水稻熱激轉錄因子HsfA2b 調控非生物脅迫抗性的功能分析

鄒修為 岳佳妮 李志宇 戴良英 李魏

（1.湖南農業大學植物保護學院,長沙 410128；2.湖南省臨湘市云湖街道農業綜合服務中心,岳陽 414300）

植物在生長過程中，常會遭受各種非生物脅迫（如高溫、低溫、干旱、水澇、高鹽、日灼等）而嚴重影響植物的生長發育，甚至可導致植物死亡，因此，非生物脅迫是農作物產量和品質的重要制約因素［1］。然而，植物在長期進化過程中形成了一系列應激反應抵抗各種非生物脅迫。其中，熱激轉錄因子（heat shock transcription factors,HSFs）便是植物熱應激響應的關鍵調節因子［2］。

HSFs 在真核生物中具有結構和功能上的保守性。HSFs 包含N 端的DNA 結合域（DNA binding domain,DBD）、寡聚化結構域（oligomerization domain,OD）、核定位信號（nuclear localization signal,NLS）以及C 端核輸出信號（nuclear export signal,NES）和C 端轉錄激活結構域（C-terminal transcriptional activation domain,CTAD）5 個結構域，其中，DBD 是HSFs 中結構和功能最保守的結構域［3］。根據序列相似性和OD 結構的不同，植物HSFs 家族可分為HSFA、HSFB 和HSFC 三類［4-5］，A 類HSFs 主要負責熱激基因的表達調控，B 類和C 類因缺少短肽AHA（aromatics,hydrophobic and acidic amino acid residues）基元而不具備激活功能［6］。此外，HSFs位于植物脅迫響應鏈的末端，可以特異性識別并結合脅迫響應相關基因以調控其表達，從而激活體內的防御系統，提高植物對脅迫的抗性［7-9］。

植物HSFs 參與了包括高溫、高鹽、干旱和氧化等多種逆境脅迫響應［10-12］。如HSFA1 作為番茄耐熱過程中必不可少的元件，是高溫誘導基因表達的主要調控者，在高溫脅迫觸發、維持和恢復3 個階段中起顯著調控作用［13］。擬南芥hsfA2 突變體相比野生型對熱激更敏感，說明擬南芥HsfA2 能夠增強擬南芥耐熱性［14］。相似地，過表達TaHsfA6b 的小麥植株耐熱性增強［15］；在煙草中過表達向日葵HaHSFA9 可增強熱休克蛋白（HSPs）的積累，在種子發芽早期耐熱性中發揮重要作用［16］。除此之外，低溫條件下，擬南芥AtHsfA1d 能提高核糖體蛋白基因的表達，促進下胚軸的伸長［17］，而擬南芥AtHsfC1 也參與調控低溫脅迫［18］。擬南芥AtHsfA4a可增強植株對鹽和氧化脅迫的耐受性，被敲除后植株對鹽高度敏感［19］。擬南芥過表達AtHsfA6a 植株在萌發期和苗期對ABA 高度敏感，而耐鹽和耐干旱脅迫的能力則顯著增強［20］。豌豆中過表達擬南芥AtHsfA1d 可降低熱脅迫下產生的活性氧（reactive oxygen species,ROS）含量，并顯著增強其抗氧化酶活性，以減少熱脅迫帶來的損害［21］。

迄今為止，水稻中HSFs 的研究主要以高溫脅迫為主。本文前期研究工作將高溫脅迫后的水稻進行轉錄組分析發現，熱激轉錄因子OsHsfA2b 被高溫脅迫極顯著誘導。而OsHsfA2b 作為A 類HSF，在水稻抗逆性的功能研究上尚未被明確報道，且其作用機制以及表達調控網絡也尚不清楚。

本研究構建了OsHsfA2b 過表達和RNAi 轉基因水稻，并對其進行了非生物脅迫抗性分析，探究OsHsfA2b 調控水稻對非生物脅迫抗性的途徑，為培育水稻抗逆新品種提供了優異基因資源和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為粳稻品種日本晴（NPB），以NPB為遺傳背景的OsHsfA2b 過表達植株（OsHsfA2b-OX，T3代）及OsHsfA2b-RNAi 轉基因T3代純合株系。

1.2 方法

1.2.1 水稻材料種植 將NPB 種子、OsHsfA2b-OX轉基因種子和OsHsfA2b-RNAi 轉基因種子分別播于1/2 MS（Murashige &Skong）培養基、含0.1%潮霉素的1/2 MS 培養基和含0.2% Basta 的1/2 MS 培養基中，置于28℃、14 h 光照/10 h 黑暗的溫室中培養7-10 d，然后移栽到營養土中，作為后續試驗材料。

1.2.2 高溫、低溫處理 將28℃條件下培養至3 葉期的水稻幼苗置于42℃、相對濕度75%、14 h 光照/10 h 黑暗的溫室中，分別處理0、1、3、8、12 和24 h后取樣，液氮速凍后于-80℃保存備用。低溫處理為4℃，處理時間為0、3、6、12 和24 h，其余條件不變。

1.2.3 DAB 染色 將處理后的水稻葉片浸沒在含有1 mg/mL DAB（3,3'-二氨基聯苯胺）溶液中，室溫避光過夜孵育后，再置于脫色液（無水乙醇∶乙酸∶甘油=3∶1∶1）中96℃水浴加熱20 min，然后95%酒精浸泡48 h，直到所有葉綠素都被去除，拍照記錄染色結果。

1.2.4 模擬干旱處理 在Yoshida 營養液中添加終濃度為20% PEG 6000，模擬干旱處理，將2-3 周齡的水稻幼苗置于其中，分別處理0、1、3、8、12 和24 h 后取樣，液氮速凍后于-80℃保存備用。

1.2.5 高鹽處理 種子發芽處理：將消毒后的水稻種子播于含150 mmol/L NaCl 的1/2 MS 培養基上，溫室中培養5 d，統計不同材料的發芽情況。

苗期處理：將3 周齡的水稻幼苗置于Yoshida營養液（添加終濃度為250 mmol/L 的NaCl）中，分別處理0、1、3、8 和24 h 后取樣，液氮速凍后于-80℃保存備用。

1.2.6 RT-qPCR 分析 使用Trizol 試劑盒提取水稻葉片總RNA。利用RNA 反轉錄試劑盒去除基因組DNA 并反轉錄合成cDNA，以水稻UBQ 為內參對照，進行qPCR 分析。反應條件為95℃ 10 min；95℃ 10 s，60℃ 35 s，68℃ 15 min，40 個循環；68℃ 6 min。所用引物列于表1。

表1 實時熒光定量PCR 引物Table 1 Primers for RT-qPCR

2 結果

2.1 OsHsfA2b的克隆及其編碼蛋白的結構分析

以NPB 水 稻cDNA 為模 板，擴增OsHsfA2b 全長序列，獲得OsHsfA2b 的CDS（圖1），CDS 長度為1 119 bp，編碼372 個氨基酸。

圖1 OsHsfA2b 的CDS 擴增電泳圖Fig.1 Electropherogram of OsHsfA2b gene CDS amplification

利用NCBI 軟件進行OsHsfA2b 蛋白結構域預測（圖2），OsHsfA2b 在第49-142 位氨基酸形成了HSFs 中結構和功能高度保守的DNA 結合結構域（DNA binding domain,DBD）。此外，該蛋白還在第173-223 位氨基酸為寡聚化結構域（oligomerization domain,OD），第238-253 位氨基酸為核定位信號（nuclear localization signal,NLS），第328-337 位 氨基酸為C 端核輸出信號（C-terminal transcriptional activation domain,CTAD）和第356-363 位氨基酸為C 端轉錄激活結構域（nuclear export signal,NES）。

圖2 OsHsfA2b 的蛋白結構Fig.2 Protein structure of OsHsfA2b

2.2 OsHsfA2b過表達和RNAi植株的鑒定

運用RT-qPCR 對OsHsfA2b-OX 和RNAi 轉基 因水稻植株T3代轉基因植株體內的OsHsfA2b 表達量進行檢測。結果顯示，OsHsfA2b-OX 植株中OsHsfA2b的表達量遠高于野生型（圖3-A），而OsHsfA2b-RNAi 植株中OsHsfA2b 的表達量卻顯著比野生型低（圖3-B），說明OsHsfA2b-OX 和RNAi 轉基因植株為可用于下一步研究的陽性植株。

圖3 OsHsfA2b-OX 和OsHsfA2b-RNAi 轉基因植株的鑒定Fig.3 Identification of OsHsfA2b-OX and OsHsfA2b-RNAi transgenic plants

2.3 OsHsfA2b正調控水稻對溫度脅迫的抗性

為分析OsHsfA2b 在水稻響應溫度脅迫反應中的作用，高溫處理水稻野生型NPB 植株后檢測OsHsfA2b 的表達水平發現，該基因可被高溫脅迫誘導，尤其是處理12 h 后達到高峰（圖4-A）。處理2 d 后發現，NPB 植株葉片表現嚴重卷曲，而OsHsfA2b-OX 植株葉片較為平整，相反，OsHsfA2b-RNAi 植株葉片卷曲程度超過NPB（圖4-C）。當恢復正常生長條件10 d 后，統計這3 種材料的存活率發現，OsHsfA2b-OX 植株存活率比NPB 顯著提高，而OsHsfA2b-RNAi 植株存活率遠低于二者（圖4-D）。

圖4 高溫脅迫下轉基因植株的表型和OsHsfA2b 的表達Fig.4 Phenotypes and OsHsfA2b expressions of transgenic plants under high temperature stress

在受到高溫脅迫后，植物體內的ROS 含量會大量增加，使植物經受氧化脅迫而導致損傷，因此，植物會激活體內的過氧化物酶幫助清除ROS 達到動態平衡。為了分析OsHsfA2b 對水稻抗氧化途徑是否具有調控作用，使用DAB 染色法檢測OsHsfA2b 轉基因和野生型水稻在高溫脅迫后的ROS 含量和抗氧化途徑相關基因的表達水平。結果顯示，在高溫脅迫下，OsHsfA2b-RNAi 轉基因植株比NPB 積累更多的ROS，而OsHsfA2b-OX 轉基因植株則比NPB 體內的ROS 積累量更少（圖4-F）。抗氧化途徑相關基因OsSOD 和OsCAT 的表達量在上述3 種植株內都可被高溫脅迫誘導，且高溫脅迫使OsHsfA2b-OX 轉基因植株中OsSOD 和OsCAT 的表達量比在NPB 中要顯著提高，相反，OsHsfA2b-RNAi 植株中這兩個基因的表達量在高溫脅迫處理后比NPB 表達量要低（圖4-B,E）。結果表明，OsHsfA2b 可以通過抗氧化途徑正調控水稻對高溫脅迫的抗性。

此外，將NPB 置于4℃低溫培養箱中，利用RT-qPCR 檢測NPB 中不同處理時間點OsHsfA2b 轉錄水平變化。結果顯示，低溫條件也能誘導OsHsfA2b的表達量上調（圖5-A）。OsHsfA2b-OX 植株在低溫處理2 d 后卷曲，受損的葉片明顯少于NPB 與OsHsfA2b-RNAi 植株（圖5-B）。當恢復到正常生長條件7 d 后，統計這些苗存活率發現，OsHsfA2b-OX植株存活率最高，OsHsfA2b-RNAi 植株存活率最低（圖5-C）。同樣地，在低溫處理后，OsHsfA2b-OX植株中OsSOD 和OsCAT 的表達量顯著高于NPB，而OsHsfA2b-RNAi 中這兩個基因的表達量總體上比NPB 要低（圖5-D-E）。由此可見，OsHsfA2b 可能通過抗氧化通路降低水稻對低溫脅迫的敏感性。

圖5 低溫脅迫下轉基因植株的表型和OsHsfA2b 的表達Fig.5 Phenotypes and OsHsfA2b expressions of transgenic plants under low temperature stress

2.4 OsHsfA2b正調控水稻對干旱脅迫的抗性

為分析OsHsfA2b 在水稻響應干旱脅迫反應中的作用，用含20% PEG6000 的水稻營養液模擬干旱處理野生型水稻NPB 后，利用RT-qPCR 檢測OsHsfA2b 的轉錄水平。結果顯示，OsHsfA2b 可被干旱誘導，在3 h 時表達量達到最高峰，后逐漸降低（圖6-A）。此外，干旱處理1 d 后發現NPB 幼苗大部分出現葉片卷曲，甚至萎蔫枯黃，OsHsfA2b-OX植株葉片則萎蔫不明顯，而OsHsfA2b-RNAi 幼苗葉片則比NPB 卷曲萎蔫更嚴重，甚至干枯（圖6-B）。結束處理恢復正常生長條件10 d 后，統計上述幼苗存活率，OsHsfA2b-OX 幼苗存活率高于80%，NPB幼苗存活率接近40%，而OsHsfA2b-RNAi 幼苗不足15%（圖6-C）。以上結果說明，干旱處理能誘導OsHsfA2b 的表達，OsHsfA2b-OX 植株的抗旱性提高，相反，OsHsfA2b-RNAi 植株抗旱性降低。同時，在干旱處理后，OsHsfA2b-OX 植株中OsSOD 和OsCAT 的表達量較NPB 顯著增高而OsHsfA2b-RNAi 植株中這兩個基因的表達量總體上比NPB 降低（圖6-D-E）。進一步說明，OsHsfA2b 可能通過抗氧化途徑正調控水稻對干旱脅迫的抗性。

圖6 干旱脅迫下轉基因植株的表型和OsHsfA2b 的表達Fig.6 Phenotypes and OsHsfA2b expressions of transgenic plants under drought stress

2.5 OsHsfA2b正調控水稻對高鹽脅迫的抗性

進一步分析OsHsfA2b 在調控水稻抗高鹽脅迫方面的功能，將NPB 幼苗置于含150 mmol/L NaCl 的水稻營養液中處理發現，OsHsfA2b 的表達量在處理后24 h 內逐漸上調（圖7-A）。此外，NPB、OsHsfA2b-OX 和OsHsfA2b-RNAi 植株種子在150 mmol/L NaCl高鹽條件下萌發5 d 后，OsHsfA2b-RNAi 種芽的生長相比NPB 受到更明顯抑制，而OsHsfA2b-OX 種子萌發與生長情況均比NPB 更好（圖7-B）。在苗期進行高鹽處理2 d 后發現，NPB 植株葉片大部分出現卷曲，OsHsfA2b-OX 植株葉片僅少部分葉片的葉尖稍卷曲，而OsHsfA2b-RNAi 植株葉片相比NPB 卷曲更嚴重（圖7-C）。同時，在高鹽處理后，OsHsfA2b-OX 植株中OsSOD 和OsCAT 的表達量顯著高于NPB，OsHsfA2b-RNAi 植株中的這兩個基因表達量比NPB 總體降低（圖7-D-E）。上述結果說明，OsHsfA2b 可能通過抗氧化途徑正調控水稻對高鹽脅迫的抗性。

圖7 高鹽脅迫下轉基因植株的表型和OsHsfA2b 的表達Fig.7 Phenotypes and OsHsfA2b expressions of transgenic plants under high salt stress

3 討論

目前，A 類HSFs 在多種植物應激反應中發揮著重要作用，而其功能研究主要集中在調控植物應答高溫脅迫信號。如番茄、擬南芥、水稻HsfA2 是熱脅迫下最容易被誘導的熱激轉錄因子，AtHsfA2 超表達植株能夠增強其基礎耐熱性和獲得耐熱性，而其突變體植株基礎耐熱性和獲得耐熱性均有所降低［22］。同樣地，HSFs 在植物響應低溫脅迫反應中也扮演重要的角色。如，OsHSFC1a/C1b/C2a/C2b 和OsHSFA4d/A7/A9 在經4℃低溫處理后表達量顯著上調［23］。OsHsfA2b 作為A 類HSF，在水稻抗逆性研究上尚未被明確報道，本研究發現OsHsfA2b 能被高溫和低溫脅迫誘導表達，且OsHsfA2b 正調控水稻對高溫脅迫和低溫脅迫的抗性，因此，OsHsfA2b 可作為優良基因資源在水稻育種中用于抵御極端溫度脅迫。

有研究表明，A 類HSFs 在植物抗旱中發揮正調控因子的作用，如水稻OsHsfA7 能顯著提高植株抗旱性［24］。OsHsfA2b 與OsHsfA7 功能類似，能被干旱脅迫誘導表達，并且OsHsfA2b 也能正調控水稻對干旱脅迫的抗性。同樣地，HSFs 也在植物高鹽脅迫中發揮調控功能，如擬南芥部分HSFs 基因在高鹽脅迫時表達量顯著升高，其中，AtHsfA6a 受高鹽脅迫后表達量高出對照100 多倍［18］。同樣，當在擬南芥中過表達小麥TaHsfA2d 后，用高鹽脅迫處理植株發現，TaHsfA2d 過表達植株的種子發芽率明顯高于野生型，表明TaHsfA2d 在調控植物鹽脅迫響應中發揮重要作用［25］。本研究也發現，OsHsfA2b-OX 植株在高鹽環境條件下，比NPB 和OsHsfA2b-RNAi 幼苗的長勢更好，根系更發達，而OsHsfA2b-OX 幼苗發達的根系能幫助水稻在逆境脅迫中更加穩定地吸收水分和養分，保證其正常的生理代謝，并更好地感知和傳遞逆境脅迫信號。

當植物遭受極端溫度、干旱和高鹽等非生物脅迫時，細胞內ROS 含量會快速增加，而植物體內ROS 過量積累會損傷細胞，甚至導致細胞死亡，嚴重影響植物生長［26］。在這些逆境脅迫下，活性氧清除基因可被誘導，進而清除過量活性氧以達到動態平衡減輕非生物脅迫誘導的活性氧過量積累產生的有害影響。例如，HSFA2 在非生物脅迫環境中可誘導擬南芥中清除ROS 的APX1 和APX2 的表達進而促進過度積累的ROS 的清除［27］。本研究發現，高溫脅迫條件下，OsHsfA2b-OX 轉基因植株中的ROS含量明顯比野生型低，且在極端溫度、干旱和高鹽處理后的OsHsfA2b-OX 轉基因植株中，抗氧化途徑相關基因OsSOD 和OsCAT 的表達量都顯著上調，說明OsHsfA2b 通過抗氧化途徑來提高水稻對非生物脅迫的耐受性。在不同的逆境脅迫中，植物熱激轉錄因子除自身會有表達水平的變化外，會調控與逆境脅迫響應相關基因的表達，從而幫助植物抵抗逆境脅迫以維持正常的生命活動。目前對OsHsfA2b 調控哪些逆境脅迫相關的靶標基因來幫助植物抵抗逆境脅迫還有待進一步探究。

4 結論

在非生物脅迫條件下，水稻熱激轉錄因子OsHsfA2b 能夠被誘導表達，且過量表達OsHsfA2b 能明顯增強水稻植株的抗逆性，提高存活率。此外，在逆境脅迫下，OsHsfA2b 能夠誘導抗氧化途徑相關基因的表達，抑制水稻體內活性氧的積累，從而減弱逆境脅迫誘導的活性氧大量積累對植株的傷害。OsHsfA2b 可通過抗氧化途徑正調控水稻對逆境脅迫的抗性。