我國(guó)作物病菌標(biāo)準(zhǔn)品的研究進(jìn)展

楊文莉 朱梨梨 陳健 陳燕欣 姚涓 姜大剛

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510642）

作物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中容易受到病菌感染，導(dǎo)致其生長(zhǎng)狀況、產(chǎn)量和品質(zhì)受到影響。為控制病菌傳播速度，減少病菌對(duì)農(nóng)作物的侵害，及時(shí)準(zhǔn)確地檢測(cè)出染病的植株極為重要。傳統(tǒng)的病菌檢測(cè)方法主要通過(guò)觀察染病植株和菌群的表征進(jìn)行診斷，存在檢測(cè)滯后、成本高、靈敏度低等問(wèn)題，影響對(duì)作物病害的控制。近年來(lái)，分子檢測(cè)技術(shù)在作物病菌檢測(cè)工作上的應(yīng)用和發(fā)展，極大地縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)靈敏度，對(duì)病害的感染情況能夠更及時(shí)的掌握。國(guó)內(nèi)相關(guān)監(jiān)管部門(mén)陸續(xù)出臺(tái)了分子檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)與方法，以規(guī)范和促進(jìn)作物病菌檢測(cè)工作的進(jìn)行。在作物病菌的分子檢測(cè)工作中，標(biāo)準(zhǔn)品可為檢測(cè)結(jié)果提供可靠的參考值，提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性和精準(zhǔn)性。

根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則第2 部分：常用術(shù)語(yǔ)及定義》（標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：GB/T 15000.2—2019）及中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)（CNAS）《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品生產(chǎn)者能力認(rèn)可準(zhǔn)則》（標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：CNAS-CL04）指出，標(biāo)準(zhǔn)品是指適用于計(jì)量或檢測(cè)中，已被確定其符合測(cè)量過(guò)程的、具有高度均勻性和穩(wěn)定性的材料［1］。標(biāo)準(zhǔn)品主要用于測(cè)量系統(tǒng)的校準(zhǔn)、測(cè)量程序的評(píng)估和質(zhì)量控制等幾個(gè)方面［2-3］。在全球范圍內(nèi)，美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（National Institute of Standards and Technology,NIST）、澳大利亞國(guó)家檢測(cè)研究所（National Measurement Institute,Australia,NMIA）、中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院（National Institute of Metrology,China,NIMC）等多所專業(yè)機(jī)構(gòu)已經(jīng)開(kāi)展標(biāo)準(zhǔn)品的研制［4］。經(jīng)過(guò)多年發(fā)展，許多標(biāo)準(zhǔn)品已經(jīng)被成功研制并投入使用。但作物病菌標(biāo)準(zhǔn)品方面的相關(guān)研制依然較少，不利于我國(guó)開(kāi)展對(duì)作物病害的檢測(cè)防治工作。本文通過(guò)對(duì)作物病菌檢測(cè)方法、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)及作物病菌標(biāo)準(zhǔn)品研究進(jìn)展進(jìn)行梳理總結(jié)，以期為我國(guó)作物病菌標(biāo)準(zhǔn)品的研制提供參考。

1 作物病菌及其檢測(cè)方法

作物病菌主要可以分為細(xì)菌、真菌和病毒3種［5］。作物感染病菌后，會(huì)出現(xiàn)變色、壞死、萎蔫、腐爛和畸形等癥狀。真菌感染存在易復(fù)發(fā)、傳播性強(qiáng)等問(wèn)題，需要對(duì)受感染的作物進(jìn)行及時(shí)的追蹤檢測(cè)和治療。病毒感染具有隱秘性強(qiáng)、傳播性強(qiáng)、表征不明顯等特點(diǎn)，通常無(wú)法及時(shí)發(fā)現(xiàn)并給予相對(duì)應(yīng)的措施。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，在全世界范圍內(nèi)，由于作物感染病菌導(dǎo)致的直接或者間接的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)400 億美元/年［6］。也有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在全球氣候變暖的環(huán)境影響下，土壤中作物潛在病原體的相對(duì)豐度會(huì)增加，使作物更容易感染病菌［7-8］。基于作物病菌對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的危害，在《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第351 號(hào)》中，有15 種病菌被列入了《全國(guó)農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物名單》和《應(yīng)施檢疫的植物及植物產(chǎn)品名單》，其中細(xì)菌7 種，真菌6 種，病毒3 種（表1）。例如，瓜類果斑病菌（bacterial fruit blotch,BFB）是一種嚴(yán)重的細(xì)菌性病害，該病菌可以侵染西瓜、甜瓜、南瓜、葫蘆等葫蘆科植物，使果實(shí)形成暗褐色病斑，后逐漸發(fā)展形成黑褐色壞死斑，最終導(dǎo)致腐爛，影響葫蘆科植物產(chǎn)品質(zhì)量及產(chǎn)量，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，已成為影響我國(guó)葫蘆科植物農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)的主要病害之一［9］。玉米褪綠斑駁病毒（maize chlorotic mottle virus,MCMV）侵染玉米后會(huì)導(dǎo)致作物壞死，玉米產(chǎn)量下降，是我國(guó)禁止入境的檢疫性有害生物之一［10］。對(duì)于病菌引起的作物病害，在生產(chǎn)上可以通過(guò)作物輪作、使用抗性品種等方法降低作物病菌感染［11］，但無(wú)法在病害出現(xiàn)之前發(fā)現(xiàn)作物的感病情況。因此對(duì)作物感染病菌早期進(jìn)行及時(shí)準(zhǔn)確的檢測(cè)，可以為作物病害防治工作提供參考，減少經(jīng)濟(jì)損失。

目前，常用的作物病菌檢測(cè)方法主要包括形態(tài)學(xué)、微生物學(xué)、生化鑒定以及分子檢測(cè)等。其中，傳統(tǒng)的方法是根據(jù)作物的生理狀態(tài)如枯萎、潰爛等癥狀進(jìn)行初步的判斷，再通過(guò)分離病菌，觀察病菌的形態(tài)做出診斷［12-13］。雖然這些方法應(yīng)用廣泛，但需要診斷者具備一定的專業(yè)知識(shí)，具有比較大的主觀性和不確定性；而且對(duì)于難以在體外培養(yǎng)的致病微生物（如病毒），鑒定難度大。為此，需要一種高效的方法，對(duì)感病的植株進(jìn)行及時(shí)準(zhǔn)確的檢測(cè)。分子檢測(cè)技術(shù)具有準(zhǔn)確性好、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，在作物病菌檢測(cè)中應(yīng)用越來(lái)越廣泛。李興紅等［14］通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immune sorbent assays,ELISA）的方法對(duì)辣椒輕斑駁病毒（pepper mild mottle virus,PMMoV）進(jìn)行檢測(cè)，譙天敏等［15］通過(guò)巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）檢測(cè)桉樹(shù)焦枯病。近年來(lái)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR）、數(shù)字PCR（digital PCR,dPCR）等分子檢測(cè)技術(shù)，也被運(yùn)用到作物病菌檢測(cè)工作中［16］。高艷玲等［17］建立了苜蓿花葉病毒（alfalfa mosaic virus,AMV）的RT-PCR 和RT-qPCR 檢測(cè)體系，可用于檢測(cè)馬鈴薯組織中及薊馬和蚜蟲(chóng)體內(nèi)的苜?；ㄈ~病毒；李輝等［18］建立了多年明孢盤(pán)菌（N.perennans）導(dǎo)致的蘋(píng)果牛眼果腐病微滴式數(shù)字PCR 檢測(cè)體系，實(shí)現(xiàn)對(duì)該病原菌的高效、高精度檢疫鑒定。dPCR 作為一種新的核酸定量技術(shù)，其不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線可以對(duì)靶標(biāo)基因的拷貝數(shù)進(jìn)行絕對(duì)定量，具有靈敏度高、結(jié)果精準(zhǔn)等優(yōu)勢(shì)。將dPCR 應(yīng)用于作物病菌檢測(cè)工作，可以使結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，具有廣泛的應(yīng)用前景［19-20］?！陡涕冱S龍病菌數(shù)字PCR 檢測(cè)》（標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：DB 44/T 2220-2019）的出臺(tái)，將dPCR 技術(shù)應(yīng)用到實(shí)際檢測(cè)工作中，在提高柑橘黃龍病菌檢測(cè)工作效率和結(jié)果準(zhǔn)確性的同時(shí)，也為dPCR 技術(shù)應(yīng)用到其他的病菌檢測(cè)中提供了參考。

為了使檢測(cè)過(guò)程更加規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)化，經(jīng)查詢?nèi)珖?guó)標(biāo)準(zhǔn)信息公共服務(wù)平臺(tái)（https://std.samr.gov.cn），我國(guó)已制定并發(fā)布超過(guò)230 項(xiàng)作物病菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)（表2），以規(guī)范和加快在生產(chǎn)上的應(yīng)用。在這些標(biāo)準(zhǔn)中，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)共71 項(xiàng)，占比30%；行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)占比最多，共133 項(xiàng)，占比55%；地方標(biāo)準(zhǔn)有32 項(xiàng)，占比13%；另有5 項(xiàng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃，目前處于起草階段（圖1）。柑橘黃龍病是一種由柑橘黃龍病菌侵染柑橘屬、金柑屬等蕓香科植物，導(dǎo)致染病作物葉片變黃和柑橘產(chǎn)量下降的疾病，該病已成為影響柑橘產(chǎn)業(yè)最嚴(yán)重的病害。目前已經(jīng)制定和發(fā)布了《柑桔黃龍病菌實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法》（標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：GB/T 28062-2011）、《柑橘黃龍病菌數(shù)字PCR 檢測(cè)》（標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：DB44/T 2220-2019）等相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，促進(jìn)了柑橘黃龍病檢測(cè)與防治工作的開(kāi)展［21］。水稻細(xì)菌性條斑病（rice bacterial leaf streak,BLS）是對(duì)水稻危害最嚴(yán)重的細(xì)菌性病害之一，對(duì)水稻條斑病菌進(jìn)行及時(shí)的檢測(cè)，可以控制病菌在水稻間的傳播速度，減少經(jīng)濟(jì)損失［22］。目前《水稻細(xì)菌性條斑病菌的檢疫鑒定方法》（標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：GB/T 28099-2011）標(biāo)準(zhǔn)的出臺(tái)，對(duì)病菌信息、鑒定方法、鑒定標(biāo)準(zhǔn)等方面做出了詳細(xì)的介紹，使鑒定方法更加規(guī)范化，檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。這些檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的出臺(tái)對(duì)作物病菌檢測(cè)工作的規(guī)范化、檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化和可靠性有重要意義。

2 標(biāo)準(zhǔn)品與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

在作物病菌檢測(cè)工作中，為確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要標(biāo)準(zhǔn)菌株作為對(duì)照，提供參考依據(jù)。標(biāo)準(zhǔn)菌株是一種可溯源的且生物學(xué)特性穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)品，在檢測(cè)中起到對(duì)照菌株、培養(yǎng)基性能檢驗(yàn)、試劑的標(biāo)準(zhǔn)性和設(shè)備性能檢測(cè)的作用［23］。我們查詢了標(biāo)準(zhǔn)品信息網(wǎng)（http://www.gbw.org.cn）、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品網(wǎng)（http://www.crmch.com）及標(biāo)物中心網(wǎng)（http://www.gjbwzx.cn），有52 種作物病菌標(biāo)準(zhǔn)品研制成功并投入使用（表3）；其中，真菌標(biāo)準(zhǔn)品研制數(shù)量最多，共有46 種，占比88%；細(xì)菌和病毒的標(biāo)準(zhǔn)品研制較少，各只有3 種，分別占比6%。例如，水稻細(xì)菌性谷枯病是由伯克霍爾德氏菌（Burkholderia glumae）屬引起水稻苗腐、鞘腐以及谷粒腐爛的細(xì)菌性病害，該病菌標(biāo)準(zhǔn)品的成功研制，有助于水稻細(xì)菌性谷枯病菌檢測(cè)工作開(kāi)展［24］。羅金燕等［25］通過(guò)將田間分離出來(lái)的病原菌與水稻細(xì)菌性谷枯病菌標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行生理特性、菌落特性等25 項(xiàng)比較，以確定該田間病菌為水稻細(xì)菌性谷枯病菌。小麥赤霉病是由多種鐮刀屬真菌侵染小麥，導(dǎo)致小麥產(chǎn)量減少的病害，小麥赤霉菌標(biāo)準(zhǔn)品的成功研制有助于該病的檢測(cè)工作開(kāi)展［26］。武愛(ài)波等［27］利用標(biāo)準(zhǔn)菌株，建立了用于檢測(cè)赤霉菌及其毒素的PCR 檢測(cè)方法。趙麗紅等［28］利用標(biāo)準(zhǔn)菌株Vd076 建立了鑒定棉花黃萎病抗性品種的qPCR 方法。標(biāo)準(zhǔn)菌株的應(yīng)用為作物病菌的檢測(cè)工作提供了陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性和溯源性，增加了檢測(cè)結(jié)果的公信力。

表3 部分作物病菌標(biāo)準(zhǔn)品信息Table 3 Information of selected crop pathogen standards

與標(biāo)準(zhǔn)品相比，有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（certified reference material,CRM）在檢測(cè)工作中能作為量值溯源的依據(jù)，可以對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確定量，使結(jié)果更加精確。為此，我們通過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源共享平臺(tái)（National Sharing Platform for Reference Materials,China）查詢相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制情況，但未查詢到作物病菌類有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以分為基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、質(zhì)粒DNA 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)這四種［29］。質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是現(xiàn)有的生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中較為常見(jiàn)的一種，其優(yōu)勢(shì)在于研制成本低，是解決病菌檢測(cè)中量值溯源問(wèn)題的主要方法之一［30］?；蚪MDNA 分子標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的運(yùn)用范圍和質(zhì)粒DNA 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)類似，僅能用于核酸水平上的檢測(cè)，其優(yōu)點(diǎn)在于研制難度較低，可以長(zhǎng)期保存，在進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 時(shí)使用起來(lái)比較簡(jiǎn)便，但其對(duì)待測(cè)樣品DNA 的質(zhì)量要求相對(duì)要求較高，會(huì)受檢測(cè)樣品DNA 質(zhì)量的影響?；w標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也是所有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制中較多的一種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，在其制備過(guò)程中，候選物的純度與基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的準(zhǔn)確性直接相關(guān)，因此候選物的選擇十分重要［31］。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與上述幾種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不同，由于其生物學(xué)特性易受環(huán)境因素的影響，其制備與標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)難度較大，我國(guó)暫未有病菌蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的報(bào)道［32］。

在制備流程上，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)品的研制流程大體一致，主要包括候選物的制備、均勻性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性檢驗(yàn)等，但標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備要求更高［29-30］。在制備病菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時(shí)，可以根據(jù)候選物的特性以及檢測(cè)工作的需求，選擇適當(dāng)?shù)念愋?。作物病菌?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制，有利于滿足作物病菌檢測(cè)中準(zhǔn)確量值的需要，從而及時(shí)對(duì)感染病菌的作物進(jìn)行防治。

3 作物病菌標(biāo)準(zhǔn)品面臨的問(wèn)題與展望

我國(guó)是世界上人口數(shù)量最多的國(guó)家之一，糧食需求量大，為滿足人民日益增長(zhǎng)的農(nóng)產(chǎn)品需求，保證農(nóng)產(chǎn)品綠色、安全生產(chǎn)極為重要。作物病菌標(biāo)準(zhǔn)品可以在盡早發(fā)現(xiàn)作物病菌感染，促使建立更好更快的防治方法方面發(fā)揮積極作用，為生產(chǎn)更安全更優(yōu)質(zhì)的農(nóng)產(chǎn)品保駕護(hù)航。

在作物病菌檢測(cè)工作中，標(biāo)準(zhǔn)品可以作為對(duì)照樣品，為結(jié)果提供依據(jù)，保證結(jié)果的可信度，但仍存在以下問(wèn)題：首先，現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)品品種和數(shù)量較少，無(wú)法完全滿足作物病菌檢測(cè)中的需求。為此，國(guó)家應(yīng)統(tǒng)籌規(guī)劃加大相關(guān)項(xiàng)目的啟動(dòng)、落實(shí)和發(fā)展，使更多學(xué)者投身到病菌標(biāo)準(zhǔn)品的研制中，為作物病菌標(biāo)準(zhǔn)品的研制提供更多機(jī)遇［33］。其次，在檢測(cè)工作中，標(biāo)準(zhǔn)品的使用無(wú)法做到對(duì)作物感病情況準(zhǔn)確量值。而在分子檢測(cè)工作中，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)尤其是有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以作為定值參照，對(duì)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確定量［34］。但由于我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)整體的發(fā)展時(shí)間短，作物病菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制在我國(guó)鮮有報(bào)道，為此，還需加大力度研制作物病菌的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。同時(shí)，在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制與應(yīng)用過(guò)程中，也面臨著原材料來(lái)源不一與質(zhì)量不穩(wěn)定、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備方式不同導(dǎo)致測(cè)量誤差、定值方法復(fù)雜且成本較高等問(wèn)題。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，可通過(guò)建立聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室共同制備，或建立實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)，共享研究方法和成果加以解決［21］?？傮w來(lái)說(shuō)，從國(guó)家層面對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的規(guī)范管理和體系的不斷完善，我國(guó)作物病菌標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制工作將迎來(lái)更快的發(fā)展。