利用CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建Quaking 敲除的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞株

高登科 馬白榮 郭怡瑩 劉薇 劉田 靳亞平 江舟陳華濤

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，楊凌 712100；3.四川大學(xué)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)時(shí)間生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610000）

Quaking（QKI）蛋白屬于進(jìn)化保守的含有核不均一核糖核酸蛋白K 同源結(jié)構(gòu)域（K homology，KH）的RNA 結(jié)合蛋白STAR（single transduction and activation of RNA，STAR）家族成員，因Quaking 基因缺失導(dǎo)致中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)神經(jīng)髓鞘發(fā)育障礙的現(xiàn)象，小鼠機(jī)體表現(xiàn)為顫抖，故將引起此現(xiàn)象的基因命名為Quaking［1］。QKI 的3 種亞型QKI-5、QKI-6 和QKI-7 擁有相同的KH 結(jié)構(gòu)域，主要區(qū)別在于C 端的30 個(gè)氨基酸不同［2］。QKI-5 中包含一個(gè)核定位信號(hào)，可以在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間穿梭，主要在細(xì)胞核中表達(dá)；QKI-6 可以在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，而QKI-7 主要分布在細(xì)胞質(zhì)中［3］。

QKI 是影響RNA 調(diào)控的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其能與RNA 特異性結(jié)合，在pre-mRNA 的剪接、microRNA的調(diào)控與環(huán)狀RNA 的形成等方面發(fā)揮重要作用［4］。QKI 可作為一種腫瘤抑制因子抑制腫瘤的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，QKI-5 在良性前列腺增生組織中高表達(dá)，而在癌組織中低表達(dá)，并且QKI-5 可有效抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖［5］。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中QKI-5 的高表達(dá)可抑制癌細(xì)胞增殖［6］。此外，特異性過表達(dá)QKI-5 能抑制卵巢癌細(xì)胞A2780的增殖，并促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡［7］。在免疫調(diào)控中，QKI 是參與單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞分化和功能調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子。QKI 通過調(diào)節(jié)Ahr/STAT1-NF-κB 途徑，在抑制先天免疫反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用［8］。在神經(jīng)系統(tǒng)中，QKI-5、QKI-6 與QKI-7 蛋白在髓鞘形成細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中均有顯著表達(dá)；QKI 作為髓鞘形成的調(diào)節(jié)因子，是髓鞘形成的關(guān)鍵蛋白［9］。QKI 作為一種RNA 結(jié)合蛋白，是少突膠質(zhì)細(xì)胞中核mRNA 輸出的調(diào)節(jié)因子，并參與了髓鞘形成［10］。QKI 在血管發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，Quaking 突變導(dǎo)致的血管缺陷會(huì)引起胚胎死亡［11］。QKI 也是血管生成的正調(diào)節(jié)因子，其細(xì)胞作用是調(diào)節(jié)內(nèi)臟的內(nèi)胚層功能，包括維甲酸的局部合成以及隨后控制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、基質(zhì)產(chǎn)生和內(nèi)臟內(nèi)胚層存活，這對(duì)于血管重塑至關(guān)重要［12］。有研究證據(jù)表明，QKI 可能通過參與維持肌衛(wèi)星細(xì)胞的儲(chǔ)備，促進(jìn)肌肉細(xì)胞進(jìn)入靜息期，抑制小鼠成肌細(xì)胞的分化［13］。綜上所述，Quaking 基因編碼的RNA 結(jié)合蛋白QKI 在癌癥發(fā)生、免疫調(diào)控、髓鞘形成、血管生成和肌肉發(fā)育等生理過程中發(fā)揮重要作用，然而QKI 在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（NIH3T3）中的生物學(xué)功能目前尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 材料

限制性核酸內(nèi)切酶FastDigest Esp3I、TurboFect轉(zhuǎn)染試劑、Donkey anti-Rabbit IgG（H+L）Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody（Alexa Fluor 488）均購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher 公司；T4 DNA Ligase 購(gòu)于日本TaKaRa 公司；DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；HEK293T 細(xì)胞和NIH3T3 細(xì)胞購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone 公司；胰蛋白酶消化液、嘌呤霉素、Polybrene、RIPA 裂解液、DAPI 染色液均購(gòu)于碧云天公司；pcDNA3.1-Quaking 過表達(dá)質(zhì)粒為實(shí)驗(yàn)室保存［14］；LentiCRISPRv2 載體、輔助質(zhì) 粒psPAX2 和pMD2.G 質(zhì)粒由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院蕭颯教授饋贈(zèng)；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；脫脂奶粉購(gòu)于美國(guó)BD 公司；HRP 共軛山羊抗兔抗體購(gòu)于中國(guó)中杉金橋公司；兔抗GAPDH 抗體購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔抗QKI 抗體購(gòu)于博士德生物工程有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自北京迪寧生物科技有限公司；Trition X-100、BSA 試劑均購(gòu)于Sigma 公司；CCK8 試劑購(gòu)于米鼠生物公司。

1.2 方法

1.2.1 設(shè)計(jì)并合成sgRNA 在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取小鼠Quaking 基因的基因組序列信息；利用CRISPR在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站（http://crispor.tefor.net/）提交Quaking基因的外顯子核苷酸序列，選取系統(tǒng)自動(dòng)生成的評(píng)分最優(yōu)的2 組sgRNA，分別命名為sgRNA1、sgRNA2；選擇Cas9 質(zhì)粒中所需的慢病毒載體LentiCRISPRv2，生成含有Esp3I 酶切位點(diǎn)的sgRNA序列［15］，交由西安擎科澤西生物有限公司合成，設(shè)計(jì)的序列信息見表1。

表1 序列信息Table 1 Sequences information

1.2.2 構(gòu)建sgRNA 敲除載體 將互補(bǔ)的sgRNA寡核苷酸單鏈退火形成雙鏈。使用限制性核酸內(nèi)切酶Esp3I 酶切慢病毒載體LentiCRISPRv2，以獲得線性化載體。sgRNA 退火產(chǎn)物與線性化載體LentiCRISPRv2 使用T4 DNA Ligase 連接過夜。隨后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，取適量培養(yǎng)后的轉(zhuǎn)化體系菌液涂布平板觀察菌落生長(zhǎng)狀況，挑取單克隆菌落培養(yǎng)16 h。培養(yǎng)后的菌液提取質(zhì)粒并送西安擎科澤西生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為L(zhǎng)entiCRISPRv2-sgRNA1、LentiCRISPRv2-sgRNA2。

1.2.3 篩選敲除效率高的重組慢病毒質(zhì)粒 HEK-293T 細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%時(shí)，利用TurboFect轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染4 組，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒分別為：pcDNA3.1-Quaking；pcDNA3.1-Quaking+LentiCRISPRv2；pcDNA3.1-Quaking+LentiCRISPRv2-sgRNA1；pcDNA3.1-Quaking+LentiCRISPRv2-sgRNA2。在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h 后收集細(xì)胞樣品，Western blot 檢測(cè)QKI 蛋白的敲除效率，以篩選獲得敲除效率高的重組慢病毒質(zhì)粒。

1.2.4 嘌呤霉素最低致死濃度篩選 NIH3T3 細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，選擇生長(zhǎng)狀況良好的NIH3T3 細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后加入等體積含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基終止消化，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至5 × 104個(gè)/mL，96 孔板中每孔加100 μL 細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后加入0-5 μg/mL 不同梯度濃度的嘌呤霉素，每0.5 μg/mL 設(shè)置一個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度設(shè)置6 個(gè)重復(fù)。觀察細(xì)胞狀態(tài)，將加藥后48 h 內(nèi)細(xì)胞全部死亡的最小濃度作為NIH3T3 細(xì)胞的嘌呤霉素最低致死濃度，此濃度用于后續(xù)陽性克隆細(xì)胞株的篩選。

1.2.5 慢病毒包裝及轉(zhuǎn)導(dǎo)NIH3T3 細(xì)胞 將HEK293T 細(xì)胞鋪板于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度為70%-80%時(shí)，把篩選獲得的敲除效率高的重組慢病毒質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G 按照一定比例（2∶1∶1）共轉(zhuǎn)染至HEK293T 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染16 h 后，將培養(yǎng)液更換為新的含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后收集細(xì)胞上清液，3 000 r/min 離心5 min 取上清即為病毒原液，0.45 μm 濾器過濾、分裝后置于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｌ崆? d 鋪好狀態(tài)良好的NIH3T3 細(xì)胞，將收集的慢病毒液與1 mL 無血清DMEM 高糖培養(yǎng)基混勻，并加入終濃度為10 μg/mL 的Polybrene 以提高感染效率。棄去舊培養(yǎng)基，用PBS 清洗一遍后加入毒液，感染48 h 后加入嘌呤霉素進(jìn)行抗性單克隆細(xì)胞的篩選，將單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，收取細(xì)胞樣品提取基因組DNA，使用表1 中的Target 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后測(cè)序鑒定并比對(duì)結(jié)果，隨后采用Western blot 對(duì)單克隆細(xì)胞株中QKI 蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 Western blot 檢測(cè) 將收集到的細(xì)胞樣品按照RIPA 裂解液操作說明處理得到蛋白樣品，使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。上樣等質(zhì)量的變性后的蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，使用10%的脫脂奶粉封閉2 h。封閉完成后，TBST 洗膜3 次/5 min，分別用兔抗QKI 抗體（1∶1 000 稀釋）和兔抗GAPDH 抗體（1∶5 000 稀釋）4℃搖床孵育過夜，TBST 洗膜3 次/5 min，再加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶5 000 稀釋）中，室溫?fù)u床孵育2 h，TBST 洗膜3 次/5 min，之后將膜放入ECL 化學(xué)發(fā)光液中作用2 min，凝膠成像系統(tǒng)曝光并分析結(jié)果。

1.2.7 免疫熒光染色觀察QKI 蛋白的表達(dá)分布 使用4%多聚甲醛固定Quaking 基因敲除NIH3T3 細(xì)胞樣品及對(duì)照組細(xì)胞樣品，PBS 清洗后再用0.1%Trition X-100 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透處理；處理后的細(xì)胞加入1% BSA 進(jìn)行封閉，隨后使用QKI 抗體（1∶100稀釋）進(jìn)行過夜孵育，次日PBS 清洗后再加入綠色熒光標(biāo)記的Donkey anti-Rabbit IgG（H+L）Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody（Alexa Fluor 488，1∶1 000 稀釋）孵育。孵育結(jié)束后，使用DAPI 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染核，PBS 清洗后封片并在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

做好雨污分流，有利于減少污水產(chǎn)生量，降低運(yùn)營(yíng)成本，有利于降低垃圾堆體含水率，減少臭氣產(chǎn)生量，提高堆體穩(wěn)定性，是實(shí)現(xiàn)生活垃圾衛(wèi)生填埋的關(guān)鍵所在。

1.2.8 細(xì)胞增殖試驗(yàn) 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Quaking基因敲除NIH3T3 細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞分別以2 × 103個(gè)/孔的密度接種于96 孔板，分別于第1、2、3、4、5、6、7 天加入10 μL CCK8 試劑，繼續(xù)在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h 后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處的吸光度值，每組6 個(gè)復(fù)孔，統(tǒng)計(jì)結(jié)果并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。使用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，兩組間樣本采用雙因素方差分析，*P ＜ 0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，**P ＜ 0.01表示差異顯著，***P ＜ 0.001 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 Quaking基因sgRNA靶點(diǎn)序列的設(shè)計(jì)

將NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取的小鼠Quaking 基因的基因組序列導(dǎo)入SnapGene 軟件繪制基因序列圖譜，利用CRISPR 在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站分別在Quaking 基因的第1、2 外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)sgRNA。選擇第1、2 外顯子分別作為兩個(gè)敲除位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)sgRNA2 和sgRNA1（圖1）。

圖1 小鼠Quaking 基因的sgRNA 設(shè)計(jì)圖Fig.1 sgRNA design of Quaking gene in mice

2.2 重組質(zhì)粒LentiCRISPRv2-sgRNA的構(gòu)建與鑒定

使用限制性核酸內(nèi)切酶Esp3I 酶切線性化LentiCRISPRv2 空載體，由于LentiCRISPRv2 載體上存在2 個(gè)Esp3I 酶切位點(diǎn)，故Esp3I 酶切后可獲得兩個(gè)條帶。如圖2-A 所示，Esp3I 酶切后成功獲得與預(yù)期大小相符的兩個(gè)條帶（12 984 bp 和1 899 bp）。隨后，利用T4 DNA Ligase 將兩對(duì)sgRNA 退火產(chǎn)物分別與酶切線性化的LentiCRISPRv2 空載體連接構(gòu)成LentiCRISPRv2-sgRNA1 和LentiCRISPRv2-sgRNA2重組質(zhì)粒。將兩個(gè)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示靶向Quaking 基因的sgRNA1 和sgRNA2 已經(jīng)成功插入到LentiCRISPRv2 載體（圖2-B），上述結(jié)果表明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒LentiCRISPRv2-sgRNA1 和LentiCRISPRv2-sgRNA2。

圖2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定結(jié)果Fig.2 Construction and identification of recombinant plasmids

2.3 篩選QKI蛋白敲除效率高的重組質(zhì)粒

復(fù)蘇并傳代培養(yǎng)HEK293T 細(xì)胞，將重組質(zhì)粒LentiCRISPRv2-sgRNA1 和LentiCRISPRv2-sgRNA2分別與pcDNA3.1-Quaking 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，并以未轉(zhuǎn)染的空白細(xì)胞作為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后48 h 收取細(xì)胞蛋白樣品，用于Western blot檢測(cè)，以篩選敲除效率高的重組質(zhì)粒。如圖3 所示，第4 泳道的LentiCRISPRv2-sgRNA1 的敲除效率高于第5 泳道的LentiCRISPRv2-sgRNA2，故選擇LentiCRISPRv2-sgRNA1 重組質(zhì)粒用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖3 Western blot 篩選QKI 蛋白敲除效率高的重組質(zhì)粒Fig.3 Screening of recombinant plasmids with high QKI protein knockout efficiency via Western blot

2.4 NIH3T3細(xì)胞嘌呤霉素最低致死濃度篩選

為了獲得慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后經(jīng)藥物篩選的陽性細(xì)胞，設(shè)置不同梯度濃度的嘌呤霉素，將它們分別加入狀態(tài)良好的NIH3T3 細(xì)胞中，觀察細(xì)胞的存活狀態(tài)并進(jìn)行記錄，最終獲得48 h 內(nèi)使NIH3T3 細(xì)胞全部死亡的最低嘌呤濃度為1.5 μg/mL，后續(xù)使用該濃度進(jìn)行單細(xì)胞克隆的篩選。

2.5 Quaking基因敲除的NIH3T3細(xì)胞株的建立

將敲除效率高的LentiCRISPRv2-sgRNA1 重組質(zhì)粒與輔助包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G 共轉(zhuǎn)染至HEK293T 細(xì)胞中進(jìn)行慢病毒包裝。使用包裝好的慢病毒毒液感染NIH3T3 細(xì)胞，感染48 h 后加入濃度為1.5 μg/mL 的嘌呤霉素以篩選陽性細(xì)胞。將篩選后的陽性單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取單克隆細(xì)胞的基因組DNA 并PCR 擴(kuò)增靶位點(diǎn)附近序列。測(cè)序結(jié)果如圖4 所示，與野生型細(xì)胞株相比，單克隆細(xì)胞株在sgRNA 序列中缺失了7 個(gè)堿基造成移碼突變，表明成功建立Quaking 基因敲除的NIH3T3 細(xì)胞株。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，Quaking 基因敲除的NIH3T3 細(xì)胞與正常對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)無差異（圖5）。

圖4 Quaking 敲除細(xì)胞株與野生型細(xì)胞株測(cè)序結(jié)果比對(duì)示意圖Fig.4 Schematic diagram of comparison between sequencing results of Quaking knockout cell lines and wildtype cell lines

圖5 NIH3T3 細(xì)胞形態(tài)圖Fig.5 Morphology of NIH3T3 cells

2.6 Western blot檢測(cè)Quaking基因敲除細(xì)胞株中QKI蛋白的表達(dá)情況

使用Western blot 檢測(cè)小鼠Quaking 基因敲除細(xì)胞株中QKI 蛋白的表達(dá)，結(jié)果如圖6 所示，與對(duì)照組相比，Quaking 基因敲除細(xì)胞株中未檢測(cè)到QKI蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步從蛋白水平證明Quaking 基因敲除的NIH3T3 細(xì)胞株構(gòu)建成功。

圖6 Western blot 檢測(cè)QKI 蛋白表達(dá)Fig.6 Detection of QKI protein expression via Western blot

2.7 免疫熒光染色觀察Quaking基因敲除細(xì)胞株中QKI蛋白的表達(dá)分布

利用免疫熒光染色技術(shù)觀察Quaking 基因敲除NIH3T3 細(xì)胞株中QKI 蛋白的表達(dá)分布，結(jié)果如圖7所示，對(duì)照組NIH3T3 細(xì)胞中QKI 蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞核中，而Quaking 敲除的NIH3T3 細(xì)胞中未見綠色熒光，即無QKI 蛋白的表達(dá)，這些結(jié)果進(jìn)一步證明Quaking 基因敲除的NIH3T3 細(xì)胞株構(gòu)建成功。

圖7 免疫熒光染色檢測(cè)QKI 蛋白表達(dá)Fig.7 QKI protein expression detected by immunofluorescence staining

2.8 Quaking敲除抑制NIH3T3細(xì)胞的增殖能力

為了探討QKI 蛋白的敲除對(duì)NIH3T3 細(xì)胞增殖的影響，采用CCK8 對(duì)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Quaking 基因敲除的NIH3T3 細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞的增殖活力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖8 所示，Quaking 基因敲除細(xì)胞株的增殖活力較對(duì)照組細(xì)胞極顯著降低（P ＜ 0.001），但在第7 天時(shí)兩組細(xì)胞的增殖活力趨于一致。

圖8 Quaking 基因敲除對(duì)NIH3T3 細(xì)胞增殖能力的影響Fig.8 Effects of Quaking gene knockout on the proliferation ability of NIH3T3 cells

3 討論

CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)作為一種可在全基因組范圍進(jìn)行高通量篩選的新型基因編輯技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、成本低、高效性和低脫靶率的優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的精準(zhǔn)修飾［16］。自2013 年CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在人類細(xì)胞中得到驗(yàn)證以來［17-19］，sgRNA 引導(dǎo)的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)已應(yīng)用于多種細(xì)胞系和生物體的DNA 和RNA 操作中，并在疾病免疫機(jī)理、藥物靶點(diǎn)篩選和動(dòng)物遺傳育種等領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用［17,20-21］。在可用于精確基因治療的工具中，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)與鋅指核酸酶（zincfinger nucleases，ZFNs）或轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）等傳統(tǒng)的基因編輯工具相比更簡(jiǎn)單、更省時(shí)，因?yàn)樵撓到y(tǒng)只需要一個(gè)Cas9 核酸內(nèi)切酶和一個(gè)短的sgRNA［22］。慢病毒是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，它可將大量的病毒互補(bǔ)DNA 整合到宿主細(xì)胞的基因組中，并且可以有效地感染分裂期及非分裂期細(xì)胞，是最有效的基因傳遞方法之一［23-24］。因此，本研究選擇同時(shí)包含有CRISPR/Cas9 系統(tǒng)和慢病毒載體篩選系統(tǒng)的LentiCRISPRv2 質(zhì)粒進(jìn)行敲除細(xì)胞株的構(gòu)建。

盡管CRISPR/Cas9 技術(shù)日益成熟，但其安全性和效率仍然是需要重點(diǎn)考慮的問題［25］。sgRNA 往往具有相對(duì)較高的錯(cuò)配耐受性，Cas9 通常會(huì)切割與靶基因序列相似的脫靶位點(diǎn)，這就造成了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的實(shí)際應(yīng)用一直受到脫靶效應(yīng)的影響［26-27］。為了最大程度降低脫靶效應(yīng)的影響，同時(shí)提高靶基因sgRNA 的特異性，本研究利用CRISPR在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站（http://crispor.tefor.net/）設(shè)計(jì)獲得了兩個(gè)評(píng)分最優(yōu)的分別靶向Quaking 基因第1、2外顯子區(qū)域的sgRNA。為進(jìn)一步篩選得到敲除效率更高的sgRNA，本研究首先在更容易轉(zhuǎn)染的HEK293T 細(xì)胞系中進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)。在HEK293T 細(xì)胞中外源性過表達(dá)小鼠QKI 蛋白的同時(shí)分別共轉(zhuǎn)染LentiCRISPRv2-sgRNA1 和LentiCRISPRv2-sgRNA2重組質(zhì)粒，Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LentiCRISPRv2-sgRNA1 組較LentiCRISPRv2-sgRNA2 組QKI 蛋白的敲除效率更高。隨后使用LentiCRISPRv2-sgRNA1 重組質(zhì)粒進(jìn)行慢病毒包裝，感染NIH3T3 細(xì)胞后，經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得陽性單克隆細(xì)胞，對(duì)擴(kuò)大培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行Western blot、免疫熒光染色和測(cè)序鑒定，結(jié)果均證明成功構(gòu)建了小鼠Quaking 基因敲除NIH3T3 細(xì)胞模型。

RNA 結(jié)合蛋白QKI 在心臟、肺臟、腦、視網(wǎng)膜、前列腺、睪丸等多種器官中廣泛表達(dá)，在調(diào)控RNA形成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中發(fā)揮重要功能［4］。QKI 與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，其能有效抑制前列腺癌和肺癌細(xì)胞的增殖［5,28］，過表達(dá)QKI 還可以抑制乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞的增殖［6-7］。另有研究報(bào)道QKI 可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞、睪丸支持細(xì)胞的增殖［12,29］，過表達(dá)QKI 也能促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖［30］。本研究對(duì)Quaking 敲除的NIH3T3 細(xì)胞株及對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行了CCK8 實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示Quaking 基因的敲除抑制了NIH3T3 細(xì)胞的增殖能力，即QKI 的存在可以促進(jìn)NIH3T3 細(xì)胞的增殖，這與前人研究的正常細(xì)胞中所觀察到現(xiàn)象相吻合，但QKI 調(diào)控NIH3T3 細(xì)胞增殖的具體機(jī)制仍有待于進(jìn)一步深入研究。除此之外，本研究中所獲得的敲除細(xì)胞株還可用于研究Quaking 基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。另外，可通過比較正常細(xì)胞和Quaking 基因敲除細(xì)胞的差異，來識(shí)別潛在的疾病相關(guān)基因，從而有助于研究疾病的發(fā)病機(jī)制和治療方法。Quaking 基因敲除細(xì)胞株還可用于腫瘤研究，了解Quaking 基因敲除對(duì)腫瘤發(fā)生和發(fā)展的影響，從而為癌癥治療提供線索。總之，Quaking 基因敲除NIH3T3 細(xì)胞株的構(gòu)建，為進(jìn)一步闡明Quaking對(duì)NIH3T3 細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制及其他功能研究提供了體外細(xì)胞模型。

4 結(jié)論

本研究利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)成功構(gòu)建了Quaking 基因敲除的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞株，并通過細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明，Quaking 基因敲除顯著抑制了NIH3T3 細(xì)胞的增殖能力。