驗進行。

2 結果與分析

2.1 MBCs 殺菌劑多菌靈和甲基硫菌靈的毒力及敏感性基線

多菌靈和甲基硫菌靈對供試101 個鱷梨蒂腐病菌菌株的EC50值范圍分別為0.01～0.19 μg/mL和0.02～2.19 μg/mL，2 種藥劑對蒂腐病菌均表現出很好的抑制活性。不同種類鱷梨蒂腐病菌對多菌靈的敏感性差異較小，平均EC50值在0.06～0.09 μg/mL 之間，對甲基硫菌靈的敏感性則存在較大差異，平均EC50值為0.50～1.03 μg/mL (表3)。

表3 不同種類鱷梨毛色二孢屬菌株對多菌靈和甲基硫菌靈的敏感性Table 3 Sensitivity of different species of Lasiodiplodia spp.on avocado to carbendazim and thiophanate-methyl

58 個L.pseudotheobromae菌株對多菌靈和甲基硫菌靈的敏感性均呈單峰曲線；依據箱形圖，多菌靈和甲基硫菌靈各刪除一個異常值后，所得敏感性頻率分布曲線經Shapiro-Wilk 檢驗均呈正態分布(W= 0.970,df= 57，P= 0.171 和W= 0.986,df= 58，P= 0.761) (圖1A 和1B)，剔除異常值后平均EC50值分別為(0.06 ± 0.03)和(0.69 ± 0.47)μg/mL，該平均EC50值可分別作為鱷梨蒂腐病菌對多菌靈和甲基硫菌靈的敏感性基線。參照所得敏感性基線，本研究中暫未發現對多菌靈和甲基硫菌靈已產生抗性的菌株。

圖1 鱷梨蒂腐病菌對6 種殺菌劑的敏感性頻率分布Fig.1 Frequency distribution of the sensitivity of Lasiodiplodia spp.to 6 fungicides

2.2 DMIs 殺菌劑苯醚甲環唑和咪鮮胺的毒力及敏感性基線

苯醚甲環唑和咪鮮胺對供試101 株鱷梨蒂腐病菌的EC50值范圍分別為0.04～9.64 μg/mL 和0.002～6.44 μg/mL。其中，苯醚甲環唑和咪鮮胺EC50值小于5 μg/mL 的菌株分別占92%和96%，表明2 種藥劑對大部分鱷梨蒂腐病菌均表現出很好的抑制活性。苯醚甲環唑和咪鮮胺對不同種類鱷梨蒂腐病菌的EC50值范圍分別為1.01～1.78 和0.80～1.34 μg/mL，其中L.pseudotheobromae和L.theobromae由于菌株數量較多，EC50值的范圍也較大 (表4)。

表4 不同種類鱷梨毛色二孢屬菌株對苯醚甲環唑和咪鮮胺的敏感性Table 4 Sensitivity of different species of Lasiodiplodia spp.on avocado to difenoconazole and prochloraz

58 個L.pseudotheobromae菌株對苯醚甲環唑和咪鮮胺的敏感性均呈單峰曲線；敏感性頻率經Shapiro-Wilk 檢驗均呈正態分布(W= 0.976，df=58，P= 0.302 和W= 0.980，df= 58，P= 0.462)(圖1C 和1D)，未出現異常值，苯醚甲環唑和咪鮮胺的平均EC50值分別為 (1.31 ± 1.62) 和 (0.81 ±0.71) μg/mL，可將該平均EC50值分別作為鱷梨蒂腐病菌對苯醚甲環唑和咪鮮胺的敏感性基線。參照該敏感性基線，發現對苯醚甲環唑表現敏感性降低的鱷梨蒂腐病菌有8 株，對咪鮮胺表現敏感性降低的菌株有7 株。

2.3 QoIs 殺菌劑吡唑醚菌酯和嘧菌酯的毒力及敏感性分析

101 株鱷梨蒂腐病菌中，有1 個菌株在吡唑醚菌酯和嘧菌酯質量濃度高達1000 μg/mL 時抑制率均低于10%，無法準確計算其EC50值，因此統計時刪除了該菌株。吡唑醚菌酯和嘧菌酯對其余100 株病原菌的EC50值范圍分別在0.14～1292.96 μg/mL 和14.55～4789.25 μg/mL 之間，平均EC50值分別為371.03 和622.86 μg/mL。其中優勢種L.pseudotheobromae和L.theobromae的菌株數量多，EC50值范圍較大。吡唑醚菌酯和嘧菌酯EC50值大于10 μg/mL 的菌株分別占供試菌株的91%和100%，表明供試絕大部分菌株對這2 種殺菌劑的敏感性均極低。不同種類鱷梨蒂腐病菌對吡唑醚菌酯和嘧菌酯的EC50平均值差異較大，但是5 種病原菌群體均對2 種藥劑表現出極低的敏感性 (表5)。

表5 不同種類鱷梨毛色二孢屬菌株對吡唑醚菌酯和嘧菌酯的敏感性Table 5 Sensitivity of different species of Lasiodiplodia spp.on avocado to pyraclostrobin and azoxystrobin

吡唑醚菌酯和嘧菌酯對57 個L.pseudotheobromae菌株的EC50平均值分別高達375.07 和721.32 μg/mL (表5)，經Shapiro-Wilk 檢驗其敏感性頻率均為非正態分布 (W= 0.881,df= 57,P=0.00 和W= 0.954,df= 57,P= 0.03) (圖1E 和1F)。

2.4 殺菌劑靶標基因序列分析

2.4.1CYP51基因序列及比對 使用特異性引物LtCYP51-F 與LtCYP51-R 擴增鱷梨蒂腐病菌對苯醚甲環唑和咪鮮胺不同抗性及敏感菌株CYP51基因的編碼區，擴增出一段長約1700 bp 的序列，包含3 個內含子，該序列共編碼了510 個氨基酸。將堿基序列在GenBank中進行BLAST 搜索，結果顯示與L.theobromae(Genebank No.MK107983.1)的CYP51同源性為99%～100%。對不同菌株的氨基酸序列比對結果表明，除苯醚甲環唑的1 個敏感菌株在第207 位與其他菌株相比存在差異外，其余菌株的序列完全一致；這些表現低水平抗性的菌株，其CYP51基因與敏感菌株及標準菌株相比并沒有發現點突變 (圖2)。

圖2 苯醚甲環唑和咪鮮胺不同抗性及敏感菌株CYP51 基因氨基酸序列比對Fig.2 Sequence alignment of CYP51 gene in different resistance and susceptible isolates of difenoconazole and prochloraz

2.4.2Cyt b基因序列及比對 使用特異性引物Cytb1-F/Cytb1-R 擴增得到長度為466～481 bp 的Cyt b基因部分序列，無內含子，可編碼155～160 個氨基酸。將供試菌株的Cyt b基因序列在GenBank 中進行BLAST 搜索，結果顯示與L.theobromae菌株MCC2345 (Genebank No.MH880818.1) 同源性為99%～100%。將供試菌株的序列與MCC2345 菌株進行比對發現，這些表現高水平抗性的菌株，其Cyt b基因序列與敏感菌株相比也并未發現任何點突變 (圖3)。

圖3 吡唑醚菌酯和嘧菌酯不同抗性及敏感菌株Cyt b 基因序列比對Fig.3 Sequence alignment of Cyt b gene in the resistant and sensitive isolates of pyraclostrobin and azoxystrobin

2.5 殺菌劑靶標基因表達量分析

2.5.1CYP51基因表達量 在10 μg/mL 苯醚甲環唑處理下，所有菌株CYP51基因相對表達量均明顯上調；其中，抗性菌株該基因的平均相對表達量為7.83，是敏感菌株的2.3 倍，即抗性菌株的相對表達量顯著高于敏感菌株 (圖4A) (P＜ 0.05)。在10 μg/mL 咪鮮胺脅迫下，所有菌株CYP51基因的相對表達量均大幅上調；其中，抗性菌株的平均相對表達量為26.07，是敏感菌株的8.2 倍，抗性菌株的相對表達量更遠遠高于敏感菌株 (圖4B)(P＜ 0.05)。

圖4 苯醚甲環唑 (A) 及咪鮮胺 (B) 處理后抗性(R)與敏感(S)菌株CYP51 基因的相對表達量Fig.4 Relative expression of CYP51 gene in the sensitive (S) or resistant (R) isolates after treatment with difenoconazole (A) and prochloraz (B)

2.5.2Cyt b基因表達量 經100 μg/mL 吡唑醚菌酯處理后，抗性菌株Cyt b基因平均相對表達量是對照的5.30 倍，而敏感菌株平均相對表達量是對照的5.55 倍。 即在100 μg/mL 吡唑醚菌酯脅迫下，雖然所有菌株Cyt b基因相對表達量均明顯升高，但抗性菌株與敏感菌株表現一致，二者之間沒有明顯的差異 (圖5) (P＜ 0.05)。

圖5 吡唑醚菌酯處理后抗性菌株 (R) 與敏感菌株 (S)Cyt b 基因的相對表達量Fig.5 Relative expression of Cyt b gene in the sensitive(S) or resistant (R) isolates after treatment with pyraclostrobin

3 結論與討論

本研究供試的 101 個菌株除了 5 個未鑒定到種外，其他96 個菌株分別被劃歸為 4 個種，包括L.pseudotheobromae、L.theobromae、L.mahajangana和L.euphorbiaceicola。針對6 種殺菌劑，采用菌絲生長速率法對上述101 個鱷梨蒂腐病菌菌株進行了敏感性測定，結果表明：不同藥劑處理對菌絲的抑制活性存在明顯差異，不同種鱷梨蒂腐病菌及同種不同菌株之間也均存在一定差異。所有供試鱷梨毛色二孢屬菌株對MBCs 殺菌劑多菌靈和甲基硫菌靈均表現為高度敏感，沒有出現敏感性下降的抗藥性亞群體，且敏感性呈正態分布，可根據多菌靈和甲基硫菌靈的平均EC50值建立其敏感性基線，作為監測田間鱷梨毛色二孢屬蒂腐病菌，尤其優勢種L.pseudotheobromae對多菌靈和甲基硫菌靈敏感性變化的參考標準。本研究中的絕大多數鱷梨蒂腐病菌菌株對DMIs殺菌劑苯醚甲環唑和咪鮮胺也呈現出較高的敏感性，敏感性頻率分布均呈單峰曲線和正態分布，同樣根據其平均EC50值建立敏感性基線，作為田間抗藥性監測的參考標準。

據報道，MBCs 和DMIs 殺菌劑對采后病害往往具有高效，多菌靈、甲基硫菌靈、咪鮮胺和苯醚甲環唑在田間的應用可大幅度降低柑橘、芒果蒂腐病發生率[15,31]。咪鮮胺還是一種世界公認的采后防腐殺菌劑，采前和采后應用均可控制鱷梨和芒果等果實的采后腐爛[27]。本研究表明，上述4 種殺菌劑對Lasiodiplodiaspp.鱷梨蒂腐病菌均有明顯抑制活性，其中多菌靈效果最好。相比較而言，DMIs 殺菌劑對鱷梨蒂腐病菌的抑制效果低于MBCs 殺菌劑，該結果與前人的研究結果類似[27]。病原菌抗藥性的產生除了與殺菌劑本身化學結構及作用機理有關外，還與殺菌劑施加選擇壓力的頻率和持續時間有關。雖然MBCs 殺菌劑普遍具有高抗性風險，但菌株敏感性分布因殺菌劑使用歷史和使用水平的不同而存在差異。有研究表明，巴西木瓜、海南芒果蒂腐病菌L.theobromae對該類殺菌劑產生了抗性，對一些抗藥性菌株的EC50值甚至超過了1000 μg/mL[32-34]。本研究中也有少數供試菌株出現了對苯醚甲環唑或咪鮮胺敏感性下降的現象。因此，在鱷梨蒂腐病菌尚未產生抗藥性之前，雖然上述殺菌劑、尤其是MBCs殺菌劑是控制鱷梨蒂腐病的優先選擇，但在應用中還須密切監測其抗性變化情況，以防止田間抗性種群的形成并導致藥劑防治失效。

據文獻報道，QoIs 殺菌劑吡唑醚菌酯和嘧菌酯能夠顯著抑制病原菌菌絲生長，明顯降低由可可毛色二孢L.theobromae引起的蒂腐病或枝枯病的發生[35-36]。然而本研究發現，供試菌株對這2 種殺菌劑的敏感性均極低，且敏感性呈非正態分布。由于不同菌株EC50值差異極大，本研究試驗不斷調整供試藥劑濃度進行了多次測定及重復試驗，結果是一致的。另外，由于L.mahajangana和L.euphorbiaceicola菌株數量太少，主要針對L.pseudotheobromae和L.theobromae進行不同種類病原菌之間比較時發現，二者的EC50值分布相似，平均EC50值也接近，從而排除了病原菌種類的影響。100 個菌株中，吡唑醚菌酯和嘧菌酯EC50值大于10 μg/mL 的分別有92 株(91%) 和100 株(100%)，平均EC50值分別高達371.03 μg/mL和622.86 μg/mL，初步認為鱷梨蒂腐病菌群體呈現嚴重的抗藥性分化。QoIs 也是高抗性風險殺菌劑，本研究表明此類藥劑不宜用于鱷梨蒂腐病的防治。在木瓜和芒果上也有過類似的報道，發現蒂腐病菌L.theobromae對該類殺菌劑產生了嚴重抗性[32,37]。鑒于該類殺菌劑在國內鱷梨生產上的應用水平較低，使用年限也不長，出現如此嚴重抗性的原因還有待進一步研究。總的來說，鱷梨蒂腐病菌對殺菌劑的潛在抗性風險不容忽視，生產上在應用殺菌劑時必須嚴格控制劑量和用藥頻次，盡量降低藥劑的選擇壓以防止和延緩田間群體抗藥性的產生及發展。

大量研究已證實，病原菌對殺菌劑抗藥性的產生常常與靶標基因的突變有關。例如：DMIs 殺菌劑的靶標基因CYP51和QoIs 殺菌劑靶標基因Cyt b的點突變，將導致藥劑與病原菌親和力降低，從而產生抗藥性[38-41]。本研究發現存在對DMIs 藥劑敏感性下降的菌株 (低抗菌株)，以及對QoIs 藥劑敏感性極低的菌株 (高抗菌株)，因而針對上述菌株進一步進行了靶標基因的克隆、測序及比較。結果表明，無論是對咪鮮胺表現低水平抗性菌株 (EC50＞ 5 μg/mL) 的CYP51基因，還是對吡唑醚菌酯表現高水平抗性菌株 (EC50＞ 500 μg/mL) 的Cyt b基因，其基因序列均沒有發現任何點突變。研究顯示，病原菌抗藥性的產生也有可能與靶標基因的過表達相關。如：對DMIs 抑制劑的抗性主要與CYP51基因的點突變或過量表達相關[38]，對QoIs 抑制劑的抗性則在很大程度上取決于靶標基因Cyt b點突變或基因表達水平變化[42]。本研究針對靶標基因CYP51和Cyt b基因的測定結果表明：在苯醚甲環唑和咪鮮胺脅迫下，其抗性菌株靶標基因CYP51表達水平顯著高于敏感菌株；但是在吡唑醚菌酯脅迫下，抗性菌株靶標基因Cyt b表達水平與敏感菌株之間沒有差異。有研究指出，在很少或從未使用過該類殺菌劑的歷史背景下，大量馬鈴薯早疫病菌Alternaria solani菌株對QoIs 殺菌劑即表現為不敏感，其原因并非由于產生抗藥性所致[43]。因此，本研究中鱷梨蒂腐病菌對供試2 個QoIs 殺菌劑表現出如此低的敏感性，其原因是自身的耐藥性還是由于產生了非靶標抗性，是一個值得關注的問題，還需進一步研究探明。

據我們所知，本研究是國內首次針對鱷梨蒂腐病菌進行的殺菌劑敏感性測定和抗藥性報道，研究結果將有助于國內鱷梨蒂腐病科學防控策略的制定，并對我國鱷梨產業的健康持續發展具有重要意義。總的來說，鱷梨商業化種植在國內的發展歷史較短，病蟲害防治等生產管理技術相對落后，嚴重影響了其規模化種植及品質的提高。鑒于目前國內對鱷梨病蟲害防治的深入研究較少，缺乏科學的綜合防治措施，因此在本研究結果基礎上，后續應擴大調查范圍，采集更多的菌株就鱷梨蒂腐及其他病害展開研究，建立抗藥性的長期監測體系勢在必行。