基于片段生長技術的PD-1/PD-L1小分子抑制劑的設計

趙東升，程鋮，廖偉科*（1.貴州醫科大學藥學院，貴陽 550004；.貴州省化學合成藥物研發利用工程技術研究中心，貴陽 550004）

腫瘤細胞在遺傳性以及表觀遺傳性方面與正常細胞差異顯著，能夠被免疫系統有效識別并清除，但腫瘤細胞會運用不同的方式來避開免疫系統的監視。當免疫檢查點分子過度表達或功能過強時，免疫功能將會受到抑制[1]，從而發生“免疫逃逸”的現象，加速腫瘤生長[2]。阻斷免疫檢查點分子的信號傳導成為治療腫瘤的常用方法，其中程序性細胞死亡受體1（PD-1）/程序性細胞死亡-配體1（PD-L1）通路是免疫檢查點中最具臨床價值的靶標之一[3]。PD-1又叫CD279，是一種由272個氨基酸組成的跨膜蛋白[4]。PD-L1又叫CD274，是一種由290個氨基酸組成的跨膜蛋白[5]。PD-1和PD-L1的結合可以抑制T細胞的活性，減少自身免疫反應，防止免疫系統過度反應。在某些情況下，腫瘤細胞會利用這種機制來逃避免疫監視，發生免疫逃逸從而促進腫瘤的生長和擴散[6]。隨著小分子與PD-1/PD-L1晶體復合物的解析，研究者們對于PD-1/PD-L1小分子抑制劑的開發也迎來蓬勃的發展階段，但是目前報道的小分子抑制劑均為聯苯母核結構，且現有化合物臨床試驗最高階段仍處于Ⅰ期臨床。因此，開發出結構多樣性且安全有效的PD-1/PD-L1小分子抑制劑具有十分重要的意義。

藥物的從頭設計是一種不僅可以提出新型化學結構，并且能夠滿足所需靶點結構特征的方法，這一方法隨著計算機輔助藥物設計的發展也逐漸受到眾多藥物化學家們的青睞[7]。相比虛擬篩選，藥物的從頭設計可以在分子片段生成的方式上尋找到特定性質的全新結構分子，在保留原有片段的基礎上實現分子結構多樣性[8]。此前有報道幾種包含苯甲酰苯胺骨架的新型小分子，如圖1所示，這類分子不僅具有新穎的骨架結構，也表現出良好的體內外抑瘤活性[9-11]。為了保持新型的苯甲酰苯胺linker，本研究采用片段生長的從頭設計方法，以苯甲酰苯胺作為初始片段，將FDA化合物庫拆分為碎片，并在初始片段各位點迭代生長，進一步將這一包含苯甲酰苯胺的數據庫作為對接篩選的對象，以期獲取潛在的PD-1/PD-L1小分子抑制劑。

圖1 4種苯甲酰苯胺骨架化合物Fig 1 Four benzanilide skeleton compound

1 材料與方法

1.1 平臺與軟件

本研究所有計算內容均在北京并行超級計算中心平臺完成。

MolAICal軟件用于片段庫的準備和片段生長[12]；AutoDock Vina軟件用于分子對接；AutoDock Tools軟件用來重置蛋白力場及原子類型；Pymol軟件用來進行可視化結果分析[13]；Amber16軟件用來執行分子動力學模擬；Open Babel軟件用來作為格式間轉換。

1.2 數據庫準備

從RCSB PDB（https：//www.rcsb.org/）蛋白數據庫獲取PD-L1蛋白（PDB ID：6r3k），使用AutoDock Tools程序對其添加極性氫并合并非極性氫，刪除A、B兩條鏈并刪除水和溶劑分子，保存為pdbqt格式作為片段生長和分子對接的蛋白受體。從FDA官網獲取FDA分子庫，使用Open Babel軟件將其轉換為smi格式并打碎為片段，建立FDA碎片庫。

1.3 片段生長

使用AutoDock Vina將苯甲酰胺片段對接進入PD-L1蛋白中，確定其初始構象，將其各含氫鍵的原子定義為生長位點，以FDA碎片庫作為生長來源，生長范圍設定為30 ?×30 ?×30 ?，允許產生的新分子被迭代并且迭代次數為10。在迭代過程中，合成可行性較低的分子和相對分子量低于300、高于1000的分子即舍棄。產生的新分子根據打分進行排序。

1.4 分子對接篩選

將片段生長建立的分子庫作為篩選的來源，PD-L1二聚體作為受體蛋白，每個小分子生成10個構象，exhaustiveness設置為8，結合位點坐標為x＝-7.118，y＝59.347，z＝-19.516。使用AutoDock Vina提交作業，保留打分靠前的分子。

1.5 分子動力學模擬

將分子對接的結果作為分子動力學模擬的初始構象。然后對所有備選分子施加氫原子并進行去質子化。將小分子用Amber軟件中的antechamber程序施加bcc電荷和gaff2力場，并使用parmchk程序檢查該小分子是否還需要輔助力場參數。創建一個距離蛋白質10 ?的溶劑立方體盒（cubic box），盒內填充tip3p水模型，向配體-受體-溶劑體系中添加4個鈉離子以保持電中性。通過周期性邊界條件（PBC）消除邊界效應。使各種組分的能量最優化，其中蛋白質、配體和抗衡離子的限制電位受到419 kJ/mol?2的力常數約束，水分子能級分布通過系統最小化調整以穩定其狀態，同時進一步最小化系統能量，蛋白和配體均成為另一組419 kJ/mol?2的力常數所約束。蛋白的骨架設有83.8 kJ/mol?2的力常數限制，并且只允許側鏈在進行能量最小化時放松。釋放整個系統受到的限制并最大程度地降低其能量。體系能量優化之后，在200 ps的等溫和等壓條件下，從10 K加熱到300 K，并在400 ps的平衡狀態模擬過程中進行NPT系綜：等溫等壓系綜模擬。最后約束與氫原子相連的化學鍵并進行動力學模擬，模擬積分步長設定為2 fs。

1.6 MM/GBSA結合自由能計算

結合自由能和每個殘基的分解自由能用Amber16中鑲嵌的MM/GBSA.py腳本計算。在MM/GBSA方法中，配體與蛋白質受體結合形成絡合物的自由能可以用以下公式表示[14-15]：

ΔGbind＝ΔGcomplex-ΔGreceptor-ΔGligand＝ΔEinternal＋ΔEVDW＋ΔEelec＋ΔGGB＋ΔGSA

其中，ΔEVDW表示范德華相互作用，ΔEinternal表示內能，ΔEelec表示靜電作用，ΔGGB和ΔGSA表示溶劑化自由能和非極性溶劑自由能。

1.7 PD-1/PD-L1阻斷實驗

通過均相時間分辨熒光（HTRF）實驗進一步測定受試化合物的IC50值。使用PD-1/PD-L1試劑盒（Cisbio公司），根據說明書操作：將抑制劑在二甲基亞砜（DMSO）中稀釋，然后用緩沖液連續稀釋到特定的濃度梯度（2.4～120 000 nmol·L-1），在12孔板上各加2 μL緩沖液，再加入4 μL Tag1-Pd-L1溶液、4 μL Tag2-Pd-1。在室溫下孵育15 min后，加入10 μL的anti-Tag1-Eu3＋和anti-Tag2-XL665。將板密封并在室溫下孵育2 h，用Envision讀取測試孔的信號值[16]。

2 結果與討論

2.1 片段生長

本研究的工作流程如圖2所示，以苯甲酰胺的初始片段經過迭代后獲取了3891個分子，依據各分子與結合口袋的相互作用以及合成可行性保留排名前1000的分子進一步作為虛擬篩選的數據庫來源；經過AutoDock Vina對接打分后，保留打分最高的前8個分子（結構如圖3所示，打分如表1所示），參照結合模式最終選取3個分子進行分子動力學模擬并計算其MM/GBSA結合自由能，最終購買一個分子進行體外活性驗證。

表1 8個化合物對接打分(kJ·mol-1)Tab 1 Docking scoring of 8 compounds (kJ·mol-1)

圖2 抑制劑的發現流程Fig 2 Discovery process of inhibitors

圖3 8個候選化合物結構Fig 3 Structure of 8 candidate compounds

2.2 結合模式分析

8個候選分子的結合模式如圖4所示。其中776191、J170、123641這3個具有更突出的結合模式。776191分子表現出最高的打分結果為-50.996 kJ·mol-1，并且與PD-L1形成非常豐富的氫鍵作用。可以看出，該分子與PD-L1二聚體蛋白C鏈上的66位谷氨酰胺，121位丙氨酸，D鏈上125位的精氨酸，123位的蘇氨酸，19位的苯丙氨酸，121位的丙氨酸，115位的甲硫氨酸共形成九根氫鍵相互作用，這些氫鍵將776191分子鉚定在PD-L1二聚體蛋白構成的結合口袋里，展示了良好的結合作用。J170分子不僅與PD-L1蛋白C鏈的56位酪氨酸形成π-π堆積作用，還與C鏈的115位甲硫氨酸，121位丙氨酸，123位酪氨酸，D鏈的20位酪氨酸，54位異亮氨酸，56位酪氨酸，121位丙氨酸，123位酪氨酸形成疏水作用力，這些范德華作用驅動J170更傾向進入到蛋白的疏水空腔。123641分子與PD-L1蛋白也擁有良好的疏水作用，并且還與C鏈的56位酪氨酸，122位天冬氨酸，D鏈的123位酪氨酸，125位精氨酸形成氫鍵作用，此外123641還與C鏈的56位酪氨酸形成π-π堆積作用。

圖4 8個分子的結合模式Fig 4 Binding mode of 8 molecules

2.3 結合自由能計算

為了更精確地了解776191、J170、123641這3個分子的能量表現，本研究對其進行了MM/GBSA的自由能計算，能量越低說明小分子與蛋白的復合物體系結合越強，結果如表2所示。可見776191表現出最低的結合自由能為-271.831 kJ·mol-1，其中范德華作用占據主導作用力為-362.720 kJ·mol-1，此外還具有-123.165 kJ·mol-1靜電作用提供的能量。在J170和123641兩個分子上同樣也是范德華占據主導作用，靜電作用力為次要作用，而極性溶劑化作用則大大地阻礙了復合物的結合。這一結果證明3個分子均是在疏水作用驅動下與PD-L1蛋白發生緊密結合。

表2 3個化合物的結合自由能(kJ·mol-1)Tab 2 Binding free energy of 3 compounds (kJ·mol-1)

2.4 分子動力學軌跡分析

由于776191具有較高的結合自由能，將其作為研究對象進行動力學軌跡分析。如圖5所示，綠色代表776191分子，紅色代表受體蛋白PDL1，黑色代表776191-PD-L1復合物體系。可以看出，在為期100 ns時長的生理環境模擬過程中，776191小分子表現出一定的波動，但波動幅度維持在3 ?左右，相對比于PD-L1受體蛋白可以看出，小分子的加入并未引起蛋白本身發生較大的波動。鑒于776191分子本身的結構特征，其包含較多的可旋轉鍵，不可避免地在運動過程中某些時刻發生鍵角的扭轉。因此可以認為776191分子在模擬的運動過程中維持著一定的平穩性。

2.5 PD-1/PD-L1阻斷實驗

經過上述實驗最終確定了776191分子是最具有潛力的PD-L1小分子抑制劑，進一步通過HTRF實驗測定其體外PD-1/PD-L1抑制活性，如圖6所示，776191表現出中等的抑制活性，IC50為92 μmol·L-1。

圖6 HTRF法測定化合物776191的IC50Fig 6 IC50 determination of compound 776191 based HTRF assay

3 討論

PD-L1小分子抑制劑結構多樣性的缺乏始終是阻礙其臨床發展的一大挑戰。本項研究通過確立一個新穎的苯甲酰苯胺片段，使用從頭設計的思路和片段生長的方法最終確證776191分子是一個具有一定PD-L1抑制活性的小分子抑制劑。

776191具有新穎的骨架結構，然而其IC50為92 μmol·L-1的表現并沒有非常出色，這可能是由于以下原因引起：① 776191分子具有較多的氫鍵受體和可旋轉鍵，這可能造成極性溶劑對其結合能表現出214.702 kJ·mol-1的抑制作用；② 776191的溶解性存在一定的不足，這可能是影響其活性表現的直接原因。鑒于上述兩種原因，對776191在結構上進一步精簡優化將可能獲得活性更加良好的分子，本研究為改造安全有效的PD-1/PD-L1小分子抑制劑奠定了理論基礎。