CRISPR/Cas9 介導的adeG 基因敲除大腸桿菌細菌模型的建立

朱恬儀 孔桂美 焦紅梅 郭停停 烏日汗 劉翠翠 高成鳳 李國才

（1.揚州大學醫學院，揚州 225100；2.江蘇省人獸共患病學重點實驗室，揚州 225100）

鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii,AB）是臨床常見的非發酵革蘭陰性桿菌［1］，也是引起醫院內感染的重要條件致病菌之一。其具有較強的感染力及耐藥性［2］，常導致嚴重肺炎、血流感染及尿路感染［3］。2017 年，世界衛生組織（WHO）將耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌添加到優先研究目錄中，以開發針對該物種的新抗生素或策略［4］。在過去的幾十年中，抗生素挽救了無數生命［5］，但廣譜抗生素在醫學和畜牧業中的過度使用導致了細菌的快速進化以及超級細菌的出現［6-7］。同時抗菌素耐藥性（antimicrobial resistance,AMR）的出現和全球流行更是對全球公共衛生構成了嚴重威脅［8］。然而，開發新藥不僅成本高，研究耗時長［9］，且對抗生素的研發速度遠遠不及細菌耐藥性的產生速度［10］，因此需要開發新的抗菌策略來應對AB 日益嚴重的耐藥性。

CRISPR-Cas 系統是指聚簇規則間隔的短回文重復序列和相關Cas 蛋白，它是細菌的固有免疫系統，可識別并防御侵襲的外源核酸。由于其可以識別特異性位點并靶向切割DNA 雙鏈，CRISPR-Cas系統已成功被應用作為一種基因編輯工具來預防和控制細菌耐藥性問題［11］。在過去的研究中，II 型CRISPR-Cas 系統已成為基因組工程應用的首選。它只需要在tracrRNA（反式激活CRISPR RNA）以及crRNA（CRISPR RNA）的介導下表達Cas9 蛋白，并將Cas9 引導到入侵DNA 中的靶位點后就可以進行識別和切割。目前將兩個RNA 進一步改進為嵌合的單向導RNA（sgRNA），使得基于Cas9 的基因組編輯變得更加簡單［12-13］。Junaid 等［14］發現基于CRISPR-Cas 系統的基因編輯技術在克服AMR 和包括鮑曼不動桿菌在內的不同細菌菌株中發揮了至關重要的作用。Yao 等［15］利用鮑曼不動桿菌的天然I-F型CRISPR-Cas 系統進行基因組編輯，使adh4 基因轉錄水平被抑制了900 倍。本課題組在前期研究中發現1 株具有完整I-F 型CRISPR-Cas 系統的鮑曼不動桿菌AB43，通過全基因組分析與其耐藥表型發現CRISPR-Cas 系統可能通過內源性基因調控抑制耐藥基因表達［16-17］。這些結果提示運用CRISPR-Cas 系統來抑制鮑曼不動桿菌耐藥性的表達具有可行性。

細菌外排泵是降低抗生素、殺菌劑敏感性的關鍵機制之一，并導致細菌多藥耐藥表型的出現［18］。在革蘭陰性菌中，與臨床相關性最高的是RND 外排泵家族［19］。RND 外排泵由內膜轉運蛋白、膜融合蛋白和外膜因子組成，并跨越細菌內外膜，起主動外排藥物的作用，這導致多重耐藥（multidrug resistance，MDR）鮑曼不動桿菌的出現［19-20］。因此本研究基于RND 外排泵基因adeG 構建耐藥模式菌株，擬通過構建CRISPR/Cas9 系統重組質粒，在大腸桿菌中對RND 外排系統帶來的耐藥性進行抑制，為抑制鮑曼不動桿菌的多重耐藥提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質粒來源 13 株臨床鮑曼不動桿菌來自盱眙人民醫院，鮑曼不動桿菌參考菌株ATCC 17978 及pCas9 質粒由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；T-Vecter 試劑盒、全基因組DNA 提取試劑盒購自寶日醫生物技術有限公司；PNK 酶、DNA 快速連接試劑盒購自碧云天生物試劑有限公司；Bsa I酶、2×Taq plus Master Mix、大腸埃希菌DH5α 購自南京諾唯贊生物科技有限公司；抗生素均購自阿拉丁生化科技股份有限公司。PCR 引物由南京擎科生物科技股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 adeLFGH 基因的PCR 篩選 通過煮沸法粗提13 株鮑曼不動桿菌DNA，并于-20℃保存。PCR引物序列及長度見表1。擴增體系及條件：2×Taq plus Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，雙蒸水9.5 μL，共25 μL，瞬時離心混勻。95℃預變性5 min，循環參數為：95℃變性30 s，退火30 s，按照1 min/kb 進行72℃延伸，共進行35 次循環，再72℃延伸7 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物。

表1 本實驗使用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 藥物敏感實驗檢測AB 耐藥性 采用微量肉湯稀釋法對收集鮑曼不動桿菌進行藥敏檢測。隨機選擇13 株具有完整adeLFGH 的菌株以及參考菌株ATCC 17978 進行藥敏實驗。所使用藥物及縮寫為哌拉西林（PRL）、替卡西林（TIC）、頭孢他啶（CAZ）、美羅培南（MEN）、多黏菌素E（PE）、慶大霉素（GEN）、妥布霉素（TOP）、四環素（TET）、環丙沙星（CIP）、左氧氟沙星（LVX），根據美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）2020 指南，檢測其對抗生素的MIC。

1.2.3 基于adeG 的RND 外排系統模式菌構建 選擇1 株具有完整adeLFGH 且具有多重耐藥性的臨床鮑曼不動桿菌（AB7），提取其全基因組DNA 進行二代測序并擴增adeG 基因。設計adeG 上下游引物，引物序列及長度見表1。以上述菌株DNA 為模板，PCR 擴增目的基因，擴增產物使用產物純化試劑盒進行純化回收。回收后的產物根據T-Vecter 試劑盒說明書進行操作，體系及條件為：T-Vector pMD19 1 μL，純化目的基因2 μL（約0.23 pmol），雙蒸水2 μL，輕輕混勻后加入等體積DNA Ligation Kit，充分混勻，16℃孵育12 h 后轉化DH5α 大腸桿菌，并在含有50 mg/L 氨芐青霉素的LB 平板上篩選，挑單克隆PCR 鑒定。將鑒定正確的大腸桿菌命名為adeG-E.coli，藥敏實驗驗證adeG-E.coli 模式菌株的耐藥性。

1.2.4 pCas9-sgRNA 重組質粒構建及鑒定 利用sgRNA 設計工具CHOPCHOP［22］設計了3 對靶向adeG 基因的sgRNA 序列。合成的sgRNA 序列長度為20 bp，根據Bsa I 酶切位點，在sgRNA 兩端增加黏性末端。添加在正向寡核苷酸鏈的開頭為AAAAC，而添加在反向寡核苷酸鏈的開頭和末端序列分別為AAAC 和G。然后用PNK 酶將配對的sgRNA 寡核苷酸鏈磷酸化，并使用T4 DNA 連接酶連接到Bsa I 酶解的pCas9 上，最終分別產生pCas9-sgRNA1（adeG）、pCas9-sgRNA2（adeG）、pCas9-sgRNA3（adeG）。質粒構建過程如圖1 所示。

將重組質粒通過質粒熱轉法轉化入感受態大腸桿菌DH5α，轉化后的重組菌在37℃孵育過夜，并在含有40 mg/L 氯霉素的LB 平板上篩選。使用每對sgRNA 下游引物為DocR，將位于pCas9 上sgRNA插入位點上游處的一段特異性序列設計為通用上游引物DocF。對篩選出的重組菌落進行PCR 鑒定，確認后保存。

1.2.5 CRISPR/Cas9 介導的adeG 基因敲除大腸桿菌的構建 甘油法制備adeG-E.coli 模式菌感受態，pCas9-sgRNA（adeG）質粒電轉入感受態，37℃培養4 h 后涂布于預先配置好的雙抗（40 mg/L 氯霉素，50 mg/L 氨芐青霉素）LB 平板上。

1.2.6 CRISPR/Cas9 編輯效率及藥敏測定 挑取上述平板上的單菌落進行擴增培養。首次培養時在液體LB 中添加氯霉素和氨芐青霉素，藥物濃度同上。擴增培養12 h 后轉接至液體MH 培養基中培養至OD600為0.5。將培養菌液進行藥物敏感性篩查。與adeG-E.coli 相對比，測定CRISPR/Cas9 編輯效率。同時通過PCR 鑒定adeG-E.coli 中adeG 基因的降解。

2 結果

2.1 adeLFGH基因檢測

PCR 結果顯示13 株臨床分離鮑曼不動桿菌adeL、adeF、adeG、adeH 的攜帶率均為100%。圖2展示了adeLFGH 的PCR 電泳結果。

圖2 adeLFGH PCR 電泳圖Fig.2 PCR gel electrophoresis of adeLFGH

2.2 藥敏結果

藥敏結果顯示（表2，圖3），13 株擁有完整adeLFGH 外排泵系統的臨床鮑曼不動桿菌對多黏菌素E 敏感，對左氧氟沙星耐藥率較低，僅為38.5%，而對頭孢他啶的耐藥率為92.3%，對妥布霉素耐藥率為84.6%，對其他臨床常見藥物耐藥率均為100%，提示具有很強的耐藥性。

圖3 13 株鮑曼不動桿菌對臨床常見抗菌藥物的耐藥百分比Fig.3 Resistance rates of 13 strains of A.baumannii to common clinical antibiotics

表2 ATCC 17978 和13 株鮑曼不動桿菌對臨床常見抗菌藥物的藥敏結果Table 2 Sensitivity results of ATCC 17978 and 13 strains of A.baumannii to common clinical antibiotics

2.3 基于adeG的RND外排系統模式菌構建及耐藥性鑒定

PCR 擴增耐藥鮑曼不動桿菌（AB7）的adeG 基因，目的片段大小約為3.3 kb，純化回收后與T 載體連接，構建T-adeG 質粒。重組質粒通過PCR 鑒定，電泳結果如圖4 所示。將其轉化至DH5α 后對其耐藥表型進行藥敏紙片鑒定（圖5，表3）。與空白對照DH5α 對比，哌拉西林、替卡西林/克拉維酸以及哌拉西林/他唑巴坦由敏感轉為耐藥，氯霉素、美羅培南、米諾環素由敏感轉為中介。

圖4 adeG-E.coli 質粒構建PCR 鑒定Fig.4 PCR identification of constructed adeG-E.coli plasmid

2.4 pCas9-sgRNA(adeG)重組質粒構建及鑒定

將合成的sgRNA 磷酸化后與pCas9 質粒連接，轉化后挑單克隆進行PCR 鑒定，將鑒定正確的pCas9-sgRNA(adeG) 質粒分別命名為pCas9-sgRNA1(adeG)、pCas9-sgRNA2(adeG) 和pCas9-sgRNA3(adeG)。結果如圖6 所示。

圖6 pCas9-sgRNA（adeG）質粒構建Fig.6 Construction of pCas9-sgRNA（adeG）plasmid

2.5 基于CRISPR/Cas9系統的adeG基因編輯效率藥敏測定

對pCas9-sgRNA1(adeG)、pCas9-sgRNA2(adeG)和pCas9-sgRNA3(adeG)進行藥物敏感性篩查，結果如圖7 所示（藥敏變化見表4）。在對哌拉西林、替卡西林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦3 種紙片進行驗證時發現，在pCas9-sgRNA1(adeG)質粒作用下，adeG-E.coli 對于哌拉西林/他唑巴坦（圖7-A 中箭頭標注）的耐藥性得到了逆轉，對妥布霉素、四環素、多西環素、米諾環素的耐藥性（圖7-B、表5）也有不同程度的逆轉。另外pCas9-sgRNA2(adeG)和pCas9-sgRNA3(adeG)使adeG-E.coli 對哌拉西林/他唑巴坦由耐藥恢復到了中介；而pCas9-sgRNA2(adeG)和pCas9-sgRNA3(adeG)重組質粒對其他藥物的耐藥性逆轉效果并不顯著（未展示）。通過PCR 驗證adeG-E.coli 中adeG 基因結果（圖8）表明，pCas9-sgRNA(adeG)質粒不能完全降解adeG。

圖7 pCas9-sgRNA（adeG）對部分藥敏紙片結果Fig.7 Results of pCas9-sgRNA（adeG）on some drug sensitivity paper slides

圖8 pCas9-sgRNA（adeG）質粒靶向adeG 基因型鑒定Fig.8 Identification of pCas9-sgRNA（adeG）plasmid targeted adeG gene

表4 pCas9-sgRNA 在哌拉西林/他唑巴坦中的藥敏變化（與adeG-E.coli 相比）Table 4 Drug sensitivity changes of pCas9-sgRNA in piperacillin/tazobactam（compared to adeG-E.coli）

表5 pCas9-sgRNA1（adeG）的部分藥敏變化（與adeGE.coli 相比）Table 5 Partial drug sensitivity changes of pCas9-sgRNA1（adeG）（compared to adeG-E.coli）

3 討論

迄今為止，在鮑曼不動桿菌中已經發現多種類別的外排泵，如RND 外排系統［23］、MFS 外排泵［24］、MATE 家族［25］以及SMR 家族［26］。其中RND 外排系統對于鮑曼不動桿菌多重耐藥起到較為積極的作用。RND 外排系統又可分為adeABC、adeIJK［27］和adeFGH 三類［28］。adeABC 受adeRS 雙組分系統的嚴格調控［29］；adeIJK 對鮑曼不動桿菌多重耐藥作用較小，但與adeABC 具有協同作用［30］；而adeFGH 受到其上游LysR 型轉錄因子adeL 調節，過表達后會賦予細菌多重耐藥性［20,31］。鮑曼不動桿菌中adeIJK具有物種特異性，可以穩定表達，而adeABC 和adeFGH 操縱子的檢出率分別為80%和90%［20,32］。由于adeFGH 藥物外排機制報道較少，且Coyne等［31］對adeG 轉運體的跨膜拓撲結構進行了預測并證實其具有RND 蛋白的典型特征。因此在本研究中將來自多重耐藥鮑曼不動桿菌的單獨外排泵基因adeG 克隆至大腸桿菌DH5α，并觀察到了其耐藥性的轉變，這不僅表明adeG-E.coli 模式菌株構建成功，也進一步證明adeG 對于多重耐藥鮑曼不動桿菌的重要性。

pCas9 質粒中的crRNA 與tracrRNA 翻譯后形成復合物，可特異性靶向目的基因并募集Cas9 蛋白。Cas9 蛋白是一種RNA 引導的核酸內切酶，它由核酸酶（NUC）瓣和α 螺旋識別（REC）瓣組成［33］。其中NUC 瓣有3 個關鍵結構域，分別是PI 結構域、HNH 核酸酶結構域和RuvC 樣核酸酶結構域。PI 結構域與靶基因中原間隔鄰基序（PAM 序列）互補，有助于Cas9 蛋白對靶位點的識別。當Cas9 蛋白識別PAM 序列后，HNH 核酸酶結構域識別并切割與sgRNA 互補的靶鏈，RuvC 樣核酸酶結構域切割對應的非靶鏈，從而完成Cas9 對靶基因的雙鏈DNA切割，并刺激DNA 修復途徑。而REC 瓣在此過程中主要起支撐作用。因此在CRISPR/Cas9 系統靶向敲除中，sgRNA 的選擇尤為重要。通過sgRNA 設計網站對AB7 的adeG 基因序列進行分析，選擇靶位點位于基因中上游，脫靶率低，預測效率高，且GC 含量處于40%-80%之間的最佳序列［22］。經網站預測及初步篩選獲得了85 條sgRNA 序列，根據sgRNA 的設計原則又最終確定了3 條。實驗結果證明攜帶特異性sgRNA 的pCas9 質粒可以對adeG 帶來的耐藥性進行一定程度的抑制，PCR 結果驗證了pCas9-sgRNA(adeG)重組質粒對adeG 的不完全降解。其中pCas9-sgRNA1(adeG)的靶向效率較好，證明通過CRISPR/Cas9 系統敲除細菌耐藥基因具有可行性，但要增強敲除效果還需要進一步優化才能與文獻報道一致［34-35］。在本實驗中，僅pCas9-sgRNA1(adeG)重組質粒對adeG-E.coli 帶來的耐藥性具有防治效果，證明在sgRNA 的設計上還可以再進行優化，尤其是降低sgRNA 在識別過程中的脫靶率從而增加編輯效率［36］。而在sgRNA 的5'末端添加兩個鳥嘌呤核苷酸［37］，或者改變sgRNA 與Cas9 的濃度比例［38］也被認為是增強編輯效率的關鍵。另外，當靶基因存在于細菌基因組中，細菌必須基于同源重組進行修復，換言之，只有基因組被修復的細菌在編輯后才能存活。而本研究構建了基于T-adeG 質粒表達的RND 外排系統模式菌株，避免了由CRISPR/Cas9 系統切割導致菌株死亡從而無法反選編輯成功菌株的問題，同時可以進一步探究CRISPR/Cas9 系統對靶基因表達的抑制能力［39］。但這同時也為CRISPR/Cas9 系統編輯效率帶來一些不利因素，如在沒有抗生素選擇的情況下，質粒會對宿主產生適應性成本［40］，可能造成質粒在宿主自然傳代下的丟失。或是由于pCas9 質粒與T 載體相比在遺傳穩定性、拷貝數差異［41］等影響下帶來的競爭劣勢，從而最終導致pCas9-sgRNA（adeG）重組質?；蚓庉嬓实牟町愋?。Tagliaferri 等［41］研究表明CRISPR/Cas9系統靶向攜帶blaTEM-1的pSB1A2 質粒后可以明顯逆轉其基因表型，但并不能完全消除靶基因。這可能解釋了為什么pCas9-sgRNA(adeG)重組質?？梢詫deG 帶來的部分耐藥表型進行逆轉，但沒有徹底降解adeG。

由于臨床鮑曼不動桿菌日益嚴重的耐藥性，以及原生菌株與獲得性質粒在多個時間維度上存在相互作用、生長和競爭關系［40］，使得直接應用CRISPR/Cas9 系統來防治鮑曼不動桿菌變得困難。在接下來的研究中，將對pCas9 質粒元件進行優化，使其可以真正成為防治多重耐藥性鮑曼不動桿菌的有力工具。在本研究中，建立含有鮑曼不動桿菌耐藥相關基因的模式菌株對逆轉AB 的耐藥性進行了初步探索，誠然在DH5α 工程菌中無法很好地還原鮑曼不動桿菌的復雜耐藥環境，但這種方式為進一步高效抑制鮑曼不動桿菌的耐藥性提供了實驗基礎，從而幫助更快實現利用CRISPR/Cas9 系統對強耐藥鮑曼不動桿菌的有效防控。

4 結論

本研究通過構建鮑曼不動桿菌adeG 耐藥基因模型，對CRISPR/Cas9 系統特異性敲除耐藥基因進行探索。結果顯示鮑曼不動桿菌耐藥基因adeG 使DH5α 產生了對哌拉西林、替卡西林/克拉維酸和哌拉西林/他唑巴坦的耐藥性，用特異性pCas9-sgRNA（adeG）重組質粒靶向治療后，部分耐藥性發生了改變，并恢復到了敏感。