脂多糖對氣道上皮細胞損傷后炎性因子的影響

支文冰，姜盛楠，孫婷婷，王春柳，宗時宇，陳靜，李曄，劉洋*，張紅*（.陜西省中醫(yī)藥研究院（陜西省中醫(yī)醫(yī)院），西安 7006；.陜西中醫(yī)藥大學藥學院，陜西 咸陽 7446）

支氣管哮喘簡稱哮喘，是由多種免疫細胞和細胞組分參與的以氣道慢性炎癥為特征異質(zhì)性疾病，臨床表現(xiàn)咳喘、呼吸短促、胸悶和呼吸困難等[1]。2022年《全球哮喘防治創(chuàng)議》GINA提出世界哮喘日的主題為“消除差距，實現(xiàn)哮喘的同質(zhì)管理”，流行病學調(diào)研發(fā)現(xiàn)全球哮喘病患者已達3億人，其中我國的哮喘病患者約有4570萬[2]。哮喘歷經(jīng)氣道上皮損傷、黏液高分泌、氣道炎性浸潤和氣道平滑肌增生等病理進程，但哮喘作為一種多因素誘導的復雜性疾病，其發(fā)病機制目前尚未闡明[3]。

氣道上皮細胞作為呼吸道的第一屏障，可視為哮喘病理改變的起點。過敏原和PM2.5等環(huán)境因子作用于氣道上皮，氣道上皮細胞在外界因子刺激下均可發(fā)生炎性病變，釋放多種炎性因子，包括白細胞介素（IL）-13（IL-13）、IL-33和胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）等，大量的炎性因子累積加速了氣道上皮細胞凋亡，打破了氣道上皮屏障的完整性[4-5]。通過文獻檢索發(fā)現(xiàn)，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作為氣道上皮細胞損傷的刺激劑，可誘導氣道上皮細胞發(fā)生炎癥、自噬和凋亡等，進而構(gòu)建多種體外細胞模型，模擬哮喘發(fā)病過程中的上皮損傷，揭示上皮損傷機制及藥物作用機制[6-7]。但LPS作用于氣道后，細胞因子的種類和水平如何變化，目前尚未有系統(tǒng)研究。此外，在文獻檢索過程中我們發(fā)現(xiàn)，LPS誘導的氣道上皮細胞模型評估相對匱乏，且誘導時間不固定。因此，綜合時間效應和LPS刺激后的多種因子效應，本課題進行了系統(tǒng)研究，以期為揭示上皮細胞受損后細胞因子水平的改變及哮喘機制研究提供更多的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 細胞

人氣道上皮細胞（BEAS-2B，ACTT中國細胞資源庫）。

1.2 試藥與儀器

LPS（純度≥98%，貨號 551064，Sigma生物試劑公司）；IL-1β、IL-8、IL-6、TSLP、IL-13、IL-33、IL-17和單核細胞趨化蛋白1（MCP-1） ELISA試劑盒（伊萊瑞特生物試劑有限公司）；一氧化氮（NO）檢測試劑盒（普利萊生物試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

將細胞以1×105個/孔接種于24孔板中，細胞貼壁后將孔板分為8組，每組設置3個復孔，分為不同時間的空白組和LPS刺激組；吸棄24孔板培養(yǎng)上清液，空白組加入500 μL無血清培養(yǎng)基，LPS組加入500 μL LPS刺激劑（終質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1），于刺激后3、6、12和24 h分別收集細胞上清液。嚴格按照實驗操作說明書，進行樣品和標準品孵育、漂洗；生物化抗體孵育、漂洗；HRP酶孵育，漂洗和顯色處理，于450 nm處采用全波長酶標儀檢測每個孔的OD值，根據(jù)標準曲線計算樣本的濃度。采用硝酸還原酶法測定細胞上清中NO的水平，按照試劑盒說明書配制標準品溶液，加入樣品、標準品，而實驗各孔加入Griess試劑，室溫避光孵育5 min，于540 nm處測定OD值，建立標準曲線，根據(jù)標準曲線計算樣本的濃度。

結(jié)果如圖1所示，與空白組比較，LPS刺激氣道上皮細胞中炎癥因子IL-1β、TSLP、IL-13、IL-33和NO水平無顯著差異；且LPS作用氣道上皮細胞后3、6、12和24 h，細胞上清液中IL-1β、TSLP、IL-13、IL-33和NO的分泌始終與空白組相似，均維持在較低的水平。與空白組比較，LPS作用氣道上皮細胞后3、6、12和24 h，氣道上皮細胞中炎癥因子IL-8、IL-6、IL-17和 MCP-1分泌均顯著增加（P＜0.01）；且LPS刺激6 h，氣道上皮細胞分泌的IL-8和MCP-1水平最高。此外，隨著LPS刺激時間的增加，氣道上皮細胞分泌的IL-6和IL-17水平也隨之增加，24 h的刺激時間下，IL-6和IL-17的分泌增加最明顯。

圖1 LPS對氣道上皮細胞IL-1β、TSLP、IL-13、IL-33、NO、IL-8、IL-6、IL-17和 MCP-1分泌的影響Fig 1 Effect of LPS on secretion of IL-1β，TSLP，IL-13，IL-33，NO，IL-8，IL-6，IL-17 and MCP-1 by airway epithelial cells

3 討論

哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，患者可發(fā)生間斷的小氣道阻塞，氣道上皮細胞是氣道炎癥反應的起點，是肺部炎癥-免疫調(diào)節(jié)的第一道防線[8]。屋塵螨、PM2.5、卵清蛋白、花粉和真菌均能引起氣道的炎癥反應，其中LPS作為一種內(nèi)毒素，常作為免疫細胞和非免疫細胞炎性病變的誘導劑，可引起氣道上皮細胞損傷，誘發(fā)炎癥級聯(lián)反應[9-10]。本實驗采用LPS作用于人氣道上皮細胞，發(fā)現(xiàn)LPS可促進BEAS-2B細胞中IL-8、IL-6、IL-17和MCP-1分泌，且刺激時間3、6、24 h均能使其水平顯著增加；但對于IL-1β、TSLP、IL-13、IL-33和NO水平無刺激作用。

在氣道上皮細胞中，LPS作為革蘭氏陰性菌細胞壁中的一種成分，能夠誘導宿主免疫應答并產(chǎn)生多種細胞因子，可通過激活細胞表面的Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4），核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB），絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3 kinase，PI3K）等信號通路，促進多種炎性因子的釋放[10-11]。IL-6和IL-8是常見的趨化因子，具有趨化中性粒細胞、級聯(lián)擴大炎癥反應的作用；在哮喘患者中，中性粒細胞型哮喘占比較大，由于產(chǎn)生過量的細胞外支架中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)，臨床較難醫(yī)治[12]。既往研究發(fā)現(xiàn)，C57BL/6哮喘小鼠BALF中炎癥介質(zhì)IL-6和IL-8分泌水平升高，且氣道上皮細胞可能通過旁分泌方式釋放IL-6和IL-8[13]。小白菊內(nèi)酯通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路抑制氣道上皮細胞中IL-8的分泌[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS可顯著刺激BEAS-2B細胞中IL-6和IL-8的分泌，但LPS刺激達峰時間不一致；因此，在哮喘機制的研究中，可以通過LPS誘導的BEAS-2B細胞損傷模型探究與IL-6和IL-8相關的發(fā)病機制。

MCP-1是趨化因子亞家族成員之一，其水平在哮喘患者外周血中升高，且與哮喘合并呼吸道感染相關[15-16]。孟魯司特聯(lián)合復可托或酮替芬可減輕急性發(fā)病期哮喘患者血清中MCP-1水平，進而發(fā)揮抗哮喘作用[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS顯著增加了氣道上皮細胞MCP-1的分泌，且在刺激6 h后達峰，提示LPS刺激氣道上皮細胞損傷早期可釋放大量MCP-1類趨化因子，促進血液中粒細胞及單核細胞向氣道內(nèi)轉(zhuǎn)移，加速氣道炎癥反應。IL-17與中性粒細胞性哮喘緊密相關，可促進杯狀細胞增殖、分泌黏液和氣道平滑肌增生，于多個環(huán)節(jié)加速哮喘病變[19]。以往IL-17與哮喘的關系研究多集中在患者血清水平、大鼠血清水平、中性粒細胞及平滑肌細胞水平，鮮少涉及氣道上皮細胞，本研究發(fā)現(xiàn)LPS刺激氣道上皮細胞后，IL-17的水平不斷增加，在哮喘發(fā)病進程中，氣道上皮細胞也是IL-17分泌的重要途徑。

IL-13主要由Th2型細胞產(chǎn)生，可誘導單核細胞分化、B細胞增殖及合成IgE類抗體，從而促進炎癥-免疫應答[20]。本研究發(fā)現(xiàn)LPS刺激BEAS-2B細胞3、6和24 h，細胞上清液中IL-13的分泌維持在較低的水平，無顯著性改變，該結(jié)果提示BEAS-2B細胞鮮少分泌IL-13，但研究發(fā)現(xiàn)IL-13可誘導氣道上皮細胞凋亡和黏液高分泌[21-22]。TSLP通過激活樹突狀細胞功能加快抗原傳遞，進而破壞Th1細胞和Th2細胞的分化平衡，調(diào)節(jié)因子IL-5和IL-10的水平。研究發(fā)現(xiàn)哮喘氣道炎癥的嚴重程度與TSLP的表達水平成正相關[23]。本研究發(fā)現(xiàn)LPS不能刺激BEAS-2B分泌大量的TSLP。高水平NO為氣道炎癥生物標志物，對于老年哮喘患者有輔助診斷價值[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導的氣道上皮細胞炎癥損傷并不能使NO水平升高，針對呼出氣NO較高的哮喘患者，在藥物篩選和發(fā)病機制研究時，LPS刺激的BEAS-2B損傷模型可能不能作為細胞研究模型。

IL-1β和IL-33同屬IL-1亞族，均屬于促炎性細胞因子[25]；IL-1β主要在炎性損傷中由單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，少部分可通過上皮細胞分泌[26]；IL-33是一種“雙功能細胞因子”，主要由屏障組織的上皮細胞或內(nèi)皮細胞及免疫細胞分泌，可有效驅(qū)動Th2細胞產(chǎn)生IL-4、IL-5和IL-13，刺激巨噬細胞的M2極化，加速粒細胞和肥大細胞募集，誘發(fā)過敏性哮喘[27]。研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者和哮喘小鼠血清中IL-33和IL-1β水平顯著升高[28]，但本研究發(fā)現(xiàn)LPS作用于氣道上皮細胞BEAS-2B不同的時間均不能引起細胞上清液中IL-33和IL-1β水平增加，該研究結(jié)果說明針對LPS刺激的氣道上皮細胞損傷模型可能不適用于IL-33和IL-1β分泌相關的哮喘機制研究。綜上所述，LPS誘導的BEAS-2B細胞損傷模型，適用于IL-8、IL-6、IL-17和MCP-1分泌相關的調(diào)控機制研究，但對于IL-1β、TSLP、IL-13、IL-33和NO調(diào)節(jié)的反應性較差。