施用多抗霉素后煙葉葉際微生態變化規律

馮瑞超, 汪漢成, 邱雪柏, 蔡劉體, 陸 寧, 許靈杰, 章松柏

(1.貴州省煙草科學研究院，貴陽 550081；2.長江大學 農學院，湖北 荊州 434025；3.中國煙草總公司貴州省公司，貴陽 550000)

煙草是我國重要的經濟作物，在生長發育過程中容易受到多種病原菌的侵染，其中煙草赤星病 (tobacco brown spot) 是由鏈格孢菌Alternaria alternata引起的煙草葉部真菌病害。它具有潛育期短、間歇性爆發流行的特點[1]，在溫濕度適宜的條件下，短時間內可大面積流行，危害嚴重時可導致減產達50%以上[2]。目前，煙草赤星病的防治主要以化學防治為主，但由于化學農藥長期不合理使用會導致產生抗藥性菌株[3]、農藥殘留及污染環境[4]，已有針對亞胺類殺菌劑[5]、三唑類殺菌劑[6]、苯并咪唑類殺菌劑和二甲酰亞胺類殺菌劑[7]抗性菌株的報道。相較而言，生物農藥具有易降解、環境友好等優點而受到研究者的關注。

農用抗生素是微生物發酵產生的次級代謝產物，能有效抑制或殺滅農作物病原菌并調節作物生長發育[8]，已有諸多應用抗生素防治煙草赤星病的相關報道[9-12]。目前，關于農用抗生素對煙草的研究大多局限于田間防控，而殺菌劑在對靶向病原菌起作用的同時，往往可能會導致生物體脫靶效應，從而導致微生物環境的生態失衡[13]。

葉際是一個大型的微生物棲息地，提供許多不同的微生境[14]。葉際微生態是葉際微生物與其宿主長期進化過程中形成的相對穩定的生態系統[15]。葉際生態系統中的微生物群落組成是高度多樣的，包括各種真菌、細菌、藻類、病毒、原生生物和線蟲等，分為有益菌和致病菌[16-17]。煙葉上存在多種植物病原菌，包括鏈格孢菌[18]、立枯絲核菌Rhizoctonia solani[19]、曲霉菌Aspergillus[20]等；同時也存在多種益生菌，包括泛菌Pantoea[21]、假單胞菌P s e u d o m o n a s[22]、鞘氨醇單胞菌Sphingomonas[23]等。葉際微生物群落的變化往往是整個生態系統健康和生存能力變化的前提，當葉際微生態失衡后，往往會引起嚴重的后果，如冰核活性細菌可以加重農作物凍害[24]。研究不同持效期內農用抗生素的微生物群落結構和代謝功能的變化規律可以從微觀預測植物的健康變化趨勢。

多抗霉素是由金色鏈霉菌分泌的一類肽嘧啶核苷酸抗生素，主要作用于抑制病原菌細胞壁幾丁質合成，抑制病原菌芽管和菌絲體局部擴展，從而導致病原菌死亡[25]。該藥劑被廣泛用于防控各種作物病害，包括水稻稻瘟病、果實灰霉病、梨黑斑病等[26]。迄今，已有多抗霉素田間防控煙草赤星病應用的報道[12]，然而，其施用后不同時期煙葉葉際微生物群落結構和代謝功能的變化規律尚不清楚。為此，本研究采用高通量測序技術和Biolog-ECO 技術，分析多抗霉素施藥前后健康與感病煙葉葉際微生物群落結構及代謝功能，旨在從微觀層面揭示施用多抗霉素防控煙草赤星病的微生態機制。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試煙草品種‘云煙105’，由云南煙草農業科學研究院提供；1 0% 多抗霉素可濕性粉劑(polyoxin 10% WP)，購自青島瀚生公司；DNA 提取試劑盒 (Fast DNA? Spin Kit for Soil)，購自MP Biomedicals 生物醫學公司；Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建庫試劑盒 (貨號：4471252)和GeneJET 膠回收試劑盒 (貨號：K0691)，均購自Thermo Fisher Scientific 公司 (美國)；Biolog ECO 代謝板 (貨號：#1056) 購自美國Biolog 公司(USA，CA，Hayward)；多功能噴霧施肥器 (型號：DSF01A-20-100)，購自貴州黔豐源農業科技開發有限公司。自動氣象站 (由雨量計 (MC-YL)、溫度計 (MC-KWS) 和濕度計 (MC-KWS) 等組成)，購自北京新紅科技有限公司。

1.2 試驗設計

田間試驗在貴州省畢節市威寧縣黑石頭鎮感染赤星病的煙田進行，其中病葉率為20%～30%。選取長勢相似的煙田劃分小區，各小區遵循隨機排列原則，每小區選擇60 株煙株，設多抗霉素和清水對照2 個處理，進行3 次重復。10%多抗霉素WP 田間推薦劑量為有效成分0.15 kg/hm2，用水量為900 L/hm2，使用背負式噴霧器對煙株正、反葉面進行均勻噴施，直至液滴流失，對照組噴施清水。

使用自動氣象站檢測并記錄試驗過程中的溫度、濕度和降雨量，并分別于施藥前0 d、施藥后5、10 和15 d，各小區隨機選取20 株煙株調查煙葉發病情況，計算各時期的病情指數。病級分級標準參照GB/T23222 的規定：0 級，全葉無病斑；1 級：病斑面積占葉片面積的1% 以下；3 級，病斑面積占葉片面積的2%～5%；5 級，病斑面積占葉片面積的6%～10%；7 級，病斑面積占葉片面積的11%～20%；9 級，病斑面積占葉片面積的21%以上[27]。按公式 (1) 計算病情指數 (I)。

式中，Ni為i級病葉數；Vi為i病級值；N為調查總葉數。

1.3 樣品采集

于施藥前0 d 及施藥后5、10、15 d 分別取樣，采用消毒剪刀分別剪取煙株中下部相同部位的感病與健康煙葉組織樣品，分別裝入50 mL 無菌離心管中，每個處理3 次重復。樣品編號如表1所示。

表1 樣品采集信息Table 1 Sample information

1.4 煙葉葉際真菌和細菌群落結構與多樣性的變化規律

參照DNA 提取試劑盒說明書對不同時期所取煙葉樣品中微生物基因組DNA 進行提取，先用瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度和濃度，再將提取的DNA 用無菌水稀釋至濃度為1 ng/μL。以此為模板，使用真菌引物ITS1-1F-R (5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’) 和ITS1-5F-F (5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) 及細菌引物806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’) 和515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)，分別對真菌ITS1 區域[28]與細菌V4 區域[29]進行擴增。擴增產物回收后，使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建庫試劑盒進行文庫的構建，采用Illumina MiSeq 測序平臺對PCR 擴增產物進行雙端測序分析。以上分析均在北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.5 煙葉葉際微生物代謝功能的變化規律

分別取施藥前后感病與健康混合煙樣各2 g，將其分別置于盛有50 mL0.8% 無菌生理鹽水的100 mL 三角瓶中，在28 ℃、180 r/min 條件下振蕩搖培2 h，靜置30 min；取100 μL 上清液，依次分別加入到ECO 代謝板的測試孔中[30]，密封后置于OmniLog 恒溫培養箱，于28 ℃條件下培養7 d，采用Biolog D5E_OKA_data.exe 軟件收集葉際微生物生長過程中代謝孔的顏色變化值，用HemI 軟件制作熱圖并分析樣品葉際微生物的代謝功能[31]。

1.6 數據處理及統計分析

使用SPSS 進行數據處理[32]，對真菌和細菌的alpha 多樣性指數進行差異顯著性分析。利用QIIME 軟件 (1.9.1 版) 對不同時間序列樣本的微生物群落多樣性 (香農和辛普森指數)、豐富度(Chao1 指數)、商品覆蓋率指數和beta 多樣性進行計算。用R 語言工具統計并繪制真菌、細菌花瓣圖、物種積累箱形圖、門屬水平相對豐度圖，分析樣品微生物群落結構與多樣性。真菌使用Unit(8.2) 進行注釋[33]，細菌使用SILVA132 的SSUrRNA 數據庫進行注釋[34]，使用Qiime 軟件計算alpha 多樣性指數，使用corr.test 函數計算環境因子與微生物alpha 多樣性及物種間的相互變化關系數值并進行Spearman 分析。此過程在北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

2 結果與分析

2.1 煙葉葉際微生物菌群結構的變化規律

2.1.1 操作分類單元 (operational taxonomic units,OTU) 聚類分析 花瓣圖分析結果 (圖1) 表明，在OTU 水平下，所有樣本共有的真菌OTU 數為12 種，共有的細菌OTU 數為5 種。共有的真菌屬為鏈格孢屬Alternaria、枝孢霉屬Cladosporium、附球菌屬Epicoccum、Symmetrospora、亞隔孢殼屬Didymella、Stagonosporopsis等；共有的細菌屬為泛菌屬Pantoea、假單胞菌屬Pseudomonas、未分類的立克次體目unidentified Rickettsiales 等。施藥前感病與健康煙葉真菌群落獨有的OTU 種類數分別為1 和13 種 (圖1A)，而細菌群落獨有的OTU 種類數為8 和17 種 (圖1B)。施用多抗霉素5、10、15 d 后，健康煙葉中葉際真菌獨有的OTU 數分別為14、27、37 種，均高于感病煙葉（分別為2、2、4 種），但兩者均較施藥前增高。而施用多抗霉素5、10、15 d 后，感病煙葉葉際細菌特有的OTU 分別為8、13、6 種，在10 d 時達到峰值；而健康煙葉葉際細菌特有的OTU 分別為4、1、1 種，較施藥前大幅減少且獨有OTU 數低于感病煙葉。

圖1 煙葉樣品真菌 (A)和細菌 (B) OTU 分布花瓣圖Fig.1 Petal diagrams of OTU distributions of fungi (A) and bacteria (B) in tobacco leaf samples

2.1.2 施用多抗霉素后不同持效期健康煙葉與感病煙葉葉際真菌和細菌群落alpha 多樣性的變化規律 alpha 多樣性分析結果 (表2) 表明，健康與感病煙葉葉際真菌和細菌群落的測序覆蓋度指數均達到0.96 以上，表明測序數據合理，可以真實、合理地反映微生物群落的多樣性。在真菌群落結構中，施用多抗霉素前，健康煙葉 (DKJ0) 的多樣性指數 ( Shannon 指數和 Simpson 指數) 和豐富度指數 (Chao1) 均高于感病煙葉 (DKB0)，且在多樣性指數間存在顯著差異。施用多抗霉素后，感病煙葉的多樣性指數 ( Shannon 指數和 Simpson 指數) 在5 d 時分別達到峰值1.62 和0.47。而健康煙葉在15 d 時達到峰值 (分別為3.46 和0.80)，豐富度指數 (Chao1) 無顯著差異。在細菌群落結構中，施用多抗霉素前，健康煙葉 (DKJ0) 與感病煙葉(DKB0) 的多樣性指數 (Shannon 指數和Simpson指數) 和豐富度指數 (Chao1) 之間無顯著差異。施用多抗霉素后，感病煙葉的多樣性指數 (Shannon指數和Simpson 指數) 明顯增加，且在5 d 時達到峰值2.90 和0.79；而健康煙葉的多樣性指數則呈下降趨勢。

表2 煙葉葉際真菌和細菌alpha 多樣性變化Table 2 The variation of alpha diversity of phyllosphere fungi and bacteria in tobacco leaf samples

由物種積累箱形圖 (圖2) 可知，真菌OTU 數接近150 種時，細菌OTU 數接近80 種時，隨著樣本量的加大，箱形圖位置趨于平緩，表明此環境中的物種并不會隨樣本量的增加而顯著增多，即抽樣充分，可以進行數據分析。

圖2 煙葉樣品真菌 (A)和細菌 (B) OTU 水平物種累積箱形圖Fig.2 Box diagrams of horizontal species accumulations of fungi (A) and bacteria (B) OTU in tobacco leaf samples

2.1.3 施用多抗霉素后不同持效期健康煙葉與感病煙葉葉際真菌和細菌群落變化規律 在真菌群落結構門水平 (圖3A) 上，施藥前健康 (DKJ0) 與感病 (DKB0) 煙葉葉際優勢菌門均為子囊菌門(Ascomycota，占比分別為64.20%和94.05%) 和擔子菌門 (Basidiomycota，6.77% 和2.40%)。施用多抗霉素后，感病煙葉葉際子囊菌門相對豐度隨時間變化不大，而擔子菌門相對豐度呈上升趨勢且在5 d 時達到峰值2.97%；而健康煙葉中子囊菌門相對豐度在5 d 時達到峰值76.41%，擔子菌門相對豐度呈下降趨勢。

圖3 多抗霉素施用后煙葉在真菌門(A)和屬(B)水平上的群落組成Fig.3 Community composition at phylum (A) and genus(B) levels of phyllosphere fungi after polyoxin application

在真菌群落結構屬水平 (圖3B) 上，38.06%的OTU 可以注釋到屬水平。其中優勢菌屬為鏈格孢屬Alternaria、枝孢霉屬Cladosporium、附球菌屬Epicoccum、Boeremia、亞隔孢殼屬Didymella、Symmetrospora、Stagonosporopsis、Plectosphaerella、亡革菌屬Thanatephorus、莖點霉屬Phoma。施用多抗霉素前，感病 (DKB0) 煙葉的鏈格孢屬(84.63%) 顯著高于健康煙葉 (36.56%) (P＜0.05)。施用多抗霉素后，感病煙葉的鏈格孢屬呈下降趨勢而健康煙葉中的鏈格孢屬呈上升趨勢且在5 d 時達到峰值 (54.14%)；感病煙葉和健康煙葉的枝孢霉屬總體均呈下降趨勢，在15 d 時分別下降了12.9%和3.54%；附球菌屬在健康煙葉和感病煙葉中表現出相似的變化情況，均在5 d 時達到峰值 (分別為5.69%和6.26%)，此后呈下降趨勢；Boeremia在健康煙葉中總體呈下降趨勢，在15 d時下降了3.67%，而在感病煙葉中總體呈上升趨勢，在15 d時上升了5.25%；亞隔孢殼屬在健康煙葉和感病煙葉中均呈上升趨勢，在健康煙葉中15 d 時達到峰值 (5.31%)，而在感病葉片中5 d 時達到峰值(3.23%)；Symmetrospora在健康煙葉中總體呈下降趨勢，而在感病煙葉中隨時間變化不大；Stagonosporopsis在健康煙葉和感病煙葉中均在5 d 時達到峰值 (分別為2.66%和2.59%)；Plectosphaerella在健康煙葉和感病煙葉中均隨時間變化不大；亡革菌屬僅在施用多抗霉素前的健康煙葉中檢測到；莖點霉屬在健康煙葉和感病煙葉中均在10 d時達到峰值 (分別為0.89%和0.57%)。

在細菌群落結構門水平 (圖4A) 上，施藥前，健康 (DKJ0) 與感病 (DKB0) 煙葉葉際優勢菌門均為變形菌門 (Proteobacteria，分別為7.16% 和38.81%) 和厚壁菌門 (Firmicutes，分別為16%和0.78%)。施藥后，健康和感病煙葉葉際變形菌門的相對豐度均上升，在健康煙葉中于15 d 時達到峰值 (12.19%)，而在感病煙葉中于5 d 時達到峰值(72%)；厚壁菌門的相對豐度在健康和感病煙葉中均隨時間延長而下降，在15 d 時分別下降了15.78%和0.78%。

圖4 多抗霉素施用后煙葉在細菌門(A)和屬(B)水平上的群落組成Fig.4 Community compositions at phylum(A) and genus(B) levels of phyllosphere bacteria after polyoxin application

在細菌群落結構屬水平 (圖4B) 上，32.65%的OTU 可以注釋到屬水平。其中優勢菌屬為泛菌屬Pantoea、假單胞菌屬Pseudomonas、馬賽菌屬Massilia、魏斯氏菌屬Weissella、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas、未鑒定的立克次氏體目unidentified_Rickettsiales、寒冷桿菌屬Frigoribacterium、甲基桿菌屬Methylobacterium、Pseudokineococcus、科薩克氏菌屬Kosakonia。施用多抗霉素前，感病(DKB0) 煙葉的泛菌屬 (22.93%) 顯著高于健康煙葉(6.26%) (P＜0.05)。施用多抗霉素后，泛菌屬在健康煙葉和感病煙葉的相對豐度均呈上升趨勢，且分別在15 d 時達到峰值 (分別為6.94%和35.23%)；健康煙葉和感病煙葉中的假單胞菌屬的相對豐度在15 d 時分別增加了2.46%和25.84%；馬賽菌屬在健康煙葉中僅在5 d 時被檢測到，而在感病煙葉中均被檢測到且在5 d 時達到峰值 (17.45%)；魏斯氏菌屬僅在健康煙葉中0 d 時檢測到；鞘氨醇單胞菌屬在健康煙葉中5 d 時達到峰值 (1.68%)，而在感病煙葉中的相對豐度隨時間延長而減少；未鑒定的立克次氏體目在健康煙葉和感病煙葉中表現出相似的模式，均在10 d 時達到峰值 (分別為1.45%和1.01%)；寒冷桿菌屬和甲基桿菌屬在健康煙葉中僅在5 d 時被檢測到，而在感病煙葉中 5 d 時達到峰值 (分別為0.56%和0.89%)；Pseudokineococcus僅在健康煙葉5 d 時和感病煙葉10 d 時被檢測到；科薩克氏菌屬在健康煙葉中僅在10 d 時被檢測到，而在感病煙葉中在0 和5 d 均被檢測到。

2.1.4 Spearman 相關分析 在試驗開展期間該地區大部分時間均有小雨。自動氣象站測量結果顯示，在施藥前0 d 及施藥后5、10、15 d 時的降雨量分別為13.60、19.00、11.30 和25.40 mm；溫度分別為18.32、18.97、17.51 和16.54 ℃；空氣相對濕度分別為82.49%、83.81%、78.99%和90.98%；病情指數分別為38.33、45.74、65.00、78.89。

本研究對樣品的取樣時間、環境因子 (平均溫度、相對濕度、降雨量) 及病情指數與其葉際top50 的菌屬進行了Spearman 相關分析，用來研究環境因子與微生物alpha 多樣性和物種之間的相互變化關系。結果表明，在真菌屬水平上，取樣時間與枝孢霉屬和Hannaella相對豐度呈顯著負相關；溫度與枝孢霉屬的相對豐度呈顯著正相關，與Boeremia的相對豐度呈顯著負相關；降雨量和相對濕度均與Botryotinia的相對豐度呈顯著負相關；病情指數與鏈格孢屬的相對豐度呈極顯著正相關，與Symmetrospora、Candida、Dioszegia、Saitozyma的相對豐度呈顯著負相關 (圖5A)。

圖5 多抗霉素施用后葉際真菌(A)和細菌(B)群落的Spearman 相關分析熱圖Fig.5 Heat maps of Spearman correlation analysis based on phyllosphere fungal (A) and bacterial(B) communities after polyoxin application

在細菌屬水平上，取樣時間與unidentified_Lachnospiraceae 和unidentified_Corynebacteriaceae相對豐度呈顯著負相關；溫度與Faecalibacterium和Aureimonas的相對豐度呈顯著正相關；病情指數與Pantoea和Pseudomonas的相對豐度呈極顯著正相關，與Massilia、Microbacterium的相對豐度呈顯著正相關 (圖5B)。

2.2 煙葉葉際微生物代謝功能的變化規律

2.2.1 煙葉葉際微生物功能組成分析 真菌群落FUNGuild 功能預測結果 (圖6A)：多抗霉素施用前，健康和感病煙葉葉際真菌優勢功能類群均為內生菌-植物病原菌類群 (endophyte-plant pathogen)和動物病原菌-內生菌-植物病原菌-木質腐生菌類群 (animal pathogen-endophyte-plant pathogen-wood saprotroph)，且感病組織的動物病原菌-內生菌-植物病原菌-木質腐生菌類群相對豐度高于健康組織而內生菌-植物病原菌類群相對豐度低于健康組織；多抗霉素施用后，在感病煙葉中，動物病原菌-內生菌-植物病原菌-木質腐生菌類群的相對豐度在5 d 時呈下降趨勢而后逐漸上升；內生菌-植物病原菌類群的相對豐度在5 d時達到峰值；健康煙葉中動物病原菌-內生菌-植物病原菌-木質腐生菌類群的相對豐度在5 d 時達到峰值此后逐漸下降，內生菌-植物病原菌類群的相對豐度呈逐漸下降趨勢。

圖6 FUNGuild 葉際真菌 (A) 和細菌 (B) 功能注釋聚類熱圖Fig.6 FUNGuild heatmaps of functional prediction of phyllosphere fungi (A) and bacteria (B) in tobacco leaf samples

細菌群落FUNGuild 功能預測結果 (圖6B)：多抗霉素施用后，健康和感病煙葉葉際細菌優勢功能類群的相對豐度未發生明顯變化，其優勢功能群均為遺傳信息處理類群(genetic information processing)、新陳代謝類群 (metabolism)、未定義類群(unclassified) 和細胞過程類群 (cellular processes)。

2.2.2 煙葉葉際微生物代謝功能變化規律 Biolog ECO 微孔板中含有可供自然界中大部分微生物利用的碳源物質，其中包括糖類、氨基酸、羧酸類、雙親化合物、聚合物和胺/氨基化合物共31 種碳源。多抗霉素施用前，健康煙葉 (DKJ0) 能夠代謝除了α-丁酮酸以外的30 種碳源；而感病煙葉能夠代謝除了α-丁酮酸和L-蘇氨酸以外的29 種碳源。

多抗霉素施用后，感病與健康煙葉葉際微生物對31 種碳源的代謝均受到不同程度抑制，多抗霉素施用5 d 后，感病煙葉可高效代謝25 種碳源，而對D-木糖、2-羥基苯甲酸、L-苯丙氨酸、4-羥基苯甲酸、α-丁酮酸和苯乙基胺的代謝較差；而健康煙葉受多抗霉素影響較大，此時無高效利用碳源。多抗霉素施用10 d 后，感病煙葉葉際微生物的代謝能力進一步受到抑制，此時無高效代謝碳源；而健康煙葉葉際微生物的代謝活性逐漸恢復，此時可高效代謝7 種碳源，包括D-半乳糖醛酸、L-天冬酰胺、吐溫80、D-甘露醇、L-絲氨酸、N-乙酰-D-葡萄糖胺和D-蘋果酸。多抗霉素施用15 d 后，感病煙葉葉際微生物的代謝活性逐漸恢復，此時可高效利用除了丙酮酸甲酯、D-木糖、2-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸和α-丁酮酸以外的26 種碳源，而健康煙葉此時無高效利用碳源(圖7)。

圖7 多抗霉素施用后煙葉葉際微生物代謝功能的聚類熱圖Fig.7 Cluster heat map of the effect of polyoxin on metabolism of tobacco phyllosphere microorganisms

3 結論與討論

微生物群落是環境脅迫的敏感指標，在維持生態系統平衡和葉片健康方面均具有不可忽視的作用[35]。本研究采用Illumina 高通量測序技術對施用多抗霉素后不同持效期內煙葉葉際微生物群落結構進行分析，結果表明，多抗霉素施用前，健康煙葉與感病煙葉的優勢真菌門均為子囊菌門和擔子菌門，優勢細菌門均為變形菌門，健康煙葉的子囊菌門和變形菌門低于感病煙葉而擔子菌門高于感病煙葉，這與劉亭亭等[36]報道的煙草葉際微生物群落結構相似。煙草赤星病病原菌侵入煙草組織前有一個旺盛的腐生階段，而子囊菌門中致病菌較多，其大多為腐生生物[37]，這可能是導致感病煙葉中子囊菌門顯著高于健康煙葉的原因。變形菌門在多種農作物上均為優勢菌門，例如水稻、甘蔗、大豆、三葉草、擬南芥[38-40]等。這可能是由于變形菌門的革蘭氏陰性菌可以依賴群體感應分子 (QS) 來與其他葉際細菌競爭，從而獲得有利的生態位置[41]。有研究表明，感病擬南芥葉片中變形菌門細菌群體過度增殖可以抑制厚壁菌門的相對豐度，而健康葉片可以通過 patterntriggered immunity (PTI) 途徑和MIN7 囊泡轉運途徑以及CADI基因共同調節葉際微生態平衡[42]，這可能是導致感病煙葉變形菌門相對豐度顯著高于健康煙葉而厚壁菌門低于健康煙葉的原因。

在真菌屬水平上，感病煙葉中占優勢的真菌屬為鏈格孢屬、枝孢霉屬、Symmetrospora，而健康煙葉中占優勢的真菌屬為鏈格孢屬、枝孢霉屬、Boeremia、亞隔孢殼屬及Symmetrospora；與劉亭亭[36]等發現感赤星病煙葉與健康煙葉優勢真菌屬為鏈格孢屬、Symmetrospora和枝孢霉屬的結果類似。在健康煙葉中同樣存在相當比例的鏈格孢屬，同時枝孢菌屬[43]、亞隔孢殼屬[44]和Boeremia[45]均被報道可使作物致病，表明健康煙葉同樣存在感病風險，一旦微生態失調即可導致植物病害的發生。在細菌屬水平上，感病煙葉和健康煙葉中占優勢的細菌屬均為泛菌屬和假單胞菌屬，Huang 等[46]發現，煙草Didymella葉斑病中感病煙葉和健康煙葉中優勢細菌屬同樣為泛菌屬和假單胞菌屬。推測煙草葉際細菌的種類相對穩定，泛菌屬和假單胞菌屬為煙草葉際常見的優勢菌屬，這可能是由于其能夠利用高絲氨酸內酯(AHLs) 來搶占生態位從而成為葉際優勢細菌[47]，其大多為有益細菌。

殺菌劑在防控相應病害的同時往往會影響葉際微生物穩態環境，如殺菌劑烯肟菌酯施用后，小麥葉片的細菌群落發生顯著變化[48]；菌核凈防控煙草靶斑病的同時，感病與健康葉片的alpha 多樣性均增加[49]。本研究中，多抗霉素施用后，感病煙葉和健康煙葉的真菌多樣性均增加，且健康煙葉真菌多樣性顯著高于感病煙葉，表明多抗霉素不同持效期內葉際真菌和細菌的菌群結構均發生了改變，推測其原因可能是多抗霉素施用后促進了某些菌群的大量繁殖。Chen 等[50]同樣發現擬南芥感病葉片微生物多樣性低于健康葉片，推測植物可以通過調節微生物穩態從而維持植物健康。多抗霉素殺菌劑施用后健康煙葉具有持久的保護作用，因此在病害預防和控制方面，建議在早期病情指數較低時使用多抗霉素殺菌劑。本研究結果表明，多抗霉素可以降低感病煙葉和健康煙葉致病菌鏈格孢屬、枝孢霉屬的相對豐度，與劉亭亭[36]等發現波爾多液施用后，煙草葉際真菌鏈格孢屬和枝孢霉屬等致病菌的相對豐度降低結果相似。在本研究中，多抗霉素不僅作用于鏈格孢屬和枝孢霉屬，同時感病煙葉中真菌Boeremia、亞隔孢殼屬、附球菌、Stagonosporopsi、莖點霉等潛在病原體的相對豐度增加，有益細菌泛菌屬和假單胞菌屬的相對豐度葉同樣增加；有研究表明，泛菌屬能夠抑制多種真菌或細菌引起的病害[51-52]，銅綠假單胞菌可以用來誘導大豆對灰霉病產生抗性[53]。而這些菌群相對豐度的改變可能會直接或間接影響植物的各種生理代謝活動，進而影響植物的正常生長。本研究中，健康煙葉中真菌other組微生物明顯增加，高多樣性有助于維持葉際生態系統的穩定。推測多抗霉素可能對煙草葉際益生微生物具有調控作用，進而防控煙草赤星病的發生。

植物葉際微生物來源復雜且呈動態變化，是植物內在因素與環境因子長期選擇的結果[54]。本研究對樣品的取樣時間、環境因子 (溫度、相對濕度和降雨量) 及病情指數與葉際top50 微生物進行了Spearman 相關分析。結果表明，病情指數與鏈格孢屬、泛菌屬、假單胞菌屬的相對豐度呈極顯著正相關，與Symmetrospora、Candida、Dioszegia、Saitozyma的相對豐度呈顯著負相關。已有研究表明，鏈格孢屬真菌會產生許多初級和次級代謝產物 (SMs)，共計可產生 70 余種霉菌毒素，從而抑制次級定植微生物的生長[55]。本研究中，溫度與枝孢霉屬、Faecalibacterium和Aureimonas的相對豐度呈顯著正相關，與Boeremia的相對豐度呈顯著負相關。這與韓秋影等[56]、劉偉妍[57]報道假單胞菌屬和Thalassospira等細菌屬隨溫度升高數量急劇降低，紅螺菌科和Ruegeria在32 ℃大幅增加的結果類似，進一步說明本文多抗霉素對葉際微生態的影響中，環境因子也起到了一定影響。

本研究測定了多抗霉素施用前后不同持效期內感病與健康煙葉葉際微生物對糖類、羧酸類、氨基酸、聚合物類、胺類和酚類等6 類共31 種碳源的代謝活性，發現多抗霉素施用前，健康煙葉能夠代謝除了α-丁酮酸以外的30 種碳源；而感病煙葉能夠代謝除了α-丁酮酸和L-蘇氨酸以外的29 種碳源，α-丁酮酸對煙草赤星病葉際微生物的抑制效果有待進一步研究。多抗霉素施用5 d時，健康煙葉葉際微生物無高效利用的碳源，而感病煙葉可高效利用25 種碳源，與謝蘭芬等[58]發現噴施解淀粉芽孢桿菌B9601-Y2 可以降低玉米葉際微生物碳源代謝活性的結果類似，這可能是由于健康葉片中不可培養的微生物多于感病葉片。不可培養的微生物在受到外界脅迫時會進入 VBNC(viable but nonculturable) 狀態，即保持長期低代謝活性[59]。進一步說明多抗霉素在防控煙草赤星病上具有持效性和預防作用，推測此藥劑提前施用作用更佳，建議將其作為一種預防保護性藥劑使用。